Name: 用斑点印迹分析 A11-positive β淀粉样寡聚物的制备与评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学习使用斑点印迹分析制备和评估A11阳性β淀粉样寡聚物的方法。该方案简单可靠，适用于神经药理学研究，帮助研究人员定量分析寡聚物浓度并探索神经退行性疾病的治疗靶点。

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本工作得到了国家自然科学基金（U1503223、81673407、21475131）、浙江省公益性技术应用研究项目（2016C37110）、宁波市国际科技合作项目（2014D10019）、宁波市生命科学与健康创新团队项目（2015C110026）、宁波市科技惠民项目（2017C50042）、李达三叶耀珍李国达海洋生物制药发展基金以及宁波大学王宽诚基金的资助。

1. 溶液配制
注意：试剂来源见材料表。
<ol>
	<li>通过将5 g牛血清白蛋白（BSA）加入100 mL双蒸水中，配制5% BSA溶液。充分涡旋混匀。将溶液在4 °C下保存，可保存最多1个月。</li>
	<li>通过将10 µL抗体原液加入10 mL 5% BSA溶液中，配制抗寡聚体抗体A11溶液（1:1,000）。充分涡旋混匀。将溶液在4 °C下保存，可保存最多1个月。</li>
	<li>通过将10 µL抗体原液加入10 mL 5% BSA溶液中，配制抗Aβ抗体6E10溶液（1:1,000）。充分涡旋混匀。将溶液在4 °C下保存，可保存最多1个月。</li>
	<li>通过将10 µL抗体原液加入10 mL 5% BSA溶液中，配制抗纤维状寡聚体抗体OC溶液（1:1,000）。充分涡旋混匀。将溶液在4 °C下保存，可保存最多1个月。</li>
	<li>通过将24 g Tris碱和88 g NaCl加入1,000 mL双蒸水中，配制Tris缓冲盐水（TBS）储备液。调节pH至7.4。将溶液在4 °C下保存，可保存最多3个月。</li>
	<li>通过将1 mL Tween-20加入100 mL TBS储备液和900 mL双蒸水中，配制含Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）溶液。</li>
	<li>通过将10 µL辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（H + L）加入10 mL TBST溶液中，配制二抗溶液。充分涡旋混匀。将溶液在4 °C下保存，可保存最多1个月。</li>
	<li>将3.68 g姜黄素溶解于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中，制成10 mM姜黄素储备液。</li>
	<li>将5 mg合成Aβ1-42溶解于2 mL 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）中，制成2.5 mg/mL Aβ单体溶液。在室温（25 °C）下放置20分钟。分装为每份100 µL，并在-20 °C下保存，可保存最多6个月。 
	注意：该步骤应尽快操作。移液枪头应剪去尖端，以确保准确移液。</li>
	<li>按体积比1:1混合电化学发光（ECL）液A和B，配制ECL工作液。该溶液应在使用前现配。</li>
</ol>
2. 样品制备
注意：在进行点印迹分析前 2 天完成样品制备。
<ol>
	<li>向一管 Aβ1-42 单体溶液中加入 900 µL 双蒸水，使 Aβ1-42 的浓度为 0.25 mg/mL。将混合物在室温下放置 20 分钟。</li>
	<li>用高纯度氮气吹干溶液，直至其体积约为 850 µL。此时 Aβ1-42 溶液的浓度约为 0.29 mg/mL。 
	注意：应不时摇动溶液，以确保 HFIP 完全挥发。通常情况下，经过约 30 分钟的吹干后，残留溶液体积约为 850 µL。</li>
	<li>用双蒸水将姜黄素储备液稀释为姜黄素工作液（0.2 和 2 µM）。按体积比 1:1 混合 Aβ1-42 溶液与姜黄素工作液，姜黄素的最终浓度分别为 0.1 和 1 µM。 
	注意：如有需要，潜在的寡聚体抑制剂可按任意比例与 Aβ1-42 溶液混合。</li>
	<li>将溶液置于磁力搅拌器上持续振荡（参见材料表）。
	<ol>
		<li>将一个塑料分隔盒固定在磁力搅拌器上，在盒子的两个角落各放置一根磁力搅拌子，并将样品管置于盒子中央。</li>
		<li>在室温（25 °C）下振荡 48 小时。 
		注意：磁力搅拌器的转速约为 60 rpm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 15 分钟，收集上清液。</li>
</ol>
3. 点印迹分析
注意：所有孵育步骤均在水平摇床中进行。
<ol>
	<li>将硝酸纤维素膜切成1厘米宽的条带。 
	注意：硝酸纤维素膜的宽度可根据实验需要进行调整。</li>
	<li>将2 µL样品均匀地点在两条条带（条带1和条带2）上，每点间隔0.5 cm。</li>
	<li>将条带置于室温下5分钟，直至条带上的液滴干燥。</li>
	<li>用5% BSA溶液在室温下孵育条带30分钟。</li>
	<li>用TBST溶液在室温下冲洗条带5分钟。</li>
	<li>吸除TBST溶液。在室温下，将条带1与抗寡聚体抗体A11溶液孵育1小时，条带2与抗Aβ抗体6E10溶液孵育1小时。</li>
	<li>用TBST溶液在室温下冲洗条带三次，每次5分钟。</li>
	<li>吸除TBST溶液。在室温下用二抗溶液孵育条带40分钟。</li>
	<li>用TBST溶液在室温下冲洗条带三次，每次5分钟。</li>
	<li>将混合的ECL溶液均匀地加在条带表面，在自动化学发光成像系统中进行曝光（参见材料表）。 
	注意：通常每张膜使用300 µL ECL溶液即可。曝光过程中必须保持膜湿润。曝光时间由成像系统自动计算。</li>
	<li>使用ImageJ（美国国立卫生研究院）或其他图像处理软件进行灰度分析，以获得半定量结果。</li>
</ol>

