Name: 慢病毒载体介导的转基因小鼠生产: 一种简单高效的创始人直接研究方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习慢病毒载体介导的转基因小鼠生产技术，通过向受精卵卵周间隙注射实现高效基因整合。该方法成功率超过70%，适用于多种小鼠品系，可快速进行体内功能筛选。

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感谢Magali Dumont和Rolando Meloni对本文手稿的审阅，以及iVector和Phenoparc ICM技术平台在慢病毒载体生产及动物饲养方面提供的技术支持。本研究由巴黎转化神经科学医院大学研究所（IHU-A-ICM）通过“未来投资计划”（Investissements d'Avenir，项目编号ANR-10-IAIHU-06）资助。P.R.获得了法语糖尿病与代谢疾病研究协会（ALFEDIAM）以及JDRF与法国国家健康与医学研究院（INSERM）联合基金的资助。

所有涉及动物实验的操作均已获得伦理批准，并由法国研究与教育部授权，许可编号为APAFIS#5094-20 16032916219274 v6和05311.02。ICM动物实验中心PHENOPARC已获得法国农业部认证，认证编号为B75 13 19。整体实验方案要求每项操作均在特定时间范围内完成，具体时间安排详见图1。
1. 动物采购与基础化合物的制备
<ol>
	<li>动物购买
	<ol>
		<li>订购25只8周龄的结扎雄性B6CBAF1/JRj小鼠（由♀C57Bl/6JRj与♂CBA/JRj交配产生的F1代）。 
		注意：动物到达后应立即隔离。结扎雄性小鼠可重复使用至少一年。 
		每3周更换一次笼具。</li>
		<li>订购50只10周龄的B6CBAF1/JRj雌性小鼠，并维持不少于50只的动物群体。</li>
		<li>订购10至15只8周龄的C57BL/6JRj可育雄性小鼠。</li>
		<li>订购30只4周龄的C57BL/6JRj雌性小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉与安乐死
	<ol>
		<li>通过腹腔注射300μL的氯胺酮/赛拉嗪混合液进行麻醉（氯胺酮剂量为150μg/g体重，赛拉嗪剂量为0.15μg/g体重）。将动物置于加热垫上以调节体温。在开始操作前，通过轻捏动物尾部检查反射情况。</li>
		<li>采用颈椎脱位法实施安乐死。断头作为辅助方法以确认动物死亡。胚胎的安乐死通过断头完成。 
		注意：动物到达后，应至少给予1周时间适应设施环境（期间不进行操作或配种）。重要的是，任何小鼠品系（包括转基因品系）均可作为超数排卵实验中的可育雄鼠和可育雌鼠。品系的选择应根据科学问题的具体需求而定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>激素配制
	<ol>
		<li>将910 µL的PSMG（孕马血清促性腺激素）缓冲液加入1支冻干PMSG小瓶中，混匀后分装为每份100 µL，于-20 °C保存。 
		注意：每份分装液含55 UI，可供11只小鼠使用。PMSG分装液首次使用后存放不得超过2周。</li>
		<li>将2730 µL的hCG（人绒毛膜促性腺激素）缓冲液加入1支冻干hCG小瓶中，混匀后分装为每份100 µL，于-20 °C保存。 
		注意：每份分装液含55 UI，可供11只小鼠使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透明质酸酶配制
	<ol>
		<li>用3 mL M2培养基溶解1支透明质酸酶，配制成10 mg/mL的储存液，并分装为每份50 µL，然后于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术器械准备
	<ol>
		<li>使用高压灭菌器对所有手术器械进行灭菌处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 雌性供体的超数排卵
<ol>
	<li>在采用12小时光照-黑暗循环的动物实验室内，于第-3天下午2点注射PMSG；于第-1天凌晨12点注射hCG，并在注射hCG后立即与可育雄鼠合笼交配。</li>
	<li>在第-3天，向100 µL PMSG（55 UI）的一份 aliquot 中加入1 mL无菌0.9% NaCl溶液。使用无死体积的注射器，对10只C57BL/6JRj雌鼠每只腹腔注射100 µL。 
	注意：每只小鼠将接受5 UI的PMSG。</li>
	<li>在第-1天，向100 µL hCG（55 UI）的一份 aliquot 中加入1 mL无菌0.9% NaCl溶液。对之前已注射PMSG的小鼠腹腔注射100 µL稀释后的hCG溶液（5 UI），使用无死体积的注射器。注射时应缓慢推注，拔出针头前稍作停留，防止液体外漏。 
	注意：每只小鼠将接受5 UI的hCG。hCG注射应在PMSG注射后46小时进行。</li>
	<li>在注射hCG后，立即将每只C57BL/6JRj雌鼠放入雄鼠的饲养笼中。</li>
	<li>在第0天早晨检查阴道栓，选用阳性栓的雌鼠用于收集受精卵。</li>
</ol>
3. 准备受体B6CBAF1/jRj假孕雌鼠
<ol>
	<li>在采卵前一天（第 -1 天）下午 5 点，将一只已进行输精管结扎的雄性小鼠与 2 只 B6CBAF1/JRj 雌性小鼠交配。 
	注意：务必使用来自不同笼子的雌性小鼠进行交配，以避免雌性动情周期同步化，从而提高获得阴道栓的成功率。此外，过去 2 天内更换过垫料的雄性小鼠笼子中不应添加新的雌性小鼠。雄性小鼠在垫料较脏的笼子中繁殖行为效率更高。</li>
</ol>
4. 受精卵的收集
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>向透明质酸酶原液中加入 1450 µL M2，配制透明质酸酶工作液。</li>
		<li>在直径 100 mm 的培养皿中，每只用于获取受精卵的雌鼠加入 100 µL 透明质酸酶工作液一滴，室温下放置。</li>
		<li>向 4 孔板中每孔加入 500 µL M16 培养基。每种慢病毒载体注射实验使用 2 个孔：一孔用于放置注射后的受精卵，另一孔用于放置未注射的对照组受精卵。将 4 孔板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于收集和操作胚胎的移液管。
	<ol>
		<li>将玻璃毛细管（75 mm/60 µL）的中心部分在火焰中旋转加热，使其软化。</li>
		<li>尽快将毛细管从热源移开并拉伸，获得内径约 300 µm 的细管。待冷却后继续拉扯，使其整齐断裂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集输卵管。
	<ol>
		<li>在第 0 天上午 9 点，通过颈椎脱位法处死 C57BL/6JRj 雌鼠，以断头确认死亡。 
		注：该安乐死方法已获得 IACUC 批准，并符合欧洲相关推荐标准。</li>
		<li>使用剪刀进行较大的横向切口以打开腹腔。输卵管位于子宫与卵巢之间。</li>
		<li>使用弯头镊子去除子宫韧带及带有明显血管的膜状组织。</li>
