Name: GPC3-targeting 双特异性抗体, GPC3-S-Fab, 具有强大的细胞毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 了解如何在Escherichia coli中生产GPC3-S-Fab双特异性抗体，并评估其对GPC3阳性肝癌细胞的细胞毒性。该方法简化了抗体的纯化流程，为癌症免疫治疗研究提供了可靠的技术方案。

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本工作由R提供资金支持&amp;中国广东省“&D计划”（2016A050503028）

所有涉及人体血液采集的程序均经中山大学伦理委员会批准。
1. GPC3-S-Fab 设计策略
<ol>
	<li>通过将抗GPC3的Fab片段（人源化GC3313）与抗CD16的VHH14连接，设计GPC3-S-Fab（图1）。</li>
	<li>按照先前报道的方法12，合成并将VH-CH1-CD16-VHH和VL-CL克隆至pET26b和pET21a载体中。</li>
</ol>
2. 转化与培养
<ol>
	<li>加入100 ng含有VH-CH1-CD16的pET26b质粒图1A）以及含有 VL-CL 的 pET21a 100 ng（图1A)加入100 µL感受态BL21 (DE3)细胞中，充分混匀，冰上孵育30分钟。42 °C水浴孵育45 - 90秒，转移至冰上孵育3 - 5分钟。</li>
	<li>加入500 µL的LB（Lysogeny Broth）培养基至含有BL21 (DE3)细胞的离心管中，随后在37 °C、150 rpm条件下振荡培养45–60分钟。取100 µL BL21 (DE3)细胞涂布于含有50 µg/mL 卡那霉素 和 100 µg/mL 的 氨苄青霉素，然后在 37 °C 下孵育 12 - 16 小时。
	<ol>
		<li>制备LB（Lysogeny Broth）培养基：1% wt/vol 胰蛋白胨，0.5% wt/vol 酵母提取物，1% wt/vol NaCl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从单个菌落中接种细胞至5 mL含有50 µg/mL的超级肉汤（SB）培养基中 卡那霉素 和 100 µg/mL 的 氨苄青霉素，于37 °C、220 rpm条件下过夜培养。然后，将1 mL培养物接种至100 mL含有50 µg/mL 卡那霉素 100 µg/mL 氨苄青霉素 并在37 °C、220 rpm条件下培养4小时。然后，将10 mL培养物转移至含有50 µg/mL 卡那霉素 和 100 µg/mL 的 氨苄青霉素 并在37 °C、220 rpm条件下培养。
	<ol>
		<li>制备超级肉汤培养基：3.2%（wt/vol）胰蛋白胨，2%（wt/vol）酵母提取物，0.5%（wt/vol）NaCl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当 OD600 当菌液浓度达到0.6 - 0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），使其终浓度为0.2 mM。在16 °C、180 rpm条件下培养36 - 48小时，以实现周质表达。</li>
</ol>
3. GPC3-S-Fab 周质提取物纯化
<ol>
	<li>周质组分的制备
	<ol>
		<li>在 4,000 × g、4 °C 条件下离心 30 分钟收集细胞，弃去培养基，并称量细胞重量。</li>
		<li>每克细胞用 4 mL 冰冷的蔗糖溶液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5；25%（wt/vol）蔗糖和 1 mM EDTA）充分重悬细胞，并在冰上孵育 15 分钟。</li>
		<li>在 8,500 × g（台式离心机，固定角转子）、4 °C 条件下离心 20 分钟。移去上清液（蔗糖组分），并将其保存在冰上。</li>
		<li>将沉淀用冰冷的 5 mM MgCl2 和 1 mM PMSF 混合液（每克细胞 4 mL）重悬。每克细胞加入 40 µL 溶菌酶储备液（15 mg/mL），并在冰上孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 8,500 × g（台式离心机，固定角转子）、4 °C 条件下离心 20 分钟。转移上清液（周质组分）并保存在冰上。</li>
		<li>合并蔗糖组分和周质组分，在 30,000 × g、4 °C 条件下离心 30 分钟。弃去上清液，并将沉淀保存于冰上的 50 mL 锥形管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ni-NTA 亲和纯化
	<ol>
