Name: 无支架三维胰岛素表达 Pancreatoids 的实验研究体外培养的小鼠胰祖细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 了解如何利用小鼠e10.5胰祖细胞与间充质在无支架三维培养中生成表达胰岛素的Pancreatoids。该方法为研究内分泌细胞形成及糖尿病机制提供了重要模型。

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我们感谢 Jolanta Chmielowiec 对本实验方案及手稿撰写的有益讨论。同时感谢 Benjamin Arenkiel 提供共聚焦显微镜的使用权限。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）（P30-DK079638 资助 M.B.，T32HL092332-13 资助 M.A.S. 和 M.B.）、McNair 医学基金会（资助 M.B.）以及贝勒医学院智力与发育障碍研究中心共聚焦成像核心（由 Eunice Kennedy Shriver 国家儿童健康与人类发育研究所资助 NIH U54 HD083092）的支持。

本方法中描述的所有动物实验均经贝勒医学院机构动物照护与使用委员会批准。
1. 小鼠胚胎第10.5天胰腺前体细胞的制备
注意：此方案在第2步之前无需在无菌条件下进行，但最好在使用前对解剖工具进行灭菌，并用70%乙醇喷洒。
<ol>
	<li>准备解剖操作时，装满一个冰桶，并将一容器磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上。用70%乙醇清洁两把尖头镊子和解剖剪刀。在解剖区域附近放置一个容器，内含至少三根硼硅酸盐毛细管、一根口吸管、一个打火机以及经过滤的1,000 µL移液器吸头。
	<ol>
		<li>准备至少1 mL浓度为1.25 mg/mL的冷dispase溶液，用无菌水稀释后置于冰上的12孔板第二孔中。将PBS加入12孔板的第一、第三和第四孔。将1 mL 0.05%胰蛋白酶溶液加入1.5 mL离心管中并置于冰上。预热摇床培养箱至37 oC。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据IACUC指南对孕10.5天（e10.5）的小鼠实施安乐死。用70%乙醇喷洒小鼠腹部以清洁该区域，然后使用剪刀和镊子在小鼠生殖器部位做V形切口，并向上延伸至横膈膜。 
	&#8203;注：本方案中阴道栓的出现记为第0.5天。使用5–6周龄小鼠时，体重增加超过2 g可作为成功交配的次要判断依据。
	<ol>
		<li>小心地切下子宫：在子宫最上侧部分做切口，将器官向上拉离小鼠体腔，沿切口向下延伸至生殖区域，然后在对侧重复此操作。将子宫放入盛有冷PBS的10 cm培养皿中。 
		注：可从e11.5胚胎解离细胞获得类器官，但与e10.5胰腺类器官不同，这些类器官尚未被充分表征，可能不具备分化为三种主要胰腺谱系的能力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在体视显微镜下，将培养皿放置好，通过将两把镊子插入每个胚胎之间的位置，剥离卵黄囊周围的组织，从而小心打开子宫组织。用镊子轻轻夹住卵黄囊将胚胎转移至盛有新鲜冷PBS的10 cm培养皿中。将培养皿置于冰上。 
	注：应谨慎取出胚胎，最好保持其在卵黄囊内，因为粗暴操作可能牵拉脐带，撕裂胚胎组织，破坏其结构完整性。</li>
	<li>在10 cm培养皿盖上放置多个PBS液滴。在去除胚外组织的过程中，利用这些液滴转移胚胎，以确保操作视野清晰。将一个胚胎转移至PBS液滴中，用镊子轻轻将其从卵黄囊中取出，其余胚胎则保留在冰上的PBS中（图1A）。用镊子轻轻托起胚胎并移至新的PBS液滴中，切除头部，注意避免损伤组织（图1B）。 