<ol><li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li>
<li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/biophysj/comments/S0006-3495(16)33411-7">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).</li>
<li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Alzheimer%27s+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol%3A+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li>
<li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis%28heptyl%29-cognitin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256(2015).</li>
<li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li>
<li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer%27s+A+beta-%281-42%29+peptide+in+aqueous+media+is+reversible%3A+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li>
<li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1%2C1%2C1%2C3%2C3%2C3-hexafluoro-2-propanol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li>
<li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxycyclopenicillone%2C+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).</li>
<li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们报道了一种制备含Aβ1-42寡聚体样品的方法，并通过点印迹分析检测A11阳性Aβ1-42寡聚体的含量。尽管我们制备富含Aβ1-42寡聚体样品的方法简便、可靠且可重复，但仍有一些注意事项需要关注。首先，使用HFIP溶解合成的Aβ1-42多肽。聚集态的Aβ1-42多肽在HFIP溶液中可解聚为单体。然而，HFIP易挥发，且黏度很低。因此，应尽快将Aβ1-42多肽溶解于HFIP中，并迅速分装HFIP溶液，以减少操作过程中HFIP的潜在损失。此外，此步骤中应剪断移液器吸头，以确保准确移液。其次，使用高纯度氮气将溶液中的HFIP吹干。在此过程中，应不时振荡Aβ1-42溶液，以确保HFIP完全挥发。该步骤结束时，溶液中不应再有HFIP气味。通常，30分钟的吹干可使HFIP浓度降至0.1%以下。据文献报道，在此浓度下HFIP不会影响Aβ1-42的构象转变7。第三，在制备含Aβ1-42寡聚体的...