		<li>充分混匀 1 mL Ni-NTA 琼脂糖，使其形成均匀悬浮液，取 1 mL Ni-NTA 琼脂糖转移至新的 15 mL 锥形管中，并加入 10 柱体积（CV）平衡缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH 7.5；1 M NaCl）进行平衡。</li>
		<li>在 400 × g 条件下离心 5 分钟，小心弃去上清液。然后将 Ni-NTA 琼脂糖加入含有蔗糖组分和周质组分的 50 mL 管中，在 4 °C 条件下轻轻摇动孵育 2 小时。</li>
		<li>将混合物在 400 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。小心将上清液转移至另一新的预冷冰上试管中作为未结合组分。将 Ni-NTA 琼脂糖转移至重力柱中。</li>
		<li>向柱中加入 10 CV 洗涤缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH 7.5；1 M NaCl；20 mM、30 mM 或 40 mM 咪唑），收集流出液作为洗涤组分。 
		注意：这些溶液应按咪唑浓度递增的顺序依次加入。</li>
		<li>向柱中加入 3 CV 洗脱缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH 7.5；300 mM NaCl；100 mM、200 mM、300 mM 或 400 mM 咪唑），收集洗脱液作为洗脱组分 1、2、3 和 4。 
		注意：这些溶液应按咪唑浓度递增的顺序依次加入。</li>
		<li>使用透析袋（12.4 kDa）在 2 L PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，pH 7.4）中于 4 °C 透析 2 小时。通过 12% SDS-PAGE 检测 GPC3-S-Fab 的存在，随后进行考马斯亮蓝染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>IgG-CH1 亲和纯化
	<ol>
		<li>将 1 mL IgG-CH1 亲和树脂转移至 50 mL 锥形管中，先用 PBS 洗涤树脂珠。然后加入步骤 3.2.6 后获得的透析溶液，在 4 °C 条件下轻轻摇动孵育 2 小时。</li>
		<li>在 400 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。小心将上清液转移至另一新的预冷冰上试管中，并将树脂转移至重力柱中。</li>
		<li>向柱中加入 10 CV 洗涤缓冲液（PBS），收集洗脱液作为洗涤组分。</li>
		<li>在收集管中预先加入 1 M Tris（pH 9.0）（每毫升洗脱组分加 0.1 mL）。用 3 CV 洗脱缓冲液（0.1 M 甘氨酸-HCl，pH 2.7）洗脱，收集洗脱组分；重复 3 次。</li>
		<li>使用透析袋（12.4 kDa）在 2 L PBS 中于 4 °C 透析 2 小时，重复两次。</li>
		<li>使用超微量分光光度计测定蛋白浓度（摩尔消光系数：91105。1 A280&#160; = 0.69 mg/L）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>取10 µL样品加入5x SDS上样缓冲液中，充分混匀。将蛋白质混合物在100 °C下煮沸5分钟。
	<ol>
		<li>配制5x SDS上样缓冲液：250 mM Tris-HCl（pH 6.8）、10% wt/vol SDS、0.5% wt/vol 溴酚蓝、50% vol/vol 甘油、5% vol/vol β-巯基乙醇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前描述的方法制备SDS-PAGE凝胶，包含浓缩胶（5%）和分离胶（12%）26,27,28。</li>
	<li>上样10 µL煮沸后的蛋白质混合物及蛋白质Marker，进行SDS-PAGE电泳。</li>
	<li>用考马斯亮蓝染色液振荡染色20分钟，随后进行脱色。</li>
	<li>进行Western blotting时，将蛋白转移至PVDF膜后，用TBST（20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% vol/vol Tween 20）加5% wt/vol脱脂奶粉在室温下振荡封闭1小时。</li>
	<li>将膜与一抗（抗His或抗Flag抗体）在TBST + 5%脱脂奶粉中按1:2,000稀释，室温孵育1小时。</li>
	<li>用TBST在室温下洗涤5分钟，重复3次。</li>
	<li>将膜与二抗（HRP标记的抗小鼠Fc抗体）在TBST + 5%脱脂奶粉中按1:2,000稀释，室温孵育1小时。</li>
	<li>用TBST在室温下洗涤5分钟，重复3次。</li>