		<li>用弯头镊子将输卵管与卵巢分离。</li>
		<li>以弯头镊子为引导，使用弯头剪刀将输卵管从卵巢处剪下。</li>
		<li>牵拉输卵管，并用弯头剪刀从子宫端剪断。 
		注意：避免触碰含有受精卵的膨大壶腹部。整个操作过程须使用无菌器械。</li>
		<li>将所有收集的输卵管置于盛有 M2 培养基的 35 mm 培养皿中，室温保存。</li>
		<li>将 2 根输卵管放入同一滴 100 µL 透明质酸酶工作液（0.3 mg/mL）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除受精卵周围的卵丘细胞。
	<ol>
		<li>在体视显微镜下，使用两支胰岛素注射器：第一支固定输卵管，第二支撕开壶腹部，将受精卵释放至透明质酸酶工作液中。</li>
		<li>取已制备好的玻璃移液管连接导管，并连接装有 0.22 μm 滤器的吹吸装置，吸取全部受精卵。收集所有受精卵，并依次通过 6 个不同的 100 µL M2 培养基液滴进行清洗。</li>
		<li>将清洗后的受精卵放入含 5% CO2 的湿润化培养箱中，于 37 °C 的 M16 培养基中孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 制备注射移液管
<ol>
	<li>使用壁薄的玻璃毛细管（长度10-15 cm），外径为1 mm，将该毛细管夹入水平显微拉针仪中。 
	注意：在大多数水平拉针仪中，可调节三个参数：加热功率、拉力强度以及加热与拉制之间的时间延迟。调节这些参数以获得与图2A所示相似的注射针。对于常规进行DNA显微注射的使用者，可采用标准设置，并通过调整加热与拉制之间的时间延迟来改变针尖的整体形状。</li>
</ol>
6. 制作持针管
<ol>
	<li>使用注射移液管制备持卵移液管。</li>
	<li>将注射移液管连接至显微拉针仪。利用显微拉针仪切割移液管，获得直径为 80 至 100 µm 的尖锐对称尖端。随后在显微拉针仪上用热处理抛光尖端，使其形成无锐利边缘的对称圆形结构。</li>
</ol>
7. 含慢病毒载体的注射移液管的制备
<ol>
	<li>将慢病毒载体悬液在160 × g条件下离心2分钟，以沉淀通常存在于冷冻慢病毒储备液中的碎片。</li>
	<li>收集上清液，并在II级生物安全柜中转移至新的0.5 mL离心管中。</li>
	<li>使用Micro-loader将1 µL上清液转移至按步骤5所述准备的注射移液管中。</li>
	<li>将注射移液管安装在右侧显微操作仪的仪器支架上。将持卵移液管连接至左侧显微操作仪。 
	注意：慢病毒载体的转导滴度将直接与 founder 动物制备效率相关。为获得高效率（&#62;70%），应使用p24衣壳蛋白含量在100 ng/µL左右的病毒载体。当滴度以转导单位（TU）表示时，滴度应高于109 TU/mL。慢病毒载体储备液必须通过在293T细胞中瞬时转染p8.91包装质粒和编码水疱性口炎病毒（VSV）糖蛋白G的pHCMV-G质粒来制备，具体方法见补充方法18。</li>
</ol>
8. 显微注射
<ol>
	<li>在凹面载玻片中央加入 8 µL M2 培养基，并覆盖轻质石蜡油（经胚胎检测），以防止蒸发。</li>
	<li>将 20 枚卵尽可能分散地放入液滴中。 
	注意：沉积胚胎时切勿产生气泡。</li>
	<li>确保注射毛细管的尖端畅通。若堵塞，可用持卵管轻敲注射毛细管使其通畅。</li>
	<li>将显微注射仪的注射时间设定为 20 秒。 
	说明：病毒悬液的黏度可使病毒载体在卵周隙中的扩散过程清晰可见。应调节注射压力，使卵周隙在 20 秒注射时间内完全充满，相当于注射体积为 10 至 100 pL。注射压力不得超过 600 hPa。</li>
	<li>在体视显微镜下，用持卵管吸取一枚含有两个原核和两个极体的受精卵。</li>
	<li>使用 8.4 中所述设置，通过显微注射仪将卵在卵周隙内进行注射。 
	注意：注射时切勿让注射毛细管接触质膜。</li>
	<li>将所有可用的受精卵以每批 20 枚的方式完成注射，并立即将注射后的卵转移至预热的 M16 培养基中，放入含 5% CO2 的湿润化 37 °C 培养箱中。 
	说明：注射后需至少培养 30 分钟，方可进行胚胎移植。</li>
</ol>
9. 将胚胎移植至B6CBAF1/JRj假孕雌鼠体内
<ol>
	<li>在B6CBAF1/JRj雌鼠与B6CBAF1/JRj结扎雄鼠交配后16小时检查交配栓，此操作应在开始采卵前进行。</li>
	<li>为注射胚胎准备移植移液管。
	<ol>
		<li>按照采集和处理胚胎的方法（步骤4.2）制备胚胎移植移液管。选择内径约为150 µm、狭窄部分长度约为4-5 cm的移液管。 
		注意：移液管尖端应进行火焰抛光，以减少对卵子或输卵管可能造成的损伤。
		<ol>
			<li>用轻质石蜡油（经胚胎检测）填充至移液管肩部稍上方。</li>
			<li>吸入一小段空气泡，然后是M2培养基，最后再吸入第二个空气泡。</li>
			<li>将胚胎依次吸入，以尽量减少随胚胎一同注入输卵管的培养基总体积。</li>
			<li>最后加载一小滴轻质石蜡油（经胚胎检测），体积约为一个胚胎的宽度。 
			警告：操作移液管时应轻柔。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎移植。
	<ol>
		<li>对所有器械进行灭菌处理。</li>
		<li>通过腹腔注射300 μL无菌0.9% NaCl溶液进行麻醉，其中包含每克体重150 μg的氯胺酮（Ketamine）和每克体重0.15 μg的赛拉嗪（Xylazine）。</li>
		<li>用镊子夹住动物尾部以确认麻醉深度，并在手术开始前皮下注射0.1 mg/kg的镇痛剂（布托啡诺，Buprenorphine）。</li>
		<li>沿脊柱方向，在最后肋骨水平处，分别于背部两侧剃去约2 cm的毛发。</li>
		<li>将雌鼠置于加热垫上，并放置于无菌操作区域。在背部中央剪开一个2 cm × 2 cm的窗口。</li>
		<li>在皮肤上涂抹消毒液（10%聚维酮碘），用剪刀做一条长约1 cm的横向切口，然后将皮肤向侧方推开，直至透过体壁可见卵巢（呈橙色）。</li>
		<li>在双目手术显微镜下，用精细剪刀在卵巢正上方的体壁上做一5 mm切口。</li>
		<li>用无创血管夹夹住脂肪垫，并将卵巢、输卵管及子宫上部轻轻拉出。</li>
		<li>观察壶腹部，使用Vannas剪刀在连接卵巢与壶腹部的输卵管段进行半切。</li>
		<li>插入胚胎移植移液管，将胚胎送入壶腹部，推进至植入移液管中的第一个空气泡处停止。</li>
		<li>对另一侧输卵管重复上述操作。</li>
		<li>使用伤口夹关闭皮肤切口。</li>
		<li>将动物置于恢复室（39 °C，30-60分钟），直至完全苏醒。</li>
		<li>若出现疼痛或不适迹象，分别在术后12小时和48小时再次给予镇痛剂注射。</li>
		<li>术后7-10天拆除伤口夹。</li>
		<li>通过每3天监测一次体重变化来检查移植雌鼠是否怀孕。移植后10至12天可观察到明显的体重增加，提示已怀孕。 