阿尔茨海默病（AD）是全球影响老年人群最重要的神经退行性疾病之一1普遍认为，β-淀粉样蛋白（Aβ）的异常聚集可能是阿尔茨海默病（AD）最主要的致病因素。Aβ聚集体是老年斑的主要成分，而老年斑是AD患者脑组织中的重要生物学标志之一。此外，Aβ聚集体（尤其是寡聚体）具有强烈的神经毒性，可能在AD病程进展中导致神经元死亡。因此，抑制Aβ寡聚体的形成可能有助于防止神经退行性病变，而Aβ寡聚体抑制剂有望被开发为可改变疾病进程的AD治疗药物。许多研究已采用合成的Aβ多肽来诱导寡聚体的形成 体外，探索人工Aβ寡聚体的形态与结构，并利用其研究Aβ寡聚体的抑制剂 体外 模型2,3,4。然而，不同的 体外 Aβ寡聚体的形成方案可能导致具有不同形态特征的寡聚体，这或许会引起不同研究团队之间结果无法相互比较。因此，迫切需要建立一种标准化的Aβ寡聚体形成方案。
迄今为止，直接检测Aβ寡聚体的方法报道较少。透射电子显微镜（TEM）、非变性凝胶电泳、酶联免疫吸附测定（ELISA）和点印迹分析可用于检测Aβ寡聚体的含量和/或形态。 体外5,6例如，可利用透射电子显微镜（TEM）观察Aβ寡聚体的形态与结构。通过非变性凝胶电泳可测定Aβ聚集体的相对含量及其分子大小。酶联免疫吸附测定（ELISA）可用于检测血清、血浆及脑组织提取物中的Aβ寡聚体。最后，点印迹分析（dot blotting analysis）是一种用于蛋白质检测、分析与鉴定的技术，借助寡聚体特异性及Aβ特异性抗体，可用于评估不同样本中Aβ寡聚体的相对浓度。此外，点印迹分析具有显著的时间优势，因其无需进行凝胶电泳及凝胶转膜步骤。因此，该方法通常用于筛选潜在的Aβ寡聚体抑制剂。本实验方案的总体目标是描述一种相对简单、可靠且可重复的Aβ寡聚体制备方法。1-42 富含寡聚体的样品，用于分析Aβ的含量1-42 通过点印迹分析检测Aβ寡聚体，并利用半定量实验结果筛选Aβ寡聚体抑制剂。

<table><tbody><tr><td>A11（ab126892 兔多克隆抗体，针对淀粉样蛋白寡聚体）</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10（β-淀粉样蛋白兔单克隆抗体）</td><td>Cell&amp;nbsp;Signalling Technology</td><td>2454S</td><td></td></tr><tr><td>OC（抗淀粉样纤维OC抗体）</td><td>Millipore</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（H+L）&amp;nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇</td><td>Aladdin</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>姜黄素</td><td>Sigma</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白V型</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;二甲基亚砜</td><td>Solarbio</td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;times;非变性凝胶PAGE蛋白Marker</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>纯硝酸纤维素印迹膜</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>超低分子量蛋白Marker&amp;nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>转膜膜</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Star</td><td>Beyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝快速染色液</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>全自动化学发光成像系统</td><td>Tanon</td><td>Tanon 5200</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>上海沪西</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a11阳性β-淀粉样蛋白寡聚体的制备及点印迹分析鉴定

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

β-淀粉样蛋白（Aβ）是一种具有内在自聚集倾向的疏水性肽。在多种聚集形态中，Aβ寡聚体被广泛认为是阿尔茨海默病（AD）进展过程中主要的神经毒素，并被视为AD发病机制中的关键事件。因此，Aβ寡聚体抑制剂可能阻止神经变性，并有望开发成为可改变疾病进程的AD治疗药物。然而，不同的Aβ寡聚体形成方案可能导致产生具有不同特性的寡聚体。此外，目前尚缺乏有效的方法用于高通量筛选Aβ1-42 寡聚体抑制剂。A11 抗体可与一组有毒 Aβ 结合1-42 具有反平行β-折叠结构的寡聚体。在本方案中，我们描述了如何制备A11阳性Aβ1-42 来自合成Aβ的富含寡聚体的样品1-42 肽 体外 并评估 A11 阳性 Aβ 的相对含量1-42 通过使用 A11 和 Aβ 进行点印迹分析检测样品中的寡聚体1-42特异性6E10抗体。利用本方案，可筛选针对A11阳性Aβ的抑制剂1-42 寡聚体也可通过半定量实验结果进行筛选。

为了研究Aβ1-42单体在制备后是否能够形成Aβ1-42寡聚体，采用了透射电子显微镜（TEM）分析。在HFIP溶解的Aβ1-42单体样品中未观察到可见的聚集体（图1A）。此外，在振荡培养48小时后的Aβ1-42样品中，主要观察到直径约为10 - 80 nm的球形聚集体，表明Aβ1-42在制备后能够形成寡聚体（图1B）。
<img alt="阿尔茨海默病研究中用于蛋白质聚集研究的Aβ单体和寡聚体显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57592/57592fig1.jpg" data-altupdatedat...