	<li>每张膜加入1 mL HRP底物，显影并采集图像。</li>
</ol>
5. 凝胶过滤分析
<ol>
	<li>使用以下色谱柱参数：柱体积 24 mL；平衡缓冲液为 pH 7.4 的 PBS；室温下流速为 0.5 mL/min；上样体积为 200 µL。</li>
	<li>使用以下蛋白体积和浓度：500 µL 浓度为 1.2 mg/mL 的 GPC3-S-Fab。在 20,000 × g 下离心 30 分钟，取 200 µL 上样。</li>
	<li>蛋白分子量标准品的体积和浓度如下：取细胞色素 C（2 mg/mL，12.4 kDa）100 µL、碳酸酐酶（3 mg/mL，29 kDa）140 µL、白蛋白（10 mg/mL，66 kDa）140 µL 和乙醇脱氢酶（5 mg/mL，150 kDa）200 µL 混合于同一管中。在 20,000 × g 下离心 30 分钟，取 200 µL 上样。</li>
	<li>每次运行前，以 0.5 mL/min 的流速用至少 2 个柱体积的蒸馏水冲洗。</li>
	<li>以 0.5 mL/min 的流速，用至少 2 个柱体积的平衡缓冲液（PBS，pH 7.4）对色谱柱进行平衡。</li>
	<li>以 0.5 mL/min 的流速自动进样以加载样品。</li>
	<li>用平衡缓冲液以 0.5 mL/min 的流速洗脱，并在 280 nm 和 215 nm 处检测。</li>
</ol>
6. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>将 HepG2（GPC3 阳性）、Hep3B（GPC3 阳性）、Huh7（GPC3 阳性）和 MHCC-97H（GPC3 阴性）细胞培养于含有 DMEM 培养基、10% 胎牛血清（FBS）、青霉素（100 µg/mL）和链霉素（50 µg/mL）的 100 mm × 20 mm 塑料培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
	<li>将 CHO（GPC3 阴性）细胞和携带全长人源 GPC3 cDNA（GPC3 阳性）的 CHO/GPC3 细胞培养于含有 RPMI 1640 培养基、10% FBS、青霉素（100 µg/mL）和链霉素（50 µg/mL）的 100 mm × 20 mm 塑料培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
	<li>将携带全长人源 CD16 cDNA（CD16 阳性）的 NK92/CD16 细胞培养于含有 RPMI 1640 培养基、10% FBS、青霉素（100 µg/mL）和链霉素（50 µg/mL）的 25 cm2 培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
	<li>当细胞融合度达到 70–90% 时，弃去培养基，用 2 mL PBS 洗涤细胞。加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 2–3 分钟（或直至细胞开始从表面脱落）。加入 1 mL 完全培养基以中和胰蛋白酶，并通过轻柔吹打重悬细胞。</li>
	<li>使用 Neubauer 血细胞计数板计数细胞数量，并用台盼蓝检测细胞活力。</li>
	<li>每种细胞系收集 3 × 106 个细胞。加入 1 mL PBS + 0.2% BSA 重悬细胞，于 200 × g、4 °C 离心 5 分钟，重复两次。</li>
	<li>加入 0.3 mL PBS + 0.2% BSA 重悬细胞，将 100 µL（约一百万个细胞）转移至每个 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。 
	注意：从本步骤开始至后续所有操作均需保持低温，置于冰上。当抗体与细胞表面抗原结合后，复合物将开始内化；保持低温可显著减缓该过程。</li>
	<li>向每管中加入 10 µL 一抗（GPC3-S-Fab 或人 IgG1，终浓度为 5 µg/mL），冰上孵育 1 小时。</li>
	<li>加入 1 mL PBS + 0.2% BSA 洗涤，于 200 × g、4 °C 离心 5 分钟，重复三次。</li>
	<li>用 100 µL PBS + 0.2% BSA 重悬细胞，然后加入 0.5 µL 二抗（抗人 IgG(H+L)-488，终浓度为 10 µg/mL），冰上孵育 1 小时。注意：从本步骤开始，请避免光照细胞。</li>
	<li>加入 1 mL PBS + 0.2% BSA 洗涤，于 200 × g、4 °C 离心 5 分钟，重复三次。</li>
	<li>根据标准操作流程29 使用流式细胞仪分析细胞。使用 488 nm 激光激发检测细胞。</li>
</ol>
7. 细胞毒性检测
<ol>
	<li>准备肿瘤细胞。
	<ol>
		<li>按照步骤 6.1 - 6.5 所述方法培养 HepG2、Hep3B、Huh7、MHCC-97H 和 CHO 细胞系。</li>