	&#8203;注：根据液体浑浊程度，可能需要比此处描述更频繁地将组织转移到新鲜PBS液滴中。
	<ol>
		<li>在新的PBS液滴中，用镊子去除前肢芽（图1B）。将镊子插入前肢芽所在位置的开口，仅轻轻撕开前方最外层组织（图1B）。旋转胚胎，在后方重复此操作，至后肢芽处停止。此时应可见消化道结构（图1B）。</li>
		<li>消化道后部有轻微弯曲（图1F）。将镊子插入消化道与体壁脊柱区域之间的开口，位于该弯曲后方。从该点开始缓慢向上分离消化道，直至到达心脏连接的最前端区域（图1B-E）。 
		可选：可从前部区域去除原始心脏和肝芽，仅保留连续的肠管。初次操作本方案时，为便于识别消化道形态及背侧胰芽，可暂时保留心脏和肝脏作为腹侧解剖标志，直到对结构更为熟悉（图1C和D）。</li>
		<li>将消化道转移至新鲜PBS液滴中。</li>
		<li>用镊子轻轻夹住突出芽体下方的组织及肠管，略微抬起外层组织（图1D-F）。 
		注：背侧胰芽位于胃与肠之间（图1C-G）。下方的胰芽应呈圆形、结节状结构（图1G）。</li>
		<li>将镊子置于芽体与肠管连接处，向上夹捏以松动芽体（图1G）。在转移至冰上12孔板第一孔的冷PBS前，先在新的PBS液泡中清洗一次。重复操作，直至所有芽体均从胚胎中收集并放入12孔板第一孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将12孔板置于体视显微镜下。计数成功分离的胰芽数量，以便后续计算分种比例。
	<ol>
		<li>将一根经过滤的1,000 µL移液器吸头连接至口吸管，并安装毛细管。用火焰灭菌毛细管，并将其弯折成便于操作的形状。用毛细管将芽体转移至第二孔的冷dispase溶液中处理2分钟，随后转移至第三孔的清洁PBS中（图1G）。 
		注：将芽体从dispase转移至PBS时，避免组织接触毛细管尖端。若组织卡在管尖，可在清洁PBS中反复吹打或轻轻震荡，直至松脱。</li>
		<li>用移液器轻轻吹打芽体数次，转移至第四孔的清洁PBS中。最后，使用毛细管装置将芽体转移至含0.05%胰蛋白酶的1.5 mL离心管中。将离心管放入预热至37 oC的摇床，以1,500 rpm振荡4分钟。</li>
		<li>涡旋约10秒后立即放入离心机，以200 g离心5分钟。小心吸除上清液，仅保留约50 µL，避免扰动已沉淀的细胞（图1G）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 培养解离的前体细胞以形成胰岛样类器官
注意：以下操作应在标准组织培养罩内的无菌环境中进行，并使用标准的无菌操作程序。
<ol>
	<li>每收集一个芽体，向离心后的细胞中加入 400 µL 器官发生培养基16,17（表 1），涡旋振荡三次，然后以每个低吸附 96 孔板孔 100 µL 的量接种，按 1:4 的比例分割芽体（图 1G）。</li>
	<li>在显微镜下观察，确认解离的细胞自由悬浮（图 1H）。将培养皿置于 37 oC、5% CO2 的摇床培养箱中，以中等速度摇动。</li>
	<li>每日监测胰腺类器官的生长情况。每 3 天更换 100 µL 新鲜培养基，在生物安全柜内显微镜下小心吸出旧培养基，注意保留孔中的胰腺类器官。或者，也可将 100 µL 新鲜培养基加入新的孔中，使用连接口吸管和 1000 µL 滤芯吸头的硼硅酸盐毛细管将胰腺类器官转移至新孔。</li>
</ol>
3. 胰腺类器官的免疫荧光成像处理
<ol>
