Name: 脊髓培养法研究胚胎鸡组织的发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 了解器官型培养法研究胚胎鸡眼部发育的方法。该技术可在体外环境中分离神经视网膜与视网膜色素上皮，深入分析复杂发育通路，为发育生物学研究提供重要平台。

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作者感谢 Gregory Haller（Mount Saint Vincent University）在本实验方案开发初期所做的工作。作者还感谢 Nicholas Jones（Mount Saint Vincent University）在手稿的音视频部分拍摄与制作过程中提供的专业技术支持与协助。Daniel Andrews 的研究得到了 Mount Saint Vincent University 和加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）的资金支持。 通过 一名本科生研究奖获得者。塔玛拉·A·弗兰兹-奥登达尔尔（Tamara A. Franz-Odendaal）由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现基金资助。

注意：对于胚胎发育阶段，请使用 Hamburger 和 Hamilton12（HH）分期表。
1. 胚胎孵育
<ol>
	<li>将受精的鸡卵置于无菌、温度可控的孵育箱中，在 37 °C ± 1 °C 和约 40% 湿度条件下孵育。</li>
	<li>每天翻卵 1 次，并继续孵育至 HH34 期（受精后 8 天）。</li>
</ol>
2. 材料的准备与灭菌
<ol>
	<li>准备12个胚胎所需材料：将2 L蒸馏水、1 L 0.85%鸡生理盐水、12根玻璃移液管、1盒纸巾、24片2.5 cm × 2.5 cm的半透性滤纸以及24片2.5 cm × 2.5 cm、边缘向下弯曲的钢丝网，在121 °C条件下高压灭菌至少15分钟。 
	注意：上述材料的高压灭菌可提前进行。</li>
	<li>使用70%乙醇擦拭培养箱的内壁、搁板和门，对培养箱进行消毒。在培养箱内放置两个装有已灭菌蒸馏水的塑料容器以维持湿度。将培养箱预热至37 °C ± 1 °C，相对湿度约为40%。确保培养箱内部完全避光；若箱门透明，需用锡箔纸覆盖。</li>
	<li>将100 mL营养培养基和1 mL青霉素置于培养箱中预热。</li>
	<li>在实验台面上铺上纸巾，并用70%乙醇喷洒台面以进行消毒。同样使用70%乙醇对两对镊子、解剖剪刀、剃刀刀片和一把塑料勺进行灭菌处理。</li>
	<li>将12个无菌的100 mm培养皿和24个无菌的35 mm培养皿放置于实验台面上备用。确保这些培养皿在使用前始终保存在无菌袋中。</li>
</ol>
3. 胚胎制备
注意：从此时起，需佩戴防护性防尘口罩，以避免污染培养物。细菌或真菌感染会破坏培养，并存在迅速扩散至培养箱中所有培养物的风险。
<ol>
	<li>敲开鸡蛋，将胚胎转移至含有0.85%鸡生理盐水的100 mm培养皿中。根据Hamburger和Hamilton分期指南12中描述的解剖特征对胚胎进行分期，并确认胚胎处于HH34期。</li>
	<li>切开胚胎颈部，然后使用无菌剃刀刀片沿中线将头部一分为二。用无菌镊子取出脑组织，保留喙部完整。</li>
</ol>
4. 培养体系的建立
<ol>
	<li>将两个35 mm培养皿放入一个100 mm培养皿中。</li>
	<li>在每个35 mm培养皿内放置一片钢丝网。</li>
	<li>使用镊子将一个已切开的头部组织转移至一张2.5 cm × 2.5 cm的半透性滤纸上，确保眼部朝上。可轻微倾斜滤纸，以确保组织固定稳妥，不会滑落。</li>
	<li>使用镊子小心地将带有滤纸的眼部组织放置于其中一个35 mm培养皿内的钢丝网上，形成一个眼部组织位于上方的抬高平台。</li>
	<li>对另一个半头重复步骤4.3和4.4。</li>
	<li>使用无菌玻璃移液管，小心地将营养培养基直接加入每个35 mm培养皿中，直至液面达到滤纸水平。切勿将半头组织完全浸入营养培养基中。</li>
	<li>向每个培养皿的营养培养基中加入50 µL的10,000 U/mL青霉素-链霉素溶液。</li>
	<li>将一张滤纸折叠成小方块，放入100 mm培养皿内，并用高压灭菌的蒸馏水润湿。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C ± 1 °C、相对湿度约40%的无菌、避光培养箱中，培养时间最长可达4天。</li>
	<li>对每个胚胎重复步骤3和4。 
	注意：所需胚胎数量取决于具体实验；此处以12个胚胎为例描述实验方案。</li>
</ol>
5. 培养物的维持
<ol>
	<li>每天一次，向培养箱中的塑料容器补充新鲜的、经高压灭菌的蒸馏水。</li>
	<li>每天检查所有培养物是否存在细菌或真菌污染。若培养物已解体或培养基颜色发生改变，则表明已被污染。丢弃所有受污染的培养物。</li>
</ol>
6. 固定
<ol>
	<li>培养结束后，将所有培养皿从培养箱中取出。</li>
	<li>使用一对镊子，轻轻将眼球从滤纸上取下，注意避免撕裂组织。</li>
	<li>将眼球组织在4%多聚甲醛（溶于1×磷酸盐缓冲液）中于4 °C固定过夜，或在10%中性缓冲福尔马林中室温固定过夜。</li>
	<li>将组织保存在4 °C的1×磷酸盐缓冲液中。</li>
</ol>