		<li>将细胞稀释至 0.5 × 105/mL，每孔加入 100 µL 细胞悬液（每孔 5,000 个细胞）至 96 孔板中。培养 6 - 8 小时，使细胞贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备人外周血单个核细胞（PBMCs）。
	<ol>
		<li>在 50 mL 锥形管中，用等体积的 PBS 稀释新鲜制备的血液。例如，将 10 mL 血液与 10 mL PBS 混合稀释。</li>
		<li>取 15 mL 淋巴细胞分离液加入新的 50 mL 锥形管中，沿管壁缓慢将稀释后的血液叠加至淋巴细胞分离液液面上方。 
		注意：保持试管垂直，避免破坏淋巴细胞分离液的液面。</li>
		<li>室温下以 400 × g 离心 35 分钟，关闭刹车。</li>
		<li>缓慢吸除上层血浆层，并收集位于血浆与淋巴细胞分离液界面处的白色细胞层（含 PBMCs）。</li>
		<li>用两倍体积的 PBS + 2% FBS 稀释 PBMCs，以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>用 PBS + 2% FBS 洗涤细胞两次，每次以 400 × g 离心 5 分钟。按步骤 6.5 所述方法计数细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备自然杀伤（NK）细胞。
	<ol>
		<li>将 PBMCs 悬浮于 PBS + 2% FBS 中，调整细胞浓度为 5 × 107 个细胞/mL，并转移至 5 mL 聚苯乙烯圆底试管中。</li>
		<li>按每毫升细胞悬液加入 50 µL 的人 NK 细胞富集混合液，充分混匀后室温孵育 10 分钟。</li>
		<li>重悬 NK 细胞富集试剂盒中的磁性颗粒，通过反复吹打至少 5 次使其充分混匀并保持均匀悬浮状态。按每毫升细胞悬液加入 100 µL 重悬后的磁性颗粒，混匀后室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>加入 PBS + 2% FBS 将细胞悬液体积补至 2.5 mL，轻轻吹打 2 - 3 次混匀。将试管（不加盖）放入磁架中，室温静置 2.5 分钟，使磁珠充分沉降。</li>
		<li>移开磁架，一次性将试管倒转，将富集后的细胞悬液倾入新试管中。</li>
		<li>按步骤 6.5 所述方法计数细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立细胞毒反应体系。
	<ol>
		<li>用相应的培养基将 NK 细胞稀释至 5 × 105 个细胞/mL，每孔加入 100 µL NK 细胞悬液至已接种肿瘤细胞的 96 孔板中。</li>
		<li>加入不同浓度的 GPC3-S-Fab，最高浓度为终浓度 30 µg/mL，进行 3 倍梯度稀释，共 9 个浓度点（每个浓度设 3 个复孔），每孔加入 10 µL。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 72 小时。</li>
		<li>孵育 72 小时后，吸除培养基，每孔加入含 10 µL CCK8 试剂的 DMEM 培养基 100 µL，随后置于 37 °C 孵育。</li>
		<li>在加入 CCK8 试剂后的 1、2、3 和 4 小时，于 450 nm 波长处读取吸光度值。</li>
		<li>分析数据。计算细胞存活率：(OD450 GPC3-S-Fab + 效应细胞 + 肿瘤细胞 - OD450 培养基)/(OD450 肿瘤细胞 - OD450 培养基) × 100% 和 (OD450 GPC3-S-Fab + 肿瘤细胞 - OD450 培养基)/(OD450 肿瘤细胞 - OD450 培养基) × 100%。其中效应细胞为 NK 细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究中，我们提出一种构建新型双特异性抗体（bsAbs）GPC3-S-Fab的策略，该抗体可募集自然杀伤细胞（NK细胞）以靶向GPC3阳性肿瘤细胞。S-Fab基于天然Fab结构，通过添加抗CD16的VHH11,12而构建。与含有Fc区的双特异性抗体相比，GPC3-S-Fab可在细菌周质中大规模高效表达。
采用本方案中描述的表达与纯化策略，我们大量获得了可溶且具有功能的 GPC3-S-Fab。为了促进周质表达，在N端添加了信号序列 pelB，以引导蛋白分泌至E. coli17的周质空间。与细胞质相比，位于细胞质膜与外膜之间的周质空间具有更氧化的环境，并含有多种对蛋白质折叠和组装至关重要的蛋白质，因此有助于重组蛋白的正确折叠并提高其可溶性16。然而，E. coli中蛋白质折叠及向周质转运的分子机制容量有限，高水平表达重组蛋白常导致蛋白在周质...