	<li>为进行胰腺类器官的免疫荧光成像，首先配制 pH 7.4 的 4% 多聚甲醛/PBS（PFA）溶液。将 50 µL 的 4% PFA 加入 96 孔板的孔中。
	<ol>
		<li>使用硼硅酸盐毛细管和带有 1,000 µL 滤芯吸头的口吸移液器，将胰腺类器官从培养基中转移至含 4% PFA 的新孔中，尽量减少培养基的带入。室温下在摇床上固定 15 分钟。</li>
		<li>将胰腺类器官从 4% PFA 转移至含 100 µL 新鲜 PBS 的孔中，室温下在摇床上洗涤 5–10 分钟。重复此步骤，共进行三次 PBS 洗涤。 
		注意：此处可暂停实验流程，胰腺类器官可在 4 oC 下保存于 100 µL PBS 中，最长一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于整体成像（若抗体适用，推荐此方法；替代方法见第 3.3 节，显微镜操作见第 3.4 节），将胰腺类器官从 PBS 转移至含 50 µL 5% 驴血清与 0.1% 非离子型去污剂的 1× PBST 溶液中进行封闭。4 oC 下摇床孵育过夜，或室温下孵育 4 小时。
	<ol>
		<li>将胰腺类器官转移至新孔中，加入用 50 µL 含 5% 驴血清的 1× PBST 稀释的一抗溶液。最佳条件为 4 oC 摇床孵育 24 小时（至少 12 小时，最长可达 36 小时）。 
		注意：材料表中所列的 Chga（1:100）、DBA（1:400）、Vim（1:400）和 Pdx1（1:100）抗体适用于整体染色；其他抗体可能需要优化。</li>
		<li>将胰腺类器官转移至含 100 µL 新鲜 PBST 的孔中，室温下摇床洗涤 30 分钟。重复此步骤，共进行三次 PBST 洗涤。</li>
		<li>将胰腺类器官转移至新孔中，加入用 50 µL 含 5% 驴血清的 1× PBST 稀释的二抗溶液。避光，置于 4 oC 摇床孵育，最佳时间为 24 小时（至少 12 小时，最长可达 36 小时）。 
		注意：材料表中所列的所有二抗以及 DAPI 核复染剂均适用于整体染色。</li>
		<li>将胰腺类器官转移至含 100 µL 1× PBST 的新孔中，室温下摇床孵育 30 分钟。重复此步骤，共进行三次 1× PBST 洗涤。在第三次也是最后一次洗涤中加入 300 nM DAPI。</li>
		<li>最后，将样本置于 100 µL 新鲜 PBS 中，避光保存于 4 oC，最长一周，随后进行共聚焦显微镜成像；但染色后立即成像效果最佳。为防止成像过程中胰腺类器官移动并避免干燥，将每个类器官置于 20 µL PBS 液滴中。若类器官仍不稳定，可减少 PBS 体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于冷冻切片，将胰腺类器官从 PBS 转移至 30% 蔗糖溶液中，4 oC 下过夜孵育。
	<ol>
		<li>在解剖显微镜下，于气泡中加入包埋介质。在显微镜下使用镊子控制，将胰腺类器官轻轻多次穿过包埋介质以去除残留蔗糖，然后转移至含有冷冻包埋介质的组织块中。</li>
		<li>将组织块置于干冰上直至完全冻结，随后在恒冷箱切片机上以 8 µm 厚度切片。 
		注意：切片可于 -80 oC 保存，或立即进行免疫染色。</li>
		<li>将来自 -80 oC 的切片在室温下解冻约 5 分钟，直至干燥。使用疏水性笔在组织周围及组织块上画出疏水屏障，并用含 5% 驴血清的 1× PBST 溶液在室温下封闭 30 分钟。</li>
		<li>去除封闭液，立即加入用含 5% 驴血清的 1× PBST 稀释的一抗溶液，4 oC 下孵育过夜。</li>