		注意：在此发育的所有胚胎均代表潜在的转基因 founder 鼠。这些 founder 鼠的表型可根据生成这些转基因动物所关联的科学问题，在任何发育阶段或出生后进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 转基因创始人个体的基因分型
<ol>
	<li>配制基因型鉴定缓冲液，其中包含 10 mM Tris-HCl（pH 8）、5 mM EDTA（pH 8.0）、0.2% SDS（w/v）和 50 mM NaCl。通过 0.22 µm 滤膜对基因型鉴定缓冲液进行灭菌，并在室温下保存数月。</li>
	<li>将胚外膜（用于胚胎）或尾部小片段（用于出生后的动物）放入 500 µL 过滤后的基因型鉴定缓冲液中，加入 15 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL）。在 55 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>将裂解液在 15,000 × g 条件下离心 5 分钟，取 1 µL 上清液用于 PCR 反应。裂解液可在 4 °C 下保存数月。</li>
	<li>在 20 µL 反应体系中进行转基因片段的 PCR 扩增，反应体系包含 1× PCR 缓冲液、1.5 mM MgCl2、200 µM dNTPs、0.2 µM 各 PCR 引物、1 UI Taq DNA 聚合酶以及 1 µL 各消化样品。以 1 µL H2O 作为阴性对照，以含有转基因的慢病毒载体质粒 DNA 作为阳性对照。</li>
	<li>检测 eGFP 时使用以下引物： 
	eGFP 正向引物：5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3' 
	eGFP 反向引物：5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'</li>
	<li>在热循环仪中进行 PCR 扩增：94 °C 预变性 4 分钟，随后进行 35 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 1 分钟、60 °C 退火 1 分钟、72 °C 延伸 2 分钟。</li>
	<li>将 PCR 产物上样至 2% 琼脂糖凝胶，以观察约 300 bp 的 eGFP PCR 产物，如 图 2B 所示。 
	注意：所有在凝胶上显示 300 bp PCR 条带的个体均表明已整合 eGFP 转基因，可视为转基因个体。</li>
	<li>分析转基因动物中转基因的表达情况。例如，按照补充方法中所述并参照 图 3 和 图 4 进行组织学分析和免疫染色。 
	注意：转基因表达分析和表型分析应根据具体科学问题选择适当的方法进行。</li>
</ol>
11. 转基因拷贝数的定量
<ol>
	<li>准备用于定量 PCR 的 DNA 样本。
	<ol>
		<li>使用商业试剂盒，按照制造商说明书，从步骤 10.3 中获得的蛋白酶 K 裂解液中提取基因组 DNA（gDNA）。</li>
		<li>通过 260 nm 紫外分光光度法对 gDNA 进行定量。</li>
		<li>将每个 gDNA 样本稀释至终浓度为 10 ng/µL。</li>
		<li>对每个样本，用 H2O 进行 5 次连续 1:5 稀释，共获得 6 个浓度的样本：10 ng/µL、2 ng/µL、0.4 ng/µL、0.08 ng/µL、0.016 ng/µL 和 0.0032 ng/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备定量 PCR（qPCR）反应体系。
	<ol>
		<li>配制 qPCR 引物混合液。针对每对用于 qPCR 的引物，加入 10 µL 正向引物（100 µM 储存液）、10 µL 反向引物（100 µM）和 80 µL H2O。 
		注：扩增 eGFP 时使用正向引物 TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA 和反向引物 TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG。Cdx2 基因用作 qPCR 的内参基因（每个基因组含 2 个拷贝）。Cdx2 内参引物为正向引物 GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG 和反向引物 GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT。</li>
		<li>分别配制两种 qPCR 反应体系，一种含 eGFP 引物混合液，另一种含 Cdx2 引物混合液。每种体系需足量以对每个 gDNA 的 6 个稀释样本进行双重复扩增。单个 qPCR 反应体系包含 3.8 µL H2O、5 µL 荧光绿色 2× 反应混合液和 0.2 µL 引物混合液。 
		注：对每只待测转基因动物，需进行 24 次 qPCR 反应。该反应体系适用于 384 孔 qPCR 仪。</li>
		<li>对每只待测动物，在 384 孔板中分配：12 个孔加入 9 µL eGFP qPCR 反应体系，12 个孔加入 9 µL Cdx2 qPCR 反应体系。将每种 gDNA 稀释液各取 1 µL 加入 2 个含 eGFP qPCR 反应体系的孔和 2 个含 Cdx2 qPCR 反应体系的孔中。</li>
		<li>每种 qPCR 反应体系各预留 2 个孔，以 H2O 替代 gDNA 作为阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 384 孔板放入 qPCR 仪中，运行以下程序：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 50 个循环（95 °C 变性 10 秒，60 °C 退火延伸 1 分钟）。</li>
	<li>数据分析。对每个待测 gDNA，以总 gDNA 量的对数为横坐标（6 个浓度点，双重复），Ct 值为纵坐标作图。采用最小二乘法进行线性回归拟合曲线，并外推得到与纵轴交点对应的 Ct 值。利用 eGFP 和标准化后的 Cdx2 外推 Ct 值，通过标准 2ΔdCt 方法11 计算 eGFP 拷贝数相对于 Cdx2（2 拷贝）的相对值。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述在受精卵中进行慢病毒载体的卵周隙注射，获得了转基因胚胎，其数量占所收集胚胎总数的70%以上。该结果与以往报道一致，体现了该操作方法的特异性2,7,10,11,12。比较表1中所有数据，可突出几个重要特征。首先，移植卵的数量对应于所有注射后形态正常、且在培养数小时后未发生裂解的注射卵。93%的注射卵得以移植，表明慢病毒载体注射至卵周隙几乎不产生快速毒性。相比之下，DNA注射的情况则截然不同，仅有44%的注射卵存活并被移植。此外，两种方法中收集胚胎数与移植卵数的比值基本相同，提示慢病毒载体并无加剧的长期毒性。其次，若以整合了转基因的胚胎数相对于注射卵总数来计算，慢病毒载体注射的整体效率比DNA注射高出10倍以上。当采用相同的Neurog3增强子构建体比较两种方法中表达转基因的胚...