单克隆抗体目前已被广泛用于癌症治疗1。由于抗体具有结构灵活性，多种基于抗体的分子形式正被积极研究。与单克隆抗体相比，双特异性抗体（bsAbs）具有两个不同的抗原结合模块，能够同时识别两种不同的靶点，并有效触发免疫效应细胞的募集，从而靶向并杀伤肿瘤细胞2。
目前的重组双特异性抗体（bsAb）结构通常可分为两类：含Fc区的双特异性抗体和不含Fc区的双特异性抗体。与主要在哺乳动物细胞中表达的含Fc区结构相比，不含Fc区的双特异性抗体具有体积更小、更易于在微生物表达系统中生产以及更有效地穿透肿瘤组织等优势3。
不含Fc区域的双特异性抗体通常通过连接单个结合基团（如单链可变区片段（scFv）或Fab）构成3。由于缺乏稳定结构域，基于scFv片段的双特异性抗体往往热稳定性较差、溶解度低，或更易发生聚集4,5。相比之下，基于Fab的双特异性抗体因天然Fab基团中CH1与CL的异源二聚化作用而具有更高的稳定性4,6。
重链仅可变区抗体（VHHs，也称为单域抗体）是天然重链抗体中具有抗原结合活性的片段7。VHHs 具有高亲和力、高特异性（与传统 IgG 相当）8、低免疫原性以及在细菌表达系统中高产量等特性9。与 Fv 片段相比，VHHs 具有更高的热稳定性10。与 Fab 片段相比，由于缺乏 CH1 和 CL 结构域，VHHs 的分子尺寸更小。因此，通过将 Fab 与单域抗体 VHH 连接而形成的双特异性抗体格式 S-Fab 被设计出来，并对其抗肿瘤效应进行了研究11,12。
本研究描述了通过将hGC33的Fab片段13与抗CD16a的VHH14连接构建GPC3-S-Fab的方法。GPC3-S-Fab可通过在大肠杆菌（Escherichia coli (E. coli)）中进行周质表达高效生产。对GPC3-S-Fab的功能研究表明，该分子是肝癌治疗的一种有前景的策略。因此，相较于其他技术，GPC3-S-Fab具备易于生产与纯化以及双特异性抗体更稳定等优势，并可在相关研究中参考既往文献。
哺乳动物表达系统和原核表达系统已被用于表达多种形式的双特异性抗体（BsAbs）。与哺乳动物表达系统相比，基于E. coli的蛋白表达系统具有多种优势，包括产量高、成本低、节省人力、遗传操作简便以及转化效率高15。在E. coli中表达双特异性抗体时，主要有两种基本策略：在细胞质中表达和在细胞质与外膜之间的周质空间中表达15。与细胞质的还原性环境相比，周质空间具有更氧化的环境，有利于蛋白质的正确折叠和共表达16。正确折叠对于双特异性抗体的溶解性、稳定性及功能形成起着关键作用。因此，在S-Fab的N端添加了pelB信号肽，以引导其分泌至E. coli的周质空间17。为了确保正确的折叠、溶解性、热稳定性及构象稳定性，通常采用简化抗体结构复杂性和减小抗体尺寸的策略16。S-Fab结构包含一个Fab片段和一个VHH片段，由于其结构简单且分子量小，在细菌系统中表达效果良好。
本研究选择了GPC3-S-Fab双特异性抗体形式。磷脂酰肌醇聚糖-3（Glypican-3, GPC3）属于硫酸乙酰肝素（heparin sulfate, HS）蛋白聚糖家族，通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol, GPI）锚定在细胞表面18。在70%的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）病例中可观察到GPC3的过表达，而HCC占原发性肝癌的大多数19,20,21,22。由于GPC3在正常组织中几乎不表达，因此被认为可能是HCC治疗的潜在靶点。已有多种针对GPC3的小鼠单克隆抗体被制备出来，但其中仅有GC33显示出有限的抗肿瘤活性22，且在患者中未能表现出临床疗效。本研究显示，GPC3-S-Fab能够招募自然杀伤（NK）细胞以杀伤表达GPC3的肿瘤细胞14。
为了招募自然杀伤（NK）细胞，使用了抗CD16 VHH。CD16a是一种低亲和力IgG受体，主要表达于自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、单核细胞以及某些T细胞亚型。它参与NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）23。人类NK细胞可分为两种类型：CD56-CD16+ 和 CD56+CD16-。与CD56+CD16− NK细胞相比，CD56-CD16+ NK细胞能够释放更高水平的穿孔素和颗粒酶B，因而具有更强的细胞毒性24。表达CD16a的库普弗细胞（KCs）是肝脏中的定居巨噬细胞，在抑制肝癌方面发挥重要作用25。因此，靶向CD16a的双特异性抗体（bsAbs）可能比激活T细胞来对抗肝癌更具前景。

