Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

这种方法可以帮助回答临床诊断和遗传学领域的关键问题，例如检测与疾病结果相关的遗传标记，包括人瘤病毒。这种技术的主要优点是它是一种经济高效、有针对性和时间高效的诊断方法。要开始此过程，请用分子级水重新配制任何有序的冻干引物。

将每个多重测定的正向和反向引物拉入储备引物混合物中，使其包含浓度为 0 点 5 毫摩尔的每个引物。在此之后，按照文本方案中的说明制备用于 PCR 的预混液。向 384 孔 PCR 板的每个孔中加入 4 微升这种混合物，以及浓度在每微升 5 至 10 纳克之间的 1 微升基因组 DNA。

用板盖盖住板，并在室温下离心 200 x G 1 分钟。然后按照文本协议中的概述运行 PCR。在 2% 琼脂糖凝胶上加载 1 μL PCR 产物和 3 μL 上样缓冲液。

在 100 伏特下运行 45 分钟，以确保 DNA 扩增成功。接下来，按照文本协议中的概述准备 SAP 预混液。将 2 微升新鲜制备的 SAP 预混液添加到先前运行的 PCR 板的每个孔中。

以 1， 000 倍 G 短暂离心 1 分钟。然后将板放回热循环仪。在 37 摄氏度下运行热循环仪 40 分钟。

然后在 85 摄氏度下放置 5 分钟以灭活酶。在计算每种引物的稀释因子后，将每种引物的测定体积合并以形成引物池。根据需要加水稀释此池。

如文本方案中所述，组装用于高重检测或低重检测的延伸预混液。向板的每个孔中加入 2 μL 的延伸预混液，使每个孔中的总体积达到 9 μL。以 1， 000 倍 G 短暂离心 1 分钟，然后将板放回热循环仪中。

在此之后，向每孔中加入 16 微升去离子水，使每孔的总体积达到 25 微升。将 6 毫克树脂均匀地涂抹在整个凹坑树脂板上。让树脂在室温下干燥 20 分钟。

然后，将填料涂在反应板上。使用悬浮混合器，在室温下缓慢旋转板 5 分钟。接下来，将板以 3， 200 倍 G 离心 5 分钟，以避免将填料涂在质谱芯片上。

将板的样品布局上传到系统的软件界面。使用分液系统，将基因分型分析物混合物从板涂到基因分型芯片上。将芯片加载到 MALDI-TOF 系统中，从分析物混合物生成质谱，并使用平台的软件界面对其进行解释。

在这项研究中，多重基因分型是使用质谱法完成的。在食物过敏表型的发现临床队列中生成并分析候选基因 IL13 的代表性 SNP 数据。一种变体 rs1295686 与经激发试验证实的食物过敏有关。

这是使用本协议中演示的多重基因分型方法在复制队列中确认的关联。对两个队列结果的荟萃分析提供了 IL13 与 FA 之间关联的有力证据。尝试此程序时，重要的是不要污染任何样品或试剂。为每次 PCR 准备额外的 10% 预混液以解决任何移液错误也很重要。

在此程序之后，可以执行其他方法（如实时 PCR）来回答其他问题，例如基因表达是否与已鉴定的疾病相关遗传标记相关。开发后，这项技术为临床诊断和遗传学领域的研究人员探索患者队列中的疾病关联铺平了道路。不要忘记，在使用基因分型试剂和 MALDI-TOF 系统时，可能会有危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和穿实验室外套。