戈登的开创性工作 等 1980年的研究表明，在假孕小鼠中植入后，将质粒DNA注射到雄性个体中 原核 受精卵的处理可获得整合了质粒DNA的转基因动物1转基因哺乳动物的成功制备对全球生命科学产生了巨大影响，为基础科学和转化生物医学研究开辟了全新的研究领域。在过去的四十年中，DNA显微注射已成为常规技术。尽管已产生了大量转基因小鼠，但该标准方法并非适用于所有小鼠品系，且需要耗时的回交过程。2,3其在其他物种中的应用仍然具有挑战性4 且整体的转基因整合率仅限于出生动物的百分之几5此外，转基因整合效率是解释原核DNA显微注射总体产量低下的限制性因素。在这方面，整合型病毒载体是运输和整合转基因最有效的工具，因此可能为显著提高整合率提供新的途径，唯一的限制是转基因的大小不能超过10 kb。6.
带有水疱性口炎病毒（VSV）包膜蛋白的假型慢病毒载体是一种具有广宿主范围和高整合效率的基因转移工具，可用于转导受精卵7。该 透明带 包裹卵母细胞的结构是一种天然的病毒屏障，必须穿透该屏障才能实现慢病毒载体的转导。通过在显微钻孔或去除该屏障后对受精卵进行慢病毒转导，已成功制备转基因动物。 透明带8,9然而，注射于 透明带 在受精卵的卵周隙中进行转导似乎是转导受精卵的最简单方法，该方法最初由Lois及其同事描述。7.
卵周隙注射慢病毒载体可高效生产转基因动物，出生动物中转基因阳性率超过70%。该效率比标准的原核 DNA显微注射所能达到的最佳效率高出10倍以上7,10,11。在此条件下，单次注射实验至少可获得50只转基因 founder 小鼠（F0代）。由于 founder 数量众多，因此可直接在F0代小鼠中进行转基因效应的表型分析，而无需建立稳定的转基因小鼠品系。这一优势使得转基因效应能够快速筛选，特别适用于在数周内完成体内基因功能获得与功能缺失研究。此外，调控性DNA元件也可被快速筛选，用于绘制增强子区域以及转录因子结合的DNA基序11,12。在原核注射中，转基因通常以多个拷贝的形式整合到单一基因座；而使用慢病毒载体时，转基因以每个基因座单拷贝的形式整合到多个基因座中10,13。因此，整合基因座的多重性很可能与转基因 founder 中观察到的极高表达外显率相关，从而使新建立的模型更加稳定可靠。
重要的是，在使用DNA原核显微注射时，对原核的观察 原核 在操作过程中是绝对必需的。这一技术限制阻碍了来源于多种小鼠品系的受精卵的使用。因此，针对某些特定品系建立转基因模型时，其制备过程受到限制。 原核 不可见的需要在容许性品系中生产动物，随后至少进行10次连续回交，以将转基因导入目标小鼠品系。而通过慢病毒载体注射时，受精卵的透明带下腔始终可见，且注射操作无需高度专精的技术。例如，NOD/SCID 转基因小鼠并不适用于 原核 注射已通过病毒载体注射获得14.
本文提供了一套完整的实验方案，通过在单细胞期胚胎的卵周隙内注射慢病毒载体，以简便地制备转基因小鼠。文中详细描述了由泛表达启动子或细胞特异性启动子调控的外源基因表达。
本研究使用了pTrip ΔU3慢病毒骨架15。该载体可通过部分删除U3序列以去除U3启动子活性，从而产生复制缺陷型慢病毒载体，并形成自失活载体（SIN）16。慢病毒载体储备液通过将p8.91包装质粒（ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef）6、编码水疱性口炎病毒（VSV）糖蛋白G的pHCMV-G质粒17以及pTRIP ΔU3重组载体共转染HEK-293T细胞进行瞬时转染而获得。详细的制备步骤见补充方法部分。
高滴度慢病毒载体储备液的制备需在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。除需在BSL-3条件下生产的癌基因外，大多数转基因均适用此要求。因此，在大多数情况下，BSL-2条件已足够。此外，对于大多数负责监管转基因生物体（GMO）的国家监管机构而言，使用与生产通常被视为相互独立的环节。根据法国转基因生物体管理机构的规定，并符合欧盟相关建议，有限量的复制缺陷型SIN慢病毒载体（p24衣壳蛋白含量低于2 µg）可在生物安全一级（BSL-1）条件下使用。