<table><tbody><tr><td>摇床培养箱</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>紫外分光光度计</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>分析型聚丙烯酰胺凝胶电泳装置</td><td>Mini-PROTEAN&amp;reg; Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>转印电泳装置</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>成像系统</td><td>Bio-rad</td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>快速蛋白液相色谱仪</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision 酶标仪</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>抗 His 标签抗体</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>抗 Flag 标签抗体</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>抗人源（H&amp;L）-488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG HRP 标记抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-琼脂糖</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 亲和树脂</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>NK 细胞富集试剂盒</td><td>Stemcell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 试剂盒</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>标准分子量标记物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>凝胶过滤</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>VWR chemicals</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>生工生物</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>阿拉丁</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>阿拉丁</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>生工生物</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（无水）（KH2PO4）</td><td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（无水）（Na2HPO4）</td><td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>生工生物</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>100 mm × 20 mm 塑料培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25 cm² 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>96 孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>生工生物</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>中国科学院典型培养物保藏中心</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>中国科学院典型培养物保藏中心</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>中国科学院典型培养物保藏中心</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>中国科学院典型培养物保藏中心</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>中国科学院典型培养物保藏中心</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

一种靶向gpc3的双特异性抗体gpc3-s-fab及其强效细胞毒性

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

本方案描述了一种双特异性抗体（bsAb）GPC3-S-Fab的构建及其功能研究。双特异性抗体可通过其两个不同的臂识别两种不同的表位。目前，双特异性抗体因其能够直接招募免疫细胞以杀伤肿瘤细胞的能力而被广泛研究。现阶段，大多数双特异性抗体以重组蛋白形式生产，包括含Fc区的双特异性抗体或不含Fc区的较小双特异性抗体衍生物。在本研究中，设计了一种基于抗体片段（Fab）的双特异性抗体GPC3-S-Fab，通过将抗GPC3抗体GC33的Fab片段与抗CD16单结构域抗体连接而成。GPC3-S-Fab可在Escherichia coli中表达，并通过两次亲和层析纯化。纯化后的GPC3-S-Fab能够通过招募自然杀伤细胞，特异性结合并杀伤GPC3阳性的肝癌细胞，提示GPC3-S-Fab在肝癌治疗中具有潜在应用价值。

GPC3-S-Fab 纯化
GPC3-S-Fab 通过两步亲和纯化从 E. coli 中纯化获得，首先使用 Ni-NTA-agarose，随后进行 IgG-CH1 亲和纯化。经过两步亲和纯化后，GPC3-S-Fab 达到均一性，两条链的比例接近 1:1（图 2A）。通过其不同的 C 末端标签可鉴定 VH-CH1-CD16 VHH 和 VL-CL 多肽的存在：抗 His 标签识别 VL-CL（约 25 kDa），抗 Flag 标签识别 VH-CH1-VHH（约 38 kDa）（图 2B）。经过两步亲和纯化后，每 1 L SB 培养液可获得约 1.2 mg 蛋白质。为进一步表征纯化的 GPC3-S-Fab，进行了凝胶过滤分析。根据标准蛋白标记物（...

