研究鸡胚胎组织发育的器官型培养方法

本实验方案的总体目标是提供一种体外环境，以获取鸡胚眼睛，从而深入研究胚胎中复杂发育通路。在鸡胚中，由于眼睑发育、胚胎运动以及胚外组织的生长，对眼睛的研究往往较为困难。药物和抑制剂等化合物还可能对胚胎产生致死效应，使得利用这些化合物调控基因通路变得困难。

体外组织培养技术的进步使科学家能够分离这些组织，并克服上述诸多障碍。本方案的优势在于，能够以整体方式研究眼睛，包括在发育过程中可能相互作用的所有组织，例如神经视网膜和视网膜色素上皮。开始实验前，先对材料进行高压灭菌，以确保所有溶液和设备在操作前均处于无菌状态。

为此，将两升蒸馏水和一升鸡生理盐水与一盒组织、半透性滤纸、金属网、盛水容器以及一次性玻璃移液管一同进行高压灭菌。使用70%乙醇彻底消毒培养箱的搁板和门，然后用高压灭菌过的蒸馏水填充容器，并将培养箱预热至37°C。同时在培养箱中预热营养培养基以及一支青霉素-链霉素抗生素溶液管。

在工作区域铺上纸巾，并用70%乙醇消毒。对所有镊子和剪刀进行灭菌。将鸡头置于灭菌的鸡生理盐水中，沿中线切开鸡头，但保留每只眼睛周围的部分组织完整。

多余的组织将有助于眼球在培养过程中保持一定的张力，同时促进营养物质在整个眼球中的吸收，并防止眼球从滤纸上滑落。这些组织在后续分析中定位眼球方向时也可作为解剖标志。在准备培养时，将已解剖的组织置于室温的鸡生理盐水中。

准备培养皿。将两个35毫米的培养皿放入一个100毫米的培养皿中。在每个小培养皿中放置一个金属网支架。

将带有眼睛的半头放置在滤纸片上，略微倾斜，以确保眼睛不会从纸上滑落。将组织和滤纸一起转移到置于金属网架上的小型培养皿中。对同一胚胎的另半头重复上述操作。

向两个小培养皿中分别加入培养基。将培养基加至与滤纸齐平的位置，切勿将滤纸完全浸入培养基中。

向每皿培养基中加入 50 微升抗生素青霉素-链霉素储备液，以防止细菌污染。将一小片折叠的薄纸巾置于较大培养皿的内侧边缘，并用蒸馏水润湿。将培养物置于 37 摄氏度的黑暗培养箱中培养最多四天。

培养后，将组织从滤纸上取下，并用4%多聚甲醛固定。第一列显示的是HH34期的眼，代表培养开始时的鸡胚眼睛。第二列显示的是从HH34期开始培养四天后的鸡胚眼睛。

第三列显示的是HH38期的眼部结构，相当于在HH34期基础上继续在卵内发育四天。A至F图未进行染色，而G至I图则进行了碱性磷酸酶酶染色。最上方一行（图A至C）显示，眼睛在培养过程中持续发育，表现为羽毛芽的出现以及眼睑的生长，图中箭头指示了这些结构。

中间一行（D至F图）显示，结膜乳头在培养过程中开始退化。最下面一行（G至I图）表明，巩膜骨片诱导的时空模式在培养中得以维持，这为可通过该方法研究的发育通路提供了一个实例。本方案使得组织在整个培养期间能够保持发育过程中的关键空间和时间特征。

该方案代表了全感官器官培养领域的一项关键进展，为研究其中复杂的发育通路提供了替代性方法。