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Dutsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 孔 Nunc 培养皿</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>体外受精培养皿</td></tr><tr><td>M2 培养基</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 培养基</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶 30mg</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>经小鼠胚胎测试</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>弯镊</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>弯剪</td><td>Moria</td><td>MC26</td><td></td></tr><tr><td>校准微量移液毛细管用吸管组件</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC 100-10</td><td></td></tr><tr><td>水平微量移液器拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>需配备霍夫曼调制对比照明系统</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram air</td><td></td></tr><tr><td>持卵针控制器</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>经小鼠胚胎测试</td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>可用于注射 DNA 或病毒载体</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 显微剪刀</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Centravet</td><td>ISO005</td><td>ISO-VET 100% 250ml</td></tr><tr><td>Ocrygel</td><td>Centravet</td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Centravet</td><td>VET001</td><td>Vetedine 120ml</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Centravet</td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0.3 mg/ml 10ml</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>三羟甲基氨基甲烷盐酸盐</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>粉末</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Sigma</td><td>P2308&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>oneTaq 试剂盒</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8联排 PCR 管</td><td>4titude</td><td>4ti-0781</td><td></td></tr><tr><td>96孔 PCR 仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Veriti</td></tr><tr><td>基因组 DNA 小量提取试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 预混液</td><td>Roche</td><td>4887352001</td><td>SYBR Green&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>384孔多孔板</td><td>Roche</td><td>5217555001</td><td></td></tr><tr><td>384孔 qPCR 仪</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