本文介绍了一种在大肠杆菌（Escherichia coli）中制备双特异性抗体 GPC3-S-Fab 的实验方案。纯化后的 GPC3-S-Fab 对 GPC3 阳性的肝癌细胞具有显著的细胞毒性。

一种靶向GPC3的双特异性抗体GPC3-S-Fab及其强效细胞毒性

本方案描述了一种双特异性抗体（bsAb）GPC3-S-Fab的构建及其功能研究。双特异性抗体能够识别两个不同的表位……

该方法有助于解答双特异性抗体领域中的关键问题，例如如何在细菌中生产双特异性抗体并确定纯化后抗体的功能。该技术的主要优势在于，GPC3-S-Fab 可以从大肠杆菌（E.coli）中简便地表达并纯化。为制备周质组分，首先将细胞悬液在 4°C 条件下以 4,000 g 离心 30 分钟。然后，弃去上清液，称量细胞。每克细胞加入4毫升冰预冷的蔗糖溶液，重悬细胞沉淀。将细胞悬液置于冰上孵育15分钟。15分钟后，在4°C条件下以8,500 ×g离心细胞悬液20分钟。然后用移液器吸出含有蔗糖组分的上清液，并将其置于冰上保存。将细胞沉淀重悬于预冷的5毫摩尔氯化镁与1毫摩尔PMSF混合液中。然后，向细胞悬液中加入 40 µL 浓度为 15 mg/mL 的溶酶体储备液。加入溶酶体储备液后，将细胞悬液置于冰上孵育 30 分钟。孵育结束后，合并蔗糖和周质组分。然后，在 4 摄氏度条件下，以 30,000 g 离心蔗糖-周质组分 30 分钟。离心结束后，将上清液转移至冰上预冷的 50 毫升锥形管中。接着，取 1 毫升镍-NTA 琼脂糖与上清液混合并重悬，形成均匀悬浮液，然后将 1 毫升镍-NTA 琼脂糖加入一支新的 15 毫升锥形管中。向琼脂糖中加入10倍柱体积的平衡缓冲液。然后在400 ×g 离心5分钟。离心后，小心去除上清液，并将镍-NTA琼脂糖加入蔗糖-周质组分中。然后，将含有蔗糖-周质组分的离心管在 4 摄氏度下轻轻摇动两小时。再次离心混合物。接着，小心地将上清液转移至新的预冷离心管中，因为这是未结合组分。转移上清液后，将镍-NTA琼脂糖加入重力柱中。然后，向柱中加入三倍柱体积的洗脱缓冲液。接着，依次收集洗脱液，分别作为洗脱组分一、二、三和四。在96孔板的每个孔中加入100微升含5,000个细胞的细胞悬液进行稀释和接种。将培养板置于37°C孵育6至8小时，使细胞贴壁。为制备外周血单个核细胞（PBMCs），首先在50毫升锥形管中用等体积的磷酸盐缓冲液稀释新鲜制备的血液。用移液器将15毫升淋巴细胞分离液加入一个新的50毫升锥形管中。接下来，沿管壁小心地将稀释后的血液转移至淋巴细胞分离液上层。在室温下以400 ×g离心35分钟，离心时关闭刹车。离心后，小心吸取上层血浆。然后用移液器吸取含有PBMC的白色血层。用含有2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液将所获得的PBMC稀释至原体积的两倍。然后，离心PBMC悬液。用含有2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀，再次离心。离心后，计数细胞数量。为制备自然杀伤细胞，将外周血单个核细胞重悬于含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液中。随后，将混合液转移至聚苯乙烯圆底管中。向每毫升外周血单个核细胞混合液中加入50 µL自然杀伤细胞富集试剂盒。混匀管内物质，静置10分钟。接着，通过反复移液多次重悬并混匀富集混合液中的磁性颗粒，使颗粒均匀悬浮。然后，每毫升磁性颗粒加入100微升至细胞悬液中。将细胞悬液与磁性颗粒混合，在室温下孵育5分钟。5分钟后，向细胞悬液中加入2.5毫升含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液。轻轻吹打2至3次，使管中的细胞充分混匀。将试管置于磁架上，室温静置2.5分钟，使磁珠充分沉降。随后，一次性将试管倒置，将富集的细胞悬液倒入新试管中。再次计数细胞数量。计数完成后，用培养基稀释自然杀伤细胞。然后，将100 µL细胞悬液加入已接种于96孔板中的肿瘤细胞。为建立细胞毒性检测体系，向96孔板中加入10 µL不同浓度的GPC3-S-Fab抗体。然后，将培养板在37摄氏度下孵育72小时。达到指定的孵育时间后，吸除培养基。随后，在96孔板的每个孔中加入含有10微升CCK试剂的100微升DMEM培养基。再次将培养板置于37摄氏度孵育。孵育结束后，在加入CCK8试剂后的每连续一小时于450纳米处读取吸光值，持续至四小时结束。GPC3-S-Fab抗体采用两步亲和纯化法进行纯化。此处的两个图板分别显示，该抗体使用镍-NTA 琼脂糖柱和 IgG-CH1 亲和纯化柱进行纯化。接下来，利用 GPC3 阳性和阴性的癌细胞系评估 GPC3-S-Fab 抗体的结合亲和力。GPC3-S-Fab 能够结合所有 GPC3 阳性细胞，例如 Hep3B、Huh7、Hep2G 和 CHO/GPC3。有趣的是，当使用 GPC3 阴性细胞（如 MHCC-97H 和 CHO）时，几乎未观察到或仅观察到极微弱的结合。此外，在新鲜自然杀伤细胞存在下，研究了 GPC3-S-Fab 对肿瘤细胞的细胞毒性。在自然杀伤细胞存在的情况下，抗体 GPC3-S-Fab 以剂量依赖性方式对 HepG2、Hep3B 和 Huh7 细胞表现出强烈的细胞毒性。然而，在缺乏自然杀伤细胞的情况下，MHCC-97H 细胞未表现出此类细胞毒性。只要操作得当，掌握该技术后可在六小时内完成。进行此操作时，重要的是要记住将步骤保持在冰上进行。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如异种移植模型）来回答更多问题，例如肿瘤在体内的作用效果。该技术建立后，为双特异性抗体领域的研究人员探索体外抗肿瘤效应铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备靶向肿瘤细胞的功能性双特异性抗体，特别是自然杀伤（NK）细胞的分离方法。

