在多重基因分型与质谱技术下的临床队列研究中进行候选基因检测

该方法有助于解答临床诊断和遗传学领域的关键问题，例如检测与疾病结局相关的遗传标志物，包括人乳头瘤病毒。该技术的主要优势在于其是一种经济高效、靶向性强且耗时较短的诊断方法。开始此操作前，使用分子级水重新溶解所订购的冻干引物。

将每个多重检测的正向和反向引物加入到一个储存引物混合液中，使其每种引物的浓度为0.5毫摩尔。随后，按照文本方案中所述配制PCR的主混合液。向384孔PCR板的每个孔中加入4微升该混合液，以及1微升浓度为5至10纳克/微升的基因组DNA。

用酶标板封板膜覆盖酶标板，在室温下以200 × g离心1分钟。然后按照文本方案中所述运行PCR。取1 µL PCR产物与3 µL上样缓冲液混合，上样于2%琼脂糖凝胶。

以100伏电压电泳45分钟，以确保DNA扩增成功。接着，按照文本方案中所述配制SAP主混合液。向先前完成PCR反应的每个孔中加入2微升新鲜配制的SAP主混合液。

在1,000 × g下短暂离心1分钟，然后将反应板放回热循环仪。在37°C下运行热循环仪40分钟。

然后在 85°C 下反应 5 分钟以灭活酶。根据每种引物的稀释倍数计算后，混合相应体积的引物以制备引物混合液。必要时加入水稀释该混合液。

根据文本方案中所述，配制高重检测或低重检测的延伸主混合液。向反应板的每个孔中加入 2 µL 延伸主混合液，使每孔总体积达到 9 µL。在 1,000 × g 条件下短暂离心 1 分钟，然后将反应板放回热循环仪中。

此后，向每个孔中加入 16 微升去离子水，使每孔总体积达到 25 微升。将 6 毫克树脂均匀地铺在整个凹孔树脂板上。在室温下静置干燥 20 分钟。

然后，将树脂加入反应板中。使用悬浮混合器，在室温下以低速旋转反应板5分钟。接着，以3,200 ×g离心5分钟，以避免将树脂直接施加到质谱芯片上。

将平板的样本布局上传至系统的软件界面。使用分配系统，将基因分型分析物混合液从平板转移至基因分型芯片。将芯片载入MALDI-TOF系统，以从分析物混合液中生成质谱，并通过该平台的软件界面进行解读。

本研究采用质谱法进行多重基因分型。针对一个以食物过敏表型为特征的发现性临床队列，对候选基因 IL13 生成并分析了代表性的单核苷酸多态性（SNP）数据。其中一个变异位点 rs1295686 与激发试验证实的食物过敏相关。

本研究通过本方案中展示的多重基因分型方法，在复制队列中验证了该关联性。对两个队列结果进行的荟萃分析为IL13与FA之间的关联提供了强有力的证据。在进行该实验操作时，重要的是避免任何样本或试剂的污染。此外，为每个PCR反应额外配制10%的主混合液（master mix）也至关重要，以弥补可能发生的移液误差。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如实时 PCR）来回答更多问题，例如基因表达是否与已鉴定的疾病相关遗传标志物存在关联。该技术问世后，为临床诊断学和遗传学领域的研究人员探索患者群体中的疾病关联性开辟了道路。请注意，在使用基因分型试剂和 MALDI-TOF 系统时可能存在危险，因此在执行该操作时，务必采取佩戴手套和实验服等防护措施。