本方案描述了如何从合成肽制备Aβ寡聚体 体外 并通过点印迹分析评估Aβ寡聚体的相对含量。

A11阳性β-淀粉样蛋白寡聚体的制备及点印迹分析鉴定

β-淀粉样蛋白（Aβ）是一种疏水性肽，具有自发聚集形成聚集体的内在倾向。在多种聚集体中，Aβ寡聚体……

该方法有助于解答神经药理学领域的关键问题。此技术的主要优势在于其操作简单、结果可靠且可重复，能够形成β-淀粉样蛋白寡聚体。我们展示该方法的示范至关重要，因为制备β-淀粉样寡聚体的步骤较难掌握。首先，向管中加入 900 微升双蒸水，将 A-beta 单体溶液的浓度调整至 0.25 毫克/毫升。然后继续使用高纯度氮气吹干单体溶液，直至溶液体积减少至约 850 微升，浓度约为 0.29 毫克/毫升。HR5P 的存在会影响 A-beta 寡聚体的形成。因此，尽可能充分蒸发是该实验步骤中的关键环节。接下来，使用双蒸水稀释姜黄素储备液，配制浓度为0.2和2微摩尔的工作液。按照1:1的比例混合A-beta溶液与姜黄素，使姜黄素的终浓度达到0.1和1微摩尔。然后，将溶液置于磁力搅拌器上。将一个塑料分隔盒固定在磁力搅拌器上，在盒子的两个角落各放置一个磁力搅拌子，然后将装有样品的试管放在盒子中央。在室温下以每分钟60转的速度继续振荡48小时，然后在4摄氏度下以18,000 ×g离心15分钟。离心后，收集上清液。进行点印迹分析时，取一张硝酸纤维素膜，将其切成1厘米宽的条带，然后将2微升样品均匀地点在条带一和条带二上，每个点之间的间隔为0.5厘米。将样品滴加到膜上时，需均匀喷洒，并控制不同液滴之间的间距，避免不同样品相互连接。随后，将膜条在室温下孵育5分钟，使液滴完全干燥。5分钟后，将膜条在室温下用5%牛血清白蛋白孵育30分钟。孵育结束后，用 TBST 缓冲液洗涤条带 5 分钟。洗涤完成后吸去缓冲液，然后将条带一与抗寡聚体抗体 A11 孵育，条带二与抗 A-beta 抗体 6E10 溶液孵育，孵育时间为 1 小时。1 小时后，用 TBST 缓冲液每次 5 分钟，重复洗涤条带三次，吸去缓冲液后，再将条带与二抗溶液孵育 40 分钟。加入二抗孵育后，再次用TBST洗涤膜条，每次5分钟，共洗三次。然后，向湿润的膜条表面加入约300微升混合好的ECL溶液，随后将膜条置于自动化学发光成像系统中进行曝光。透射电镜研究表明，HFIP溶解的A-beta单体溶液中未见任何可见聚集体；然而，在孵育48小时后，相同的单体形成了寡聚体，主要为直径10至80纳米的球形聚集体。将富含Aβ单体和寡聚体的样品进行点印迹分析，结果显示在富含Aβ寡聚体的样品中存在A11阳性的Aβ寡聚体。有趣的是，Aβ 6E10阳性的Aβ肽在富含Aβ单体和寡聚体的样品中均有存在。接下来，还进行了半定量分析，以对照组的百分比形式表示特异性抗体阳性的富含Aβ单体和寡聚体样品的水平。A11 阳性的 A-β 肽在富含 A-β 寡聚体的样品中显著高于单体样品。相反，A-β 6E10 阳性的 A-β 肽在单体和富含寡聚体的样品中均存在。事实上，A-β 寡聚体还与姜黄素和 A-β 寡聚体抑制剂共同孵育。姜黄素可导致A11阳性Aβ寡聚体的相对含量显著减少，在与姜黄素共同孵育的Aβ寡聚体样本中，A11染色强度降低。然而，与A11阳性样本相比，不同浓度的姜黄素对6E10阳性单体及富含寡聚体样本中的Aβ肽数量并无影响。一旦掌握该技术，若操作得当，可在数小时内完成。该技术问世后，为研究人员探索阿尔茨海默病等神经退行性疾病的候选药物铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备Aβ寡聚体并评估其含量。