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GPC3-targeting 双特异性抗体, GPC3-S-Fab, 具有强大的细胞毒性

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本研究描述了一种基于泊马度胺的双功能同源PROTAC分子的合成与表征，该分子作为一种新策略，可诱导E3泛素连接酶cereblon（CRBN）——沙利度胺类似物的作用靶点——发生泛素化并降解。...

基于泊马度胺的同源PROTACs对E3泛素连接酶Cereblon的化学失活

抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF）的研发为清除有害抗体提供了新策略。本文详细描述了DCAF1分子的合成方案，该分子可选择性阻断4G2抗体，从而在登革病毒感染过程中消除抗体依赖性增强效应。...

抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF）介导的靶向抗体阻断

本文介绍了一种在小鼠肿瘤异种移植模型中研究抗体体内定位的实验方案。...

分析靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤及组织中的分布

在此，我们介绍一种将荧光素酶转导至人T细胞的方法，以促进 体内 在评估T细胞结合型双特异性抗体抗肿瘤疗效及作用机制的研究中，对双特异性抗体诱导的T细胞向肿瘤迁移的追踪...

利用荧光素酶转导的人源T细胞追踪双特异性抗体诱导的T细胞迁移

本方案介绍了一种自动化的、基于图像的高通量技术，用于在存在治疗性抗 HER-2...

高内涵筛选实验用于鉴定抗体依赖性细胞介导的细胞毒性调节化合物

本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。...

在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

本文介绍一种可分化并扩增人诱导多能干细胞（iPSC）来源的表达嵌合抗原受体（CAR）的自然杀伤细胞的方法，该方法能增强其对多种恶性肿瘤的杀伤能力。本方案展示了优化后的iPSC来源CAR-NK细胞的分化与扩增过程，以及针对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性检测方法。...

人诱导多能干细胞来源的表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞研究进展

本文介绍了一种制备双乳液滴的方法，该液滴包封单个T细胞和一个癌细胞靶标，用于在单细胞水平上研究细胞杀伤作用。该方法能够在大量T细胞中同时定量检测细胞毒性分子和靶细胞的凋亡情况。...

基于液滴的单细胞水平评估嵌合抗原受体T细胞毒性的检测方法

了解如何在Escherichia coli中生产GPC3-S-Fab双特异性抗体，并评估其对GPC3阳性肝癌细胞的细胞毒性。该方法简化了抗体的纯化流程，为癌症免疫治疗研究提供了可靠的技术方案。

一种靶向GPC3的双特异性抗体GPC3-S-Fab及其强效细胞毒性

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