由小鼠胰腺前体细胞生成无支架三维胰岛素表达胰腺类器官 体外

该方法可通过利用胰腺类器官来研究在结构和细胞组成均复杂的环境中内分泌细胞的形成过程，从而有助于解答胰腺研究领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，由于保留了周围的间充质，胰腺类器官能够发育出内分泌细胞。通常，初次使用该方法的研究人员会面临困难，因为e10.5时期的胰腺非常小。

解剖对于获得足够且无污染组织以形成胰腺类器官至关重要。进行解剖前，准备一个装满冰的冰桶，并将盛有磷酸盐缓冲液的容器置于冰中。用70%乙醇清洁两把尖头镊子和解剖剪刀。

在解剖区域附近放置一个容器，内含至少三根硼硅酸盐毛细管、一个打火机以及经过滤的1000微升移液器吸头。接着，将至少1毫升浓度为1.25毫克/毫升的冷分散酶（用无菌水稀释）加入冰上放置的12孔板的第二孔中。在12孔板的第一、第三和第四孔中加入磷酸盐缓冲液（PBS）。

同时，将1毫升0.05%胰蛋白酶移液至一个1.5毫升离心管中，并置于冰上。根据IACUC指南对E10.5天的孕鼠实施安乐死后，用70%乙醇喷洒腹部以清洁该区域。然后，使用剪刀和镊子在小鼠生殖区域做V形切口，并沿腹部向上延伸切口至横膈膜。

在子宫最外侧的上部做切口，将器官向上提起并远离小鼠体部，沿切口向下延伸至生殖区域，然后在对侧重复此操作，仔细切除子宫。将切除的子宫置于含有冷PBS的10厘米培养皿中。在解剖显微镜下，将培养皿放置妥当，用两把镊子插入每个胚胎之间，从卵黄囊上轻轻剥离组织，小心打开子宫组织。

用镊子轻轻夹住卵黄囊，将胚胎转移至含有新鲜冷PBS的10厘米培养皿中。将培养皿置于冰上。接着，在10厘米培养皿的盖子上放置多个PBS液滴。

在解剖过程中，利用这些液滴转移胚胎，同时去除胚外组织以确保视野清晰。将一个胚胎转移至一滴PBS中，用镊子轻轻将其从卵黄囊上分离，其余胚胎则保持在冰上的PBS中。在将胚胎移至新的PBS液滴前，先用镊子轻轻铲起胚胎以去除头部，注意不要损伤组织。

在新的 PBS 液滴中，使用镊子去除四个肢芽。将镊子插入肢芽原来所在的位置，轻轻向前撕开最外层的组织。旋转胚胎，并向后重复此操作，至后肢芽处停止。

此时应可见消化道。消化道后段略有弯曲；将镊子插入消化道与体壁脊柱区域之间的开口处，位于该弯曲后方。缓慢向上分离消化道，直至到达最前端的心形区连接处。

在接下来的步骤中，关键是要避免将周围组织带入培养物中，以免非胰腺组织污染胰腺类器官。然而，如果未完整获取整个胰腺芽，则胰腺类器官的数量和大小将受到影响。将胃肠道转移至新鲜的 PBS 液滴中。

继续去除围绕消化道的外层组织。一旦去除该外层组织，即可在肝芽后方、胃与肠管之间观察到胰芽。然后用镊子轻轻夹住肠管上突出芽体下方的组织，略微抬起胰芽。

捏住芽体与肠管连接的区域后，将芽体分离。转移芽体前，在新的PBS液滴中清洗一次，然后放入12孔板的第一个孔中，并置于冰上冷PBS中。重复上述步骤，直至从所有胚胎中收集完芽体并放入12孔板的第一个孔中。

接下来，将12孔培养皿置于解剖显微镜下。计数成功分离的胰腺芽数量，以便后续计算分割比例。将带毛细管的滤过1000微升移液枪头插入移液器中。

将毛细管进行火焰灭菌，并在管上弯折出一个便于操作的弯曲。用该毛细管将芽体转移至第二孔中，置于冷的dispase溶液中处理两分钟，随后转移至第三孔的清洁PBS中。用移液器将芽体上下吹打，再转移至第四孔的清洁PBS中。

最后，使用毛细管装置将芽体转移至含有0.05%胰蛋白酶的1.5毫升离心管中。将离心管放入预热至37°C的摇床内，以1,500 RPM振荡4至5分钟。涡旋振荡约10秒后，立即将离心管放入离心机中，在200g条件下离心5分钟。

小心吸除溶液，仅保留约 50 微升，避免扰动已离心沉淀的细胞。每收集 400 微升成器官培养基中的类芽体至离心后的细胞中，短暂涡旋振荡三次，将 100 微升接种至低吸附性 96 孔板的每个孔中，按 1:4 的比例分割类芽体。在显微镜下观察，确认解离的细胞自由漂浮。

然后将培养皿置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中，在摇床上以中等速度孵育。从子宫角小心分离e10.5小鼠胚胎，应获得未受损的胚胎置于PBS中以进行进一步解剖。可高效地将胃肠道从胚胎中移除，从而在肠道与胃的连接处清晰识别背侧胰腺芽。

在器官发生培养基中，这些游离的无支架细胞会自组装并形成为三维的胰腺类器官，可在培养中生长并维持至少10天。使用高浓度的蛋白激酶C激活剂会改变发育中胰腺类器官的形态，导致上皮细胞松散聚集并增加分支结构。此外，利用转基因动物可实现对细胞分化过程的实时可视化观察。

为了评估胰腺间充质组织与胰腺上皮细胞之间的关联，可对每种组织的标志物进行免疫染色。对导管标志物、内分泌标志物以及细胞核进行免疫染色，可显示类胰腺体中的多谱系形成。间充质标志物与胰腺前体细胞标志物共染色显示，间充质包绕在类胰腺体周围。

通过染色上皮细胞标志物和β细胞标志物，可以揭示β细胞的发育过程。利用定量PCR分析，可检测前体细胞和分化中细胞的转录本，例如前体细胞基因和已分化标志物。一旦掌握该技术，若操作得当，包括准备时间在内，整个过程约需一小时。

观看本视频后，您应能充分掌握如何从小鼠胚胎（10.5天）中解剖获取胰腺组织以生成胰腺类器官。在操作该实验流程时，需特别注意仔细去除胚胎的胃肠道组织，否则将难以定位胰腺原基。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验（GSIS）和酶联免疫吸附测定（ELISA））来回答更多科学问题，例如在葡萄糖刺激后胰岛素或C肽的生成量是多少。

该技术建立后，为我们利用小分子探索蛋白激酶C（PKC）激活后的形态学效应铺平了道路。这一系统还可进一步用于研究转录因子表达的影响，甚至开展重要的上位性实验。