		<li>去除一抗溶液，用 1× PBST 洗涤组织三次，每次 10 分钟。随后加入用含 5% 驴血清的 1× PBST 稀释的二抗溶液，室温孵育 1 小时，并避光保护切片。</li>
		<li>去除二抗溶液，用 1× PBST 洗涤切片三次，每次 10 分钟。在最后一次洗涤中加入 300 nM DAPI。</li>
		<li>去除溶液，加入封片剂并加盖盖玻片。将切片避光保存于 4 oC，待成像时使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于转录分析的胰腺类器官RNA提取
<ol>
	<li>使用连接到口吸管的硼硅酸盐毛细管收集胰腺类器官，并用经过滤的1,000 µL移液器吸头以保证无菌，将其放入装有500 µL酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液的1.5 mL离心管中。可于-80 oC保存，或立即进行RNA提取。</li>
	<li>进行RNA提取时，如需要，将样品置于冰上解冻，加入100 µL氯仿。充分涡旋混匀后，于4 oC放置15分钟。预先将离心机冷却至4 oC。
	<ol>
		<li>将离心管放入离心机，在4 oC下以12,000 g离心20分钟。</li>
		<li>小心取出离心管，避免扰动分层。使用200 µL移液器吸取上层透明水相，转移至新的1.5 mL离心管中，留下少量液体以避免触及白色蛋白质层和粉红色DNA层。此过程中移液器吸头不得接触任何物质，也不得触碰1.5 mL离心管管壁。</li>
		<li>向含有水相的新离心管中加入500 µL 100%异丙醇，涡旋混匀。室温静置20分钟，或更长时间置于冰上，或于-20 oC过夜以实现最大沉淀。</li>
		<li>在4 oC下以12,000 g离心15分钟，使RNA形成沉淀。小心去除上清异丙醇，避免扰动沉淀。 
		注意：由于胰腺类器官体积较小，沉淀可能不可见。</li>
		<li>加入冰冷的75%乙醇，反复倒置混匀数次。将离心管放入离心机，在4 oC下以9,000 x g离心10分钟。弃去乙醇后，再以9,000 x g离心2分钟。</li>
		<li>使用200 µL移液器小心吸除管内残留乙醇，避免接触沉淀所在区域。打开管盖，在室温下静置5–10分钟，确保残余乙醇完全挥发。</li>
		<li>用20 µL洁净无核酸酶的水重悬沉淀，并通过涡旋混匀。 
		可选步骤：将RNA在65 oC加热3分钟，立即置于冰上。RNA可于-80 oC保存，或直接用于逆转录和qPCR。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细胞培养模型的发展对于准确模拟发育过程、生成具有临床相关性的细胞类型、测试药物疗效，甚至用于患者移植至关重要。然而，在培养皿中人工重现发育过程仍具挑战性，因为我们对器官发生和生理机制的理解还远未完善。 体内 因此 体外 细胞的生成效率低下，功能不完善，无法长期维持，或与体内相应的细胞相比存在其他异常。这是因为在发育和生理过程中，多种不同类型的细胞相互作用，并伴随着复杂的形态发生改变。通过结合实验操作的便利性与 体外 系统，同时保留其复杂性 体内 发育将为生物医学研究提供一种有价值的工具。
类器官的开发为模拟发育过程的复杂性提供了一条极具前景的研究路径。本实验方案中，我们介绍了如何制备保留天然间充质并能高效生成内分泌细胞的胰腺类器官（pancreatoids），尽管此类胰腺类器官不表现出葡萄糖响应性。该工具可用于在维持组织异质性的培养体系中研究发育机制及功能特性 体内此外，该方法可用于遗传筛选或小分子及药物的筛选。这一点尤其具有重要意义，因为在相对均一的细胞培养体系中测试候选药物，可避免这些化合...