慢病毒介导的转基因小鼠制备：一种用于直接研究 founder 小鼠的简单高效方法

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

近40年来，原核DNA显微注射一直是通过外源基因随机整合来制备转基因小鼠的标准方法。该技术在全球范围内被广泛应用，但其主要局限在于外源基因整合效率较低，导致获得的首建鼠（founder）数量较少。在显微注射后移植受精卵所出生的仔鼠中，仅有少数百分比个体成功整合了外源基因。相比之下，慢病毒载体是一种高效的整合型基因转移工具，将其用于感染受精卵可实现高达70%以上的首建鼠平均获得率，显著提高了制备效率。此外，该方法适用于任何品系的小鼠，且外源基因的表达穿透性极高，采用慢病毒介导的转基因技术时，基因表达率超过80%，明显优于DNA显微注射。然而，慢病毒载体所能携带的DNA片段大小受限于10 kb，这是该方法的主要局限。通过在受精卵透明带（zona pellucida）下进行一种简单且易于操作的注射程序，单次显微注射实验即可获得50只以上的首建鼠。该方法特别适用于在首建鼠个体中直接开展基因功能获得或缺失的快速研究，或对基因组DNA区域进行体内（in vivo）功能筛选，以评估其调控基因表达的能力。

采用本方案生成了转基因动物。图示结果展示了普遍性及特定细胞类型中转基因的表达情况。
转基因的组成型表达
普遍型启动子是基础研究中用于持续高效表达外源基因的基本工具。这类启动子被广泛应用于多种多样的研究场景，从 体外 细胞转染至 体内 小型和大型动物的转基因技术
慢病毒载体被构建为在巨细胞病毒（CMV）启动子或基于鸡β-肌动蛋白启动子与CMV增强子融合而成的复合启动子CAG的控制下，表达绿色荧光报告基因（eGFP）。两种慢病毒载体均被制备（补充方法），并在293T细胞中根据eGFP的表达水平测定滴度，单位为转导单位（TU）。将两种慢病毒载体构建物...

