A11阳性β-淀粉样蛋白寡聚体的制备及点印迹分析鉴定

该方法有助于解答神经药理学领域的关键问题。此技术的主要优势在于其操作简单、结果可靠且可重复，能够形成β-淀粉样蛋白寡聚体。我们展示该方法的示范至关重要，因为制备β-淀粉样寡聚体的步骤较难掌握。

首先，向管中加入 900 微升双蒸水，将 A-beta 单体溶液的浓度调整至 0.25 毫克/毫升。然后继续使用高纯度氮气吹干单体溶液，直至溶液体积减少至约 850 微升，浓度约为 0.29 毫克/毫升。HR5P 的存在会影响 A-beta 寡聚体的形成。

因此，尽可能充分蒸发是该实验步骤中的关键环节。接下来，使用双蒸水稀释姜黄素储备液，配制浓度为0.2和2微摩尔的工作液。按照1:1的比例混合A-beta溶液与姜黄素，使姜黄素的终浓度达到0.1和1微摩尔。

然后，将溶液置于磁力搅拌器上。将一个塑料分隔盒固定在磁力搅拌器上，在盒子的两个角落各放置一个磁力搅拌子，然后将装有样品的试管放在盒子中央。

在室温下以每分钟60转的速度继续振荡48小时，然后在4摄氏度下以18,000 ×g离心15分钟。离心后，收集上清液。进行点印迹分析时，取一张硝酸纤维素膜，将其切成1厘米宽的条带，然后将2微升样品均匀地点在条带一和条带二上，每个点之间的间隔为0.5厘米。

将样品滴加到膜上时，需均匀喷洒，并控制不同液滴之间的间距，避免不同样品相互连接。随后，将膜条在室温下孵育5分钟，使液滴完全干燥。5分钟后，将膜条在室温下用5%牛血清白蛋白孵育30分钟。

孵育结束后，用 TBST 缓冲液洗涤条带 5 分钟。洗涤完成后吸去缓冲液，然后将条带一与抗寡聚体抗体 A11 孵育，条带二与抗 A-beta 抗体 6E10 溶液孵育，孵育时间为 1 小时。1 小时后，用 TBST 缓冲液每次 5 分钟，重复洗涤条带三次，吸去缓冲液后，再将条带与二抗溶液孵育 40 分钟。

加入二抗孵育后，再次用TBST洗涤膜条，每次5分钟，共洗三次。然后，向湿润的膜条表面加入约300微升混合好的ECL溶液，随后将膜条置于自动化学发光成像系统中进行曝光。透射电镜研究表明，HFIP溶解的A-beta单体溶液中未见任何可见聚集体；然而，在孵育48小时后，相同的单体形成了寡聚体，主要为直径10至80纳米的球形聚集体。

将富含Aβ单体和寡聚体的样品进行点印迹分析，结果显示在富含Aβ寡聚体的样品中存在A11阳性的Aβ寡聚体。有趣的是，Aβ 6E10阳性的Aβ肽在富含Aβ单体和寡聚体的样品中均有存在。接下来，还进行了半定量分析，以对照组的百分比形式表示特异性抗体阳性的富含Aβ单体和寡聚体样品的水平。

A11 阳性的 A-β 肽在富含 A-β 寡聚体的样品中显著高于单体样品。相反，A-β 6E10 阳性的 A-β 肽在单体和富含寡聚体的样品中均存在。事实上，A-β 寡聚体还与姜黄素和 A-β 寡聚体抑制剂共同孵育。

姜黄素可导致A11阳性Aβ寡聚体的相对含量显著减少，在与姜黄素共同孵育的Aβ寡聚体样本中，A11染色强度降低。然而，与A11阳性样本相比，不同浓度的姜黄素对6E10阳性单体及富含寡聚体样本中的Aβ肽数量并无影响。一旦掌握该技术，若操作得当，可在数小时内完成。

该技术问世后，为研究人员探索阿尔茨海默病等神经退行性疾病的候选药物铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备Aβ寡聚体并评估其含量。