阐明正常发育与生理学的机制对于理解疾病病因并最终开发治疗方法至关重要。尽管干细胞的培养与分化能够实现对发育过程的快速、高通量分析，但该方法受限于当前对调控细胞命运机制的认知水平，且仅能在相对均一的二维人工环境中模拟发育过程1,2。体内发育不仅受到外部因素的影响——微环境中的不同细胞类型通过旁分泌信号和结构支持引导器官发生，而且这些细胞的功能也依赖于周围环境提供的指导信号3,4,5。鉴于这些外部信号的重要性、现有分化方案的局限性以及体内小鼠模型实验的繁琐性，亟需建立新的实验体系以深入研究基本的发育过程与生理机制。
三维复杂类器官培养方案的出现为研究器官发生、生理功能、药物疗效甚至发病机制提供了一个便捷且高度相关的系统. 建立用于不同系统的鼠类类器官，例如胃6 和肠道7 拓展了我们对器官发生的理解，提供了一种研究发育复杂性的工具，其限制较以往更少 体内 和 体外 模型。由于小鼠类器官培养技术的进步以及人类多能干细胞的出现，人类肠道8，视网膜9，肾脏10,11，以及大脑的12 类器官已被成功制备，其种类仅受限于当前对发育机制的认知水平。
特别值得关注的是胰腺类器官的生成，因为多种疾病会影响胰腺的不同细胞类型，包括外分泌胰腺功能不全中的腺泡细胞和导管细胞13胰腺炎中的腺泡细胞14，以及糖尿病中的β细胞15了解这些不同类型细胞的发育过程有助于理解其病理机制，同时也可为个性化药物筛选或移植提供一个平台。此前，Greggio 等 开发了一种方法以构建能够模拟小鼠胰腺的类器官 体内 形态发生并发育形成由所有主要胰腺上皮细胞类型组成的有序三维复杂结构16,17这是胰腺研究领域的一大进步，尤其是在细胞制备方面 体外 可促进对β细胞发育的生物学研究。然而，该方案中内分泌细胞的形成数量极少，除非将类器官移植到组织中，使其微环境能够相互作用并提供指导性信号17间充质构成了微环境的最大部分，从器官发生的早期阶段到后期阶段（包括内分泌细胞的去层化和分化），都大量包裹着发育中的上皮组织。3,4,18间充质与发育中胰腺的相互作用是外源性信号传导以及维持其正常发育重要性的又一例证 体内 细胞复杂性以研究器官发生。
本文介绍了如何从离散的 e10.5 小鼠胰腺前体细胞生成三维胰腺类器官，即胰腺样体（pancreatoids）。这些胰腺样体保留了天然的间充质成分，可在悬浮培养条件下自我组装，并生成所有主要的胰腺细胞类型，包括大量内分泌β细胞19。该方法最适合用于研究内分泌发育，因为此前的方案难以实现有效的内分泌分化。然而，若需分析胰腺上皮分支及形态发生过程，则建议采用 Greggio et al. 所描述的胰腺类器官培养方案，因为在胰腺样体中分支结构的形成较为有限。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>校准微量毛细移液管用吸管组件</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure 无核酸酶水</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管</td><td>Sutter Instruments</td><td>GB1007515</td><td>外径 1 mm，内径 0.75 mm，长度 1.5 cm</td></tr><tr><td>CaCl₂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>防细胞黏附U型底96孔微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>U型底</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424 R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>嗜铬粒蛋白A抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>紧凑型模块化体视显微镜 M60</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数仪专用载片</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70 冷冻切片机</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）</td><td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>粉末</td></tr><tr><td>DBA 抗体</td><td>Vector Lab</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II 粉末</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 培养基（含 HEPES）</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>0.05 × 0.02 mm；钛材质；生物学尖端</td></tr><tr><td>EGF（表皮生长因子）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200 证明</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri Cycle CO₂ 培养箱</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片剂</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>来源于猪肠黏膜的肝素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 抗体</td><td>Santa Cruz BioTechnology</td><td>sc-271408</td><td>多克隆小鼠 IgG</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia 异氟烷，USP 标准</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素抗体</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>多克隆豚鼠抗体</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE 高分辨率光谱共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 C 肽 ELISA 试剂盒</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>小鼠超敏胰岛素 ELISA 试剂盒</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 微型切片机刀片</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH₂PO₄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1×</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pdx1 抗体</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>单克隆小鼠 IgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way 一次性包埋模具</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA（佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>1.5 mL 容量</td></tr><tr><td>重组人 FGF-10 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>重组人酸性 FGF 蛋白</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>重组人 R-Spondin I 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D 混匀仪</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖 500 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen 防扩散笔</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R 恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶解液</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1×)，无酚红</td></tr><tr><td>台盼蓝染色液</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td>用于细胞计数载片</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%）</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>含酚红</td></tr><tr><td>超低吸附24孔板</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附96孔球形培养板</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>波形蛋白抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>多克隆鸡 IgY</td></tr><tr><td>Vortex Genie 涡旋振荡器</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1254</td><td>又称 ROCK 抑制剂</td></tr><tr><td>Zeiss 710 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