本文介绍一种通过将慢病毒载体直接注射到受精卵的卵周隙中，以高效促进外源基因整合并制备首建者转基因小鼠的实验方案。

慢病毒介导的转基因小鼠制备：一种用于直接研究 Founder 小鼠的简单高效方法

近40年来，原核DNA显微注射一直是通过外源基因随机整合来制备转基因小鼠的标准方法。此类……

该方法可对小鼠体内的转基因效应进行快速的活体筛选，特别适用于开展基因功能获得或功能缺失研究，以及应答元件和DNA基序定位分析。该技术的主要优势在于，转基因动物的成鼠预测使用率超过70%，且可应用于任何小鼠品系，包括转基因小鼠。在处死小鼠后，收集输卵管。开始手术时，使用剪刀在腹腔内做一个较大的横向切口。然后，在子宫和卵巢之间找到输卵管。接着，使用弯头镊子去除带有明显血管的阔韧带和膜状组织。然后，将输卵管与卵巢分离，并从卵巢上解剖下输卵管。接着，牵拉输卵管，并从子宫端剪下。将所有收集到的输卵管转移至室温的M2培养基中。处理输卵管时，需小心避免触碰充满受精卵的膨大壶腹部。接下来，向一个10厘米培养皿中加入100 µL透明质酸酶工作液。然后将两条输卵管转移至其中，以去除卵子周围的卵丘细胞。在体视显微镜下，使用一对胰岛素注射器固定输卵管，撕开壶腹部并分散受精卵。然后，用带有胶管和吹管的预置玻璃移液器吸取全部卵子。利用此工具，将卵子在六滴M2培养基中依次转移，以去除周围的卵丘细胞。然后，将洗涤后的卵母细胞转移至四孔板中一个含有预热M16培养基的10毫米孔中。接着，将培养皿置于湿润的37°C培养箱中。作为准备，将制备好的慢病毒载体悬液在160 ×g条件下离心2分钟，以沉淀慢病毒储存液中常见的碎片。在二级生物安全柜中，将上清液转移至新的 0.5 毫升离心管中。接着，取一微升上清液加入注射移液器中。然后，将注射移液器连接至右侧显微操作仪。将持卵针连接至左侧显微操作仪。现在，在凹面载玻片的中央加入8 µL M2培养基，并覆盖轻质石蜡油以防止蒸发。然后，将20枚卵放入液滴的浅层区域，注意不要产生气泡。接着，确保注射毛细管的尖端处于开放状态。如果未打开，可用固定毛细管轻敲注射毛细管以使其开启。然后，将显微注射仪设置为注射20秒。现在，使用持卵管并通过手动加压吸取一个含有两个原核和两个极体的受精卵。接着，使用注射管将物质注入卵子的卵周隙中。不要接触细胞膜。调节压力，使受精膜下腔充满溶液。压力不应超过600百帕。注射20枚卵子后，立即将该批次卵子转移至预热的M16培养基中，并在移植前至少培养30分钟。将正常雌性与输精管结扎的雄性交配后16小时，检查交配栓情况。使用这些雌性小鼠进行移植。接下来，制备内径约为150微米的移植用移液管，其尖端经火焰抛光，长度约为4至5毫米。用经过胚胎检测的轻质石蜡油填充移液管，至略高于肩部位置。然后吸入一个小的空气气泡，再用 M2 培养基继续填充移液管。接着，吸入第二个空气气泡。现在，将胚胎逐个吸入移液管中，尽量减少胚胎之间培养基的体积。最后，吸取一滴仅比一个胚胎略宽的微小石蜡油。重植入移液管的制备至关重要，需要大量练习。移液管中的卵必须排列紧密，彼此之间几乎无培养基。接下来，在麻醉小鼠并用脚趾夹捏法确认麻醉效果后，沿最后一根肋骨水平的脊柱两侧剃去两条宽约两厘米的毛发区域。然后，将小鼠置于无菌区域的加热垫上，并进行铺巾，仅暴露皮肤区域作为操作窗口。接下来，使用碘伏和70%乙醇交替擦拭暴露的皮肤进行消毒。进行植入操作时，首先做一个1厘米长的横向切口，然后将皮肤向侧方滑动，直至透过体壁可见橙色的卵巢。接着用精细剪刀做一个5毫米的切口，并用无创血管夹夹住脂肪垫。夹住垫片后，拉出卵巢、输卵管以及子宫上部。接着，找到壶腹部，用维纳斯剪刀在连接卵巢与壶腹部的输卵管段进行半切。然后，插入移胚移液管，将卵子推出。在卵子释放后，于第一个气泡处停止操作。准备好所需材料，以便在另一侧输卵管上重复该步骤。操作完成后，使用伤口夹关闭皮肤。缝合皮肤后立即腹腔注射镇痛剂，并将动物置于带有39摄氏度加热元件的恢复室中。监测直至动物完全清醒。转基因动物系采用本方法制备而成。使用长度为2.3千碱基的Neurogenin-3增强子驱动eGFP，产生高滴度的慢病毒载体；作为对照，使用6号染色体的一个片段驱动eGFP。这些载体在胚胎中的整合效果较为理想。从胚胎中切取胰腺芽组织并进行免疫染色，以检测eGFP的定位表达。在含有Neurogenin-3增强子的载体中，超过90%的载体在Neurog3表达细胞中表达了eGFP。然而，所有整合的对照载体均未在胰腺芽中表达eGFP。通过定量PCR评估转基因整合位点，以CDX2基因为对照。使用Neurogenin-3载体时，平均整合位点数约为20，而使用对照载体时约为10。值得注意的是，Neurogenin-3载体所用的病毒转导滴度约为对照载体的两倍。提示转导滴度与整合次数之间存在关联。观看本视频后，您应能充分理解如何通过高效地向卵周隙注射慢病毒载体，来大量制备转基因 founder 胚胎。一旦掌握该技术，若操作得当，可在单日显微注射中获得多达 50 只 founder 动物。在完成此操作后，可进行其他方法，如滴定原核DNA显微注射，以建立转基因小鼠品系。请注意，使用慢病毒载体必须获得当地转基因生物管理委员会的授权。这些载体可能具有极高危险性，因此在进行本操作时应始终采取预防措施。

