用体外模型研究 5-氨基乙酰丙酸介导光动力疗法对金黄色葡萄球菌生物膜的影响

本实验的总体目标是评估五氨基乙酰丙酸或 ALA 介导的光动力疗法对金黄色葡萄球菌生物膜的抗菌作用。这种方法可以回答细菌生物膜领域的关键问题，即光动力细胞修复如何用作控制生物膜感染的替代疗法。该程序的一个优点是它有可能通过最少的调整用于其他细菌。

为了在 96 孔板中生成生物膜，首先将 1 个零下 80 摄氏度的 ThOD 金黄色葡萄球菌接种到三个生物膜中，形成临床菌株培养物，在单个 14 毫升圆底管中，含有 5 毫升胰蛋白胨大豆肉汤或 TSB 培养基，在 37 摄氏度的培养箱中振荡过夜。当培养物达到固定相时，离心细菌细胞，并将沉淀和 PBS 重悬至每毫升浓度的 2 倍 10 至第九个菌落形成单位。以 1 比 200 的比例稀释这些细菌悬浮液和补充有 0 点 5% 葡萄糖的 TSB 培养基，并将每孔 200 微升细菌细胞接种到每个实验组每个菌株的三个孔中，在聚苯乙烯细胞培养物处理的 96 孔微孔板中，在 37 摄氏度下孵育 24 小时，用氧气， 没有震动。

第二天，用 PBS 轻轻洗涤孔 3 次，不要干扰生物膜。接下来，将 200 微升新鲜制备的 ALA 添加到适当的实验孔中，并将板在 25 摄氏度下避光放置 1 小时。然后用发光二极管以每平方厘米 100 毫瓦的光强度照射板 1 小时。

为了计算每组活细菌的数量，在光疗治疗结束时，用 PBS 轻轻洗涤每个孔 3 次，以去除任何非粘附细胞。然后使用移液器吸头从每个孔的底部刮下粘附的细菌。根据实验条件，将每组细胞拉入一个 eppendorf 管中，并通过离心沉淀细胞。

沉淀重悬于 1 毫升 0.25% 胰酶和 PBS 中，在 37 摄氏度下孵育 90 分钟，然后再次离心。将沉淀重悬于 200 微升 PBS 中，每组进行 1 至 10 次连续稀释，将 5 微升连续稀释的样品添加到单个胰蛋白胨大豆琼脂平板上。然后将板在 37 摄氏度下孵育 16 小时，并计算每组细菌菌落的数量。

为了通过共聚焦激光扫描显微镜评估生物膜，成像和照射生物膜，如图所示。用 PBS 洗涤辐照的生物膜，并分别用 1 毫升绿色荧光核和染色体原核细胞膜渗透染料和 1 毫升 1 毫升微摩尔碘化丙啶对活细胞和死细胞进行染色。20 分钟后，去除多余的污渍，并在 63 倍 1.4 NA 油浸物镜下通过共聚焦激光扫描显微镜对生物膜进行成像。

与对照单一或未处理的生物膜细菌活力以及所有四种测试的菌株相比，ALA 光疗双重处理后生物膜细菌活力降低。通过共聚焦激光扫描显微镜对生物膜进行可视化证实了这一发现，在 ALA 光疗双重治疗组中观察到大多数细胞碘化丙啶阳性。在尝试此过程时，重要的是要记住，整个 ALA 处理的细菌作应在黑暗中进行，并且应轻柔处理材料生物膜，以避免干扰形成的生物膜。

该信息可用于探索细菌感染领域的研究人员在体外光动力疗法对细菌生物膜的抗菌作用。