由小鼠胰腺前体细胞生成无支架三维胰岛素表达胰腺类器官 体外

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

胰腺是一个复杂的器官，由多种不同类型的细胞组成，这些细胞协同作用以调节血糖稳态和消化过程。这些细胞类型包括分泌酶的腺泡细胞、负责将酶运输到肠道的分支状导管系统，以及产生激素的内分泌细胞。
内分泌β细胞是体内唯一能够产生胰岛素以降低血糖水平的细胞类型。糖尿病是一种以β细胞缺失或功能障碍为特征的疾病，其发病率正达到流行病水平。因此，建立可用于筛选药物和细胞治疗手段的β细胞发育研究方案至关重要。尽管对小鼠发育过程的实验研究必不可少， 体内 研究工作繁琐且耗时。培养细胞为筛选提供了更为便捷的平台；然而，它们无法维持在体内所存在的细胞多样性、结构组织以及细胞间的相互作用 在体内 因此，开发新工具以研究胰腺器官发生和生理学至关重要。
胰腺上皮细胞自器官发生初期便与间充质紧密关联，随着细胞的组织化和分化，最终形成结构复杂且具备生理功能的成熟器官。胰腺间充质为内分泌系统的发育提供了多种重要信号，其中许多信号机制尚未被充分阐明，因此在体外模拟过程中难以重现 体外 培养。本文描述了一种培养三维、含间充质细胞复合体的小鼠类器官（称为胰腺类器官）的实验方案。取e10.5小鼠胰腺芽组织，进行解剖、解离，并在无支架环境中培养。这些悬浮细胞可自组装形成类器官，其间充质包裹发育中的胰腺类器官，并伴随大量内分泌β细胞以及腺泡细胞和导管细胞的生成。该体系可用于研究器官发生过程中的细胞命运决定、结构组织与形态发生、细胞间相互作用，或用于药物、小分子化合物及遗传筛选。

在 e10.5 时期从小鼠子宫角仔细解剖出胚胎，应获得未受损的胚胎并置于 PBS 中，以供进一步解剖（图 1A）。可高效地从胚胎中分离出消化道（图 1B），从而清晰识别位于肠与胃交界处的背侧胰芽（图 1C-F）。e10.5 时期的胰芽已有文献描述；其前体细胞应表达 Pdx1, Sox9, Ptf1a 和 Hes120,21,22,23。经过组织处理步骤后，可通过光学显微镜观察到解离的胰腺单细胞或小细胞团（<...