a11-positive-amyloid-oligomer-preparation-assessment-using-dot

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生物化学

用斑点印迹分析 A11-positive β淀粉样寡聚物的制备与评价

通过半变性去垢剂-琼脂糖凝胶电泳筛选淀粉样蛋白聚集

我们介绍一种制备澄清的人类大脑皮层匀浆物的技术，通过SDS-PAGE进行蛋白质分离，抗原修复，并使用针对Aβ肽的抗体进行免疫印迹。采用该方案，我们能够持续在患有阿尔茨海默病病理的人类皮层组织中检测到单体及多聚体形式的Aβ。...

利用抗原表位修复法通过SDS-PAGE/免疫印迹检测人脑皮层组织匀浆中的Aβ多聚体

适配体是通过筛选获得的短链核糖/脱氧核糖寡核苷酸 体外...

阿尔茨海默病致病因子淀粉样β蛋白的适配体筛选

本视频展示了基于二维半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳的淀粉样纤维分离方法。该技术根据淀粉样聚集体的异质性大小，实现其多态性聚集体的分离。...

二维半变性琼脂糖凝胶电泳：一种基于大小异质性分离多态性淀粉样纤维的技术

蛋白质可折叠成天然结构，也可错误折叠形成不溶性淀粉样蛋白。有利于错误折叠途径的条件可导致不同类型的淀粉样纤维形成。本文所述方法可实现天然蛋白质向淀粉样蛋白的快速转化 体外.

天然蛋白质快速生成淀粉样蛋白 体外

通过结合原子力显微镜与生物淘选技术，我们建立了一套针对任意生物样本中疾病特异性蛋白质变体（即使浓度较低）的阴性和阳性生物淘选系统，成功获得了针对肌萎缩侧索硬化症相关TDP-43蛋白变体的抗体。...

基于新型原子力显微镜生物筛选技术分离肌萎缩侧索硬化中TDP-43变异体形态特异性试剂

描述了在肺血管内皮细胞感染后产生细胞毒性淀粉样蛋白的简单检测方法 铜绿假单胞菌.

检测肺内皮细胞感染后细胞毒性淀粉样蛋白的方法 铜绿假单胞菌

本文详细描述了从自动化微载体生物反应器收获的细胞培养液（HCCF）中纯化单克隆抗体并进行后续分析的实验方案。同时介绍了如何利用分析方法测定关键质量属性（CQAs），以及如何最大限度地利用有限的样品体积以获取关键信息。...

利用自动化微型生物反应器系统从中国仓鼠卵巢细胞中纯化和分析单克隆抗体

这种结合质谱法蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于对淀粉样纤维核心进行稳健表征，可能加速阿尔茨海默病防治靶点的发现。...

脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征

本文介绍了一种利用点杂交法对整体m⁶A水平进行半定量检测的实验方案。首先提取总RNA，经变性后点样于尼龙膜上，使用抗m⁶A抗体进行杂交，再通过化学发光法显影。利用ImageJ软件进行灰度分析，量化信号强度，从而反映相对甲基化水平，为相关研究提供一种可重复的实验流程。...

检测RNA整体N6-甲基腺苷修饰水平的点杂交实验

学习使用斑点印迹分析制备和评估A11阳性β淀粉样寡聚物的方法。该方案简单可靠，适用于神经药理学研究，帮助研究人员定量分析寡聚物浓度并探索神经退行性疾病的治疗靶点。

A11阳性β-淀粉样蛋白寡聚体的制备及点印迹分析鉴定

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