单缓步动物标本的超低输入基因组测序库制备

微生物基因组测序过程中的污染仍然是一个大问题。在这里, 我们展示了一种方法来序列的缓步动物的基因组从一个单一的样本, 只有 50 pg 的基因组 DNA 没有整个基因组的放大, 以减少污染的风险。

该协议的目标是对称为缓步动物的微生物的基因组进行测序。我们已经建立了一种方法，可以从单个标本中对缓步动物 Hypsibius dujardini 的基因组进行测序，该标本具有低至 50 pg 的基因组 DNA，并具有全基因组应用。分离出一只缓步动物后，我们通过使用抗生素和目视检查来最大限度地减少细菌污染。

我们还使用了两种均质方法。第一种也是最常用的秀丽隐杆线虫使用冻融循环，第二种是用移液器吸头手动粉碎缓步动物。然后使用 DNA 构建测序文库，然后在 MiSeq 仪器中进行测序。

协议的总体总结。分离出单个个体后，对其进行三次冻融循环以进行均质化。基因组 DNA 被提取和纯化，并通过超声处理进行片段化。

然后构建测序文库，在验证文库大小分布后，使用测序仪器对其进行测序。在 90 毫米塑料培养皿中，使用蒸馏水作为溶剂制备 2% 琼脂糖凝胶，用蒸馏水制备 10 毫米 1% 青霉素链霉素。凝胶可以在 18 度的培养箱中储存 2 到 3 周。

收集单个缓步动物并放在准备好的琼脂平板上，用蒸馏水洗涤 2 到 3 次以去除残留的颗粒。将单个缓步动物放入青霉素链霉素抗生素中 2 至 6 小时以去除细菌污染，并使用 P10 移液器将净化后的动物放在干净的载玻片上。在显微镜下以 500 倍放大倍率观察缓步动物，并确认没有残留细菌。

使用 P10 移液器收集最多 5 微升液体的个体，并放入低结合力 PCR 管中，并尽可能去除多余的液体。匀浆和 DNA 提取。使用以下方法之一对动物进行匀浆以获得基因组 DNA。

通过冻融循环进行均质化。在步骤 2.5 之后，立即向含有缓步动物的 PCR 管中加入 100 μL 裂解缓冲液。将 PCR 管置于液氮中 10 分钟，然后移至加热块中，加热至 37 度 10 分钟。

重复此步骤 3 次。手动破碎。在立体显微镜下，用 P10 移液器吸头将动物压在 PCR 管壁上，压碎个体，并立即加入 100 微升裂解缓冲液。

在室温下孵育 30 分钟以进行裂解。将裂解混合物的全部体积转移到干净的 1.5 mL 低结合微管中。向低结合 PCR 管中加入 100 μL 裂解缓冲液，该管用于均质化，现已为空。

移液后，将混合物转移到 1.5 低结合力微管中。重复此步骤两次。将 300 μL 裂解缓冲液加入低结合 PCR 管中，移液后，将混合物移至 1.5 mL 低结合微管中。

将总共 600 μL 裂解混合物加入离心柱中，置于收集管中，并以 10， 000 G 离心 1 分钟。将流出液重新施加到色谱柱上，并以 10， 000 G 离心 1 分钟。此步骤对于确保大部分基因组 DNA 与色谱柱结合至关重要。

向离心柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液，并以 10， 000 G 离心 1 分钟。将离心柱转移到干净的 1.5 ml 微管中。将 20 μL 10 毫摩尔第一 ACL 加入离心柱，并在室温下等待 5 分钟。

以 10， 000 G 离心 1 分钟。稀释缓冲液不得含有 EDTA，因为它会干扰实验室制备酶。将流出液重新施加到离心柱上，在室温下孵育 5 分钟后，在 10， 000 G.Sequencing 文库构建中离心 1 分钟。

DNA 片段化。将 15 μL 基因组 DNA 洗脱液转移至 15 μL 微管中进行 DNA 片段化，并使用台式离心机离心 1 分钟。将基因组 DNA 片段化为 550 个碱基对。

移液后，将 10 μL 片段化的 DNA 混合物转移到干净、低结合力的 PCR 管中。实验可以在此处停止。在 4 度或零下 20 度下保存 DNA。

测序文库构建。由于 DNA 起始量较低，因此在以下程序中使用指定的试剂盒绝对至关重要。按照制造商的方案准备所需的试剂，并在不做任何修改的情况下构建测序文库。

将文库扩增混合物涂注到文库合成混合物中后，在热循环仪中进行 PCR 反应。如图所示进行 PCR 反应。PCR 反应的纯化。

加入 50 微升磁珠并移液 10 次，然后用台式微量离心机短暂离心。在室温下孵育 2 分钟。在磁力架上孵育 5 分钟，或直到溶液完全澄清，然后去除上清液。

请遵循制造商的协议。在不干扰沉淀的情况下将上清液转移到新的低结合 PCR 管中。DNA 质量检查和定量以及测序。

验证 DNA 文库大小分布。加入 3 μL 样品水和 1 μL 测序文库，用涡旋充分混合 1 分钟，然后用台式离心机短暂离心。使用相关软件进行电泳并验证文库大小分布。

主片段峰的范围应大致在约 300 至 1， 000 个碱基对之间。DNA 定量。加入 796 微升溶液缓冲液和 4 微升荧光试剂并充分混合。

将 190 μL 的工作溶液分配到两个检测管中，将 197 μL 的工作溶液分配到一个检测管中。向每个含有 190 μL 工作溶液的检测管中加入 10 μL 具有已知浓度 DNA 的标准品，向含有 197 μL 工作溶液的检测管中加入 3 μL 制备的文库。短暂涡旋，然后在台式离心机上离心。

使用具有 3 微升设置的荧光计定量 DNA。DNA 文库测序。根据制造商的方案准备测序文库。

将试剂盒和流通池放入测序仪中，并按照制造商的方案输入测序运行信息。运行测序。表示的结果。

在高质量 DNA 提取中暴露污染物仍然是我们实验方案的关键点。为了目视检查它们是否是污染物，我们将缓步动物在抗生素（青霉素和链霉素）中孵育，并在 500 倍显微镜下检查了个体。如图所示，缓步动物周围的可见微生物被完全照亮。

在高效匀浆、DNA 提取、片段化和文库制备之后。使用高灵敏度电泳验证文库的大小分布以进行质量控制。紫色和绿色线分别表示 1、500 和 25 个碱基对处的上下标记。

泳道 L 是梯形标记，泳道 S 和 N1 到 N4 是同一实验的五个重复，都从一个缓步动物标本开始。从 200 到 1， 000 个碱基对之间的广泛均匀分布可以看出，即使在超低起始量下，我们的方案也具有高度的可重复性。以下是快速 QC 的结果，用于从单次测序运行中获得的同步读数。

读数作为 300 个碱基对的备用端获得，其中正向和反向读数分别显示在顶部和底部。此处显示的分布是典型的 300 对末端读长，前 200 个碱基对在 Q30 以上出现非常高质量的碱基检出，并逐渐下降到末端。因此，这种方法只对一个样本使用单个个体。

不需要大量的动物，就像以前的缓步动物基因组测序项目那样。大多数缓步动物的培养方法尚未确定。因此，启用单个个体的基因组学测序，例如直接从田间工作进行基因组学测序，将对缓步动物分子生物学产生重大影响，并可能对其他小动物产生影响。

我们的 DNA 测序方法可以分析其他许多尚未测序的微生物，例如稀有的猪草物种、线虫、水冷杉和其他选项，通过将区域的一部分和更广泛的公共区域连接起来，进一步完善了各种生物机制可能的环境。