单个缓步动物标本的超低起始量基因组测序文库制备

本实验方案的目标是对一种名为缓步动物（tardigrades）的微观生物进行基因组测序。我们已建立了一种方法，可对单个个体的缓步动物——杜氏哈皮蛛（Hypsibius dujardini）——进行全基因组测序，仅需低至50皮克的基因组DNA。在分离出单个缓步动物后，我们通过使用抗生素和显微观察来最大限度地减少细菌污染。

我们还采用了两种均质化方法。第一种是在秀丽隐杆线虫中常用的方法，即使用冻融循环；第二种是使用移液器吸头手动碾碎缓步动物。随后利用DNA构建测序文库，并在MiSeq测序仪上进行测序。

本实验方案的总体概述。在分离出单一个体后，需进行三次冻融循环以实现均质化。随后提取并纯化基因组DNA，并通过超声处理将其片段化。

然后构建测序文库，并在验证文库片段大小分布后，使用测序仪器进行测序。使用蒸馏水作为溶剂，在90毫米的塑料培养皿中制备2%琼脂糖凝胶，并加入10毫米的1%青霉素-链霉素溶液（用蒸馏水配制）。该凝胶可在18摄氏度的培养箱中保存两到三周。

选取一只缓步动物，置于已准备好的琼脂平板上，用蒸馏水清洗两到三次，以去除残留颗粒。将该缓步动物放入青霉素-链霉素抗生素溶液中处理两到六小时，以去除细菌污染，然后使用P10移液器将去污染后的个体转移至洁净的载玻片上。在显微镜下以500倍放大观察缓步动物，并确认无残留细菌存在。

使用 P10 移液器吸取个体，液体体积最多不超过 5 µL，放入低吸附 PCR 管中，并尽可能去除多余液体。匀浆与 DNA 提取：采用以下方法之一对动物样本进行匀浆，以获得基因组 DNA。

采用冻融循环进行匀浆。在完成步骤2.5后立即向含有缓步动物的PCR管中加入100微升裂解缓冲液。将PCR管置于液氮中10分钟，然后转移至加热块中，在37摄氏度下温育10分钟。

重复此步骤三次。手动研磨。在体视显微镜下，用P10移液器枪头将个体紧压在PCR管壁上进行研磨，并立即加入100 µL裂解缓冲液。

室温孵育30分钟，使细胞裂解。将裂解混合物的全部体积转移至一支洁净的1.5毫升低吸附微量离心管中。向用于匀浆且现已空置的低吸附PCR管中加入100微升裂解缓冲液。

移液后，将混合物转移至1.5 mL低吸附微量离心管中。重复此步骤两次。向低吸附PCR管中加入300 µL裂解缓冲液，移液后，将混合物转移至1.5 mL低吸附微量离心管中。

将总共 600 微升裂解液加入置于收集管中的离心柱中，在 10,000 G 条件下离心一分钟。将流出液重新加入离心柱中，在 10,000 G 条件下再次离心一分钟。此步骤至关重要，以确保大部分基因组 DNA 能结合到离心柱上。

向离心柱中加入 500 微升洗涤缓冲液，在 10,000 G 条件下离心一分钟。将离心柱转移至一个洁净的 1.5 毫升微量离心管中。向离心柱中加入 20 微升 10 毫摩尔的首次 ACL，室温下静置五分钟。

在10,000 G条件下离心一分钟。稀释缓冲液中不得含有EDTA，因为它会干扰实验室制备酶的活性。将流出液重新加至离心柱中，在室温孵育五分钟后，于10,000 G离心一分钟。测序文库构建。

DNA片段化。将15微升基因组DNA洗脱液转移至0.2毫升微量离心管中用于DNA片段化，并使用台式离心机离心1分钟。将基因组DNA片段化至550个碱基对。

充分吹打混匀后，取10 µL片段化DNA混合物转移至洁净的低吸附PCR管中。实验可在此处暂停，将DNA在4 °C或-20 °C保存。

测序文库构建。由于DNA投入量较低，以下步骤中必须使用指定的试剂盒。请按照生产商的说明书准备所需的试剂，并在不作任何修改的情况下构建测序文游戏副本。

将文库扩增混合液加入文库合成混合液后，在PCR仪中进行PCR反应。PCR反应条件如图所示。对PCR反应产物进行纯化。

加入50微升磁珠，用移液器吹打10次，然后使用台式微量离心机短暂离心。在室温下孵育2分钟。将样品置于磁力架上孵育5分钟，或直至溶液完全澄清，然后移除上清液。

按照制造商的说明书操作。将上清液转移至新的低吸附PCR管中，注意勿扰动沉淀。进行DNA质量检测、定量及测序。

验证DNA文库片段大小分布。取三微升样品水与一微升测序文库混合，充分涡旋混匀一分钟，然后用台式离心机短暂离心。进行电泳，并使用配套软件验证文库片段大小分布。

主片段峰的范围通常应在约 300 到 1,000 个碱基对之间。DNA 定量。加入 796 µL 溶液缓冲液和 4 µL 荧光试剂，并充分混匀。

取190微升工作液分别加入两支检测管中，另取197微升加入一支检测管中。向含有190微升工作液的各检测管中分别加入10微升已知DNA浓度的标准品，向含有197微升工作液的检测管中加入3微升制备好的文库。短暂涡旋振荡后，在台式离心机上离心。

使用荧光计在3 µL设置下定量DNA。对DNA文库进行测序。根据制造商的说明书制备测序文库。

按照制造商的说明书，将试剂盒和流动池安装到测序仪中，并输入测序运行信息。启动测序。代表性结果。

在高质量DNA提取过程中，污染物的暴露仍然是本方案中的关键问题。为了直观地检测是否存在污染物，我们将缓步动物置于抗生素（青霉素和链霉素）中孵育，并在500倍显微镜下观察个体。如图所示，缓步动物周围的可见微生物已被完全清除。

在完成高效的匀浆、DNA提取、片段化和文库构建后，使用高灵敏度电泳对文库的片段大小分布进行质量检测。紫色和绿色线条分别表示1,500和25个碱基对的上下标记。

泳道 L 为 DNA 标准 Marker，泳道 S 和 N1 至 N4 是同一实验的五个重复，均起始于单个缓步动物样本。从 200 至 1,000 个碱基对之间宽广且均匀的条带分布可以看出，即使起始样本量极低，本实验方案仍具有高度可重复性。以下是来自单次测序运行所获得的同步化 reads 的快速质控结果。

测序读段以300个碱基对的成对末端形式获得，其中正向读段和反向读段分别显示在上方和下方。此处显示的分布是300碱基对成对末端读段的典型特征，在前200个碱基对中碱基识别质量非常高（Q30以上），随后质量逐渐下降至末端。因此，该方法每个样本仅使用单一个体。

无需像以往的缓步动物基因组测序项目那样使用大量动物样本。目前大多数缓步动物的培养方法尚未建立。因此，能够直接对单个个体（例如野外采集的个体）进行基因组测序，将对缓步动物的分子生物学研究产生重大影响，也可能惠及其他小型动物的研究。

我们的DNA测序方法使得分析其他大量尚未测序的微生物成为可能，例如稀有的独活草物种、线虫、水杉以及其他生物，通过连接部分区域与更广泛的公共区域，进一步拓展了各种生物学机制可能发生的研究环境。