本文介绍了一种从悬浮培养的 e10.5 小鼠胰腺前体细胞及其相关间充质中生成表达胰岛素的三维胰腺类器官的实验方案。

胰腺是一个复杂的器官，由多种不同类型的细胞组成，这些细胞协同作用以调节血糖稳态和消化过程。这些细胞……

该方法可通过利用胰腺类器官来研究在结构和细胞组成均复杂的环境中内分泌细胞的形成过程，从而有助于解答胰腺研究领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，由于保留了周围的间充质，胰腺类器官能够发育出内分泌细胞。通常，初次使用该方法的研究人员会面临困难，因为e10.5时期的胰腺非常小。解剖对于获得足够且无污染组织以形成胰腺类器官至关重要。进行解剖前，准备一个装满冰的冰桶，并将盛有磷酸盐缓冲液的容器置于冰中。用70%乙醇清洁两把尖头镊子和解剖剪刀。在解剖区域附近放置一个容器，内含至少三根硼硅酸盐毛细管、一个打火机以及经过滤的1000微升移液器吸头。接着，将至少1毫升浓度为1.25毫克/毫升的冷分散酶（用无菌水稀释）加入冰上放置的12孔板的第二孔中。在12孔板的第一、第三和第四孔中加入磷酸盐缓冲液（PBS）。同时，将1毫升0.05%胰蛋白酶移液至一个1.5毫升离心管中，并置于冰上。根据IACUC指南对E10.5天的孕鼠实施安乐死后，用70%乙醇喷洒腹部以清洁该区域。然后，使用剪刀和镊子在小鼠生殖区域做V形切口，并沿腹部向上延伸切口至横膈膜。在子宫最外侧的上部做切口，将器官向上提起并远离小鼠体部，沿切口向下延伸至生殖区域，然后在对侧重复此操作，仔细切除子宫。将切除的子宫置于含有冷PBS的10厘米培养皿中。在解剖显微镜下，将培养皿放置妥当，用两把镊子插入每个胚胎之间，从卵黄囊上轻轻剥离组织，小心打开子宫组织。用镊子轻轻夹住卵黄囊，将胚胎转移至含有新鲜冷PBS的10厘米培养皿中。将培养皿置于冰上。接着，在10厘米培养皿的盖子上放置多个PBS液滴。在解剖过程中，利用这些液滴转移胚胎，同时去除胚外组织以确保视野清晰。将一个胚胎转移至一滴PBS中，用镊子轻轻将其从卵黄囊上分离，其余胚胎则保持在冰上的PBS中。在将胚胎移至新的PBS液滴前，先用镊子轻轻铲起胚胎以去除头部，注意不要损伤组织。在新的 PBS 液滴中，使用镊子去除四个肢芽。将镊子插入肢芽原来所在的位置，轻轻向前撕开最外层的组织。旋转胚胎，并向后重复此操作，至后肢芽处停止。此时应可见消化道。消化道后段略有弯曲；将镊子插入消化道与体壁脊柱区域之间的开口处，位于该弯曲后方。缓慢向上分离消化道，直至到达最前端的心形区连接处。在接下来的步骤中，关键是要避免将周围组织带入培养物中，以免非胰腺组织污染胰腺类器官。然而，如果未完整获取整个胰腺芽，则胰腺类器官的数量和大小将受到影响。将胃肠道转移至新鲜的 PBS 液滴中。继续去除围绕消化道的外层组织。一旦去除该外层组织，即可在肝芽后方、胃与肠管之间观察到胰芽。然后用镊子轻轻夹住肠管上突出芽体下方的组织，略微抬起胰芽。捏住芽体与肠管连接的区域后，将芽体分离。转移芽体前，在新的PBS液滴中清洗一次，然后放入12孔板的第一个孔中，并置于冰上冷PBS中。重复上述步骤，直至从所有胚胎中收集完芽体并放入12孔板的第一个孔中。接下来，将12孔培养皿置于解剖显微镜下。计数成功分离的胰腺芽数量，以便后续计算分割比例。将带毛细管的滤过1000微升移液枪头插入移液器中。将毛细管进行火焰灭菌，并在管上弯折出一个便于操作的弯曲。用该毛细管将芽体转移至第二孔中，置于冷的dispase溶液中处理两分钟，随后转移至第三孔的清洁PBS中。用移液器将芽体上下吹打，再转移至第四孔的清洁PBS中。最后，使用毛细管装置将芽体转移至含有0.05%胰蛋白酶的1.5毫升离心管中。将离心管放入预热至37°C的摇床内，以1,500 RPM振荡4至5分钟。涡旋振荡约10秒后，立即将离心管放入离心机中，在200g条件下离心5分钟。小心吸除溶液，仅保留约 50 微升，避免扰动已离心沉淀的细胞。每收集 400 微升成器官培养基中的类芽体至离心后的细胞中，短暂涡旋振荡三次，将 100 微升接种至低吸附性 96 孔板的每个孔中，按 1:4 的比例分割类芽体。在显微镜下观察，确认解离的细胞自由漂浮。然后将培养皿置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中，在摇床上以中等速度孵育。从子宫角小心分离e10.5小鼠胚胎，应获得未受损的胚胎置于PBS中以进行进一步解剖。可高效地将胃肠道从胚胎中移除，从而在肠道与胃的连接处清晰识别背侧胰腺芽。在器官发生培养基中，这些游离的无支架细胞会自组装并形成为三维的胰腺类器官，可在培养中生长并维持至少10天。使用高浓度的蛋白激酶C激活剂会改变发育中胰腺类器官的形态，导致上皮细胞松散聚集并增加分支结构。此外，利用转基因动物可实现对细胞分化过程的实时可视化观察。为了评估胰腺间充质组织与胰腺上皮细胞之间的关联，可对每种组织的标志物进行免疫染色。对导管标志物、内分泌标志物以及细胞核进行免疫染色，可显示类胰腺体中的多谱系形成。间充质标志物与胰腺前体细胞标志物共染色显示，间充质包绕在类胰腺体周围。通过染色上皮细胞标志物和β细胞标志物，可以揭示β细胞的发育过程。利用定量PCR分析，可检测前体细胞和分化中细胞的转录本，例如前体细胞基因和已分化标志物。一旦掌握该技术，若操作得当，包括准备时间在内，整个过程约需一小时。观看本视频后，您应能充分掌握如何从小鼠胚胎（10.5天）中解剖获取胰腺组织以生成胰腺类器官。在操作该实验流程时，需特别注意仔细去除胚胎的胃肠道组织，否则将难以定位胰腺原基。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验（GSIS）和酶联免疫吸附测定（ELISA））来回答更多科学问题，例如在葡萄糖刺激后胰岛素或C肽的生成量是多少。该技术建立后，为我们利用小分子探索蛋白激酶C（PKC）激活后的形态学效应铺平了道路。这一系统还可进一步用于研究转录因子表达的影响，甚至开展重要的上位性实验。