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科研

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Genetics

遗传学

慢病毒载体介导的转基因小鼠生产: 一种简单高效的创始人直接研究方法

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本视频介绍了将慢病毒载体注射到受精小鼠胚胎的卵周隙中的原核显微注射技术。该慢病毒含有转基因，可整合到受精胚胎的基因组中，最终产生转基因小鼠。...

基于慢病毒载体的卵周隙注射：一种将目的基因导入受精单细胞小鼠卵母细胞的方法

本视频展示了内侧神经节隆起（MGE）细胞的病毒标记及其移植，用于体内研究。该方法概述了使用病毒报告基因转导MGE细胞、将转导后的细胞移植到幼鼠大脑皮层，以及在特定中间神经元亚型中实现报告基因表达的各个步骤。...

病毒介导的内侧神经节隆起细胞标记及其体内研究中的移植

microRNA 在脑结构和功能中具有重要作用。本文介绍一种通过立体定位注射表达 microRNA 的慢病毒载体以实现海马区 microRNA 过表达的方法。该方法可作为相对快速评估 microRNA 功能的手段 体内...

向小鼠海马CA1区立体定位注射表达microRNA的慢病毒及其行为学结果评估

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

小鼠受精卵和早期胚胎由透明带保护，透明带是一种糖蛋白基质，可形成阻碍基因递送的屏障。本文介绍了一种利用激光穿孔透明带，通过慢病毒载体转导胚胎细胞并制备转基因小鼠的实验方案。...

激光辅助慢病毒基因递送至小鼠受精卵

本方案概述了构建一种模型系统所需的步骤，该系统可利用增强型lac阻遏蛋白和/或tet激活蛋白系统，在活体动物或细胞中条件性地调控目的内源基因的转录。...

体内应用REMOTE-控制系统调控内源性基因表达

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本文旨在提供一种利用将病毒悬液多次注射到受精卵的卵周隙中，从而在大鼠胚胎中进行慢病毒转基因的技术方法。通过将雌性大鼠与具有不同显性毛色的可育雄性品系交配，以获得假孕的代孕母鼠。...

利用慢病毒载体方法制备转基因大鼠

本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的腺相关病毒（AAV）生产方案，该方法利用商业供应商提供的可用于研究目的的组分，减少了病毒载体生产所需的时间和劳动投入。...

利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

学习慢病毒载体介导的转基因小鼠生产技术，通过向受精卵卵周间隙注射实现高效基因整合。该方法成功率超过70%，适用于多种小鼠品系，可快速进行体内功能筛选。

慢病毒介导的转基因小鼠制备：一种用于直接研究 Founder 小鼠的简单高效方法

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