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

无支架三维胰岛素表达 Pancreatoids 的实验研究体外培养的小鼠胰祖细胞

一种三维克隆形成实验方法，可使类似胰腺的前体细胞分化为表达胰岛素的克隆集落。该方法利用含有甲基纤维素、Matrigel 和生长因子的半固体培养基，使单个前体细胞在其中增殖并分化。...

一种用于定量检测表达胰岛素的集落形成前体细胞的实验方法

在此，我们介绍一种小鼠胚胎胰腺的分离、培养与操作方法。该方法是一种极佳的 离体...

一种系统 离体 胚胎胰腺的培养

本方案所述的三维培养方法可重现小鼠胚胎胰腺前体细胞发育为分支器官的过程，包括前体细胞的大量扩增、分化及形态发生。该方法适用于对微环境进行成像观察、功能干扰及操作干预。...

体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞

本方案演示了小鼠胰岛的分离及其在脱细胞支架上的接种。将支架支持的胰岛移植到链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的附睾脂肪垫中。胰岛在移植部位存活，并逆转了高血糖状态。...

支架支持的胰岛移植至糖尿病小鼠附睾脂肪垫

本文介绍了一种详细的实验方案，通过解离的单细胞非克隆型单层培养方法，将人多能干细胞（hPSCs）分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）细胞，以生成胰腺谱系细胞。该方法适用于制备均一的hPSC来源细胞，并可用于基因操作与筛选。...

高效生成人多能干细胞在贴壁培养中分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+ 后前肠/胰腺前体细胞

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。...

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。...

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

了解如何利用小鼠e10.5胰祖细胞与间充质在无支架三维培养中生成表达胰岛素的Pancreatoids。该方法为研究内分泌细胞形成及糖尿病机制提供了重要模型。

由小鼠胰腺前体细胞生成无支架三维胰岛素表达胰腺类器官体外

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