<ol><li>Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18855894">Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus.</a> Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).</li>
<li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+motor+proteins+in+echinoderm+embryos%3A+an+argument+in+support+of+antibody+inhibition+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).</li>
<li>Horakova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+FGFR+inhibitors+on+chicken+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development.</a> Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).</li>
<li>Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbead+Implantation+in+the+Zebrafish+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52943(2015).</li>
<li>Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Embryonic+Chick+Eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Embryonic Chick Eyes.</a> Bio-protocol. 5 (12), e1498(2015).</li>
<li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+organ+culture+of+embryonic+chick+femora%3A+a+system+for+investigating+bone+and+cartilage+formation+at+an+intermediate+level+of+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).</li>
<li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+inhibitory+action+of+BMPs+and+their+relationships+with+activators+in+feather+formation%3A+implications+for+periodic+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning.</a> Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).</li>
<li>McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+Hedgehog+functions+by+localizing+the+region+of+proliferation+in+early+developing+feather+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds.</a> Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).</li>
<li>Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+take+on+an+old+story%3A+chick+limb+organ+culture+for+skeletal+niche+development+and+regenerative+medicine+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation.</a> European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Spermatogenesis+in+Explanted+Adult+Mouse+Testis+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues.</a> PLoS One. 10 (6), e0130171(2015).</li>
<li>Ochoa-Villarreal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+culture+strategies+for+the+production+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Plant cell culture strategies for the production of natural products.</a> BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4380223/">The developmental biology of feather follicles.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).</li>
<li>Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+cellular+dynamics+during+the+development+of+intramembranous+bones%3A+the+scleral+ossicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles.</a> Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li>
<li>Pinto, C. B., Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+understanding+of+the+epithelial+requirement+for+osteogenesis+in+scleral+mesenchyme+of+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).</li>
<li>Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).</li>
<li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), e306(2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案利用成熟的组织培养技术，实现从鸡胚第8天（HH34）开始的眼组织生长 体外 培养4天。这种网格培养法最初由Trowell描述15我们优化了Pinto和Hall在1991年研究中提出的实验方案16 利用带有网格的半透膜研究胚胎鸡眼分离组织层之间的诱导信号15. 采用该方法，Roach 培养了14日龄鸡的股骨6该方法在小鼠组织的培养中也已证明有效6,17滤纸的使用对该实验方案的成功至关重要，因为它有助于组织有效吸收培养基中的营养物质，同时避免组织被过度浸润或浸泡。
营养液的pH值适宜对细胞的最佳生长至关重要。培养基的pH值应处于或接近生理pH值，使用酚红作为培养基中的指示剂具有优势，因为pH的变化可以被轻易检测。可使用无血清培养基，无需每日更换培养基，且不会...

鸡胚胎（Gallus gallus）是一种在生物学领域中广泛使用的优秀模式生物。其孵化期约为21天，且可同时孵化大量卵，使实验过程快速而高效。或许最重要的是，该胚胎易于操作，便于深入研究关键的发育过程以及驱动这些过程的基因和蛋白质。
鸡胚胎的眼睛是一个复杂的器官，其发育过程与其他许多身体系统类似，依赖多种不同组织之间的相互作用。via 该方法可实现对这些组织发育过程的研究，尤其适用于发育较晚期阶段的观察。例如，多层结构的视网膜可能对神经系统发育研究者具有特别意义。其他可用来研究角膜、玻璃体、晶状体、巩膜以及眼睑等眼部组织的替代方法，也对科研人员具有重要价值。鸡胚胎眼内还包含一系列扁平骨结构，即巩膜骨小骨（scleral ossicles），可作为研究脊椎动物膜内成骨诱导及骨化过程的模型1。
目前，有多种方法可用于研究胚胎发育。通过显微注射抑制性抗体或其他抑制性分子2,3、植入经抑制剂浸泡的微型珠粒4，以及电穿孔技术5，均可用于下调胚胎中特定基因或蛋白的表达。类似的方法也可用于上调蛋白表达。然而，这些方法均存在一定的局限性。例如，当使用化学物质干预胚胎发育时，必须评估其对胚胎的致死效应，因此上述方法的应用通常局限于局部区域，且剂量需控制在足以保证胚胎存活的低水平。
体外组织&#160;培养已被广泛应用于多种生物体以研究发育过程，并可用于克服前述部分局限性。例如，鸡的股骨6、羽毛芽7,8和四肢9均已通过组织培养方法进行了研究，小鼠的睾丸10以及植物的根和茎11 likewise 如此。这些方法使科研人员能够高度控制组织发育过程，例如调节温度和改变营养物质的可利用性。将组织从完整胚胎中分离出来后，其对化学物质的致死效应也显著降低，从而可在更高浓度下进行大规模的操作研究。体外培养的另一个显著优势在于能够维持组织的细胞微环境；组织的排列结构相对保持不变，使得研究不同类型组织之间的相互作用成为可能9。因此，体外培养为那些在体内或卵内模型中无法实现的实验方法开辟了新的途径。
目前，利用化学物质研究鸡胚眼睛的发育过程极具挑战性。由于有多种胚外膜覆盖胚胎，难以施加微珠或化学物质；随着胚胎在蛋内逐渐发育，其活动性也显著增强，这进一步加大了本已困难的操作难度。本方案可便捷地接触眼睛及其周围组织，消除了上述障碍，同时为研究眼内发育过程提供了新的机会。该方案的建立旨在研究胚胎眼内巩膜骨片的诱导过程。

<table><tbody><tr><td>35 mm 细胞培养培养皿</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>易握型组织培养皿，聚苯乙烯材质，无热原</td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养培养皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>组织培养皿，聚苯乙烯材质，无热原</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Kimtech Science 品牌任务擦拭纸，每箱 280 张</td></tr><tr><td>金属网</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>不锈钢金属网（网格尺寸 0.7 mm）</td></tr><tr><td>一次性玻璃移液管</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>硼硅酸盐玻璃一次性 5 3/4&quot;</td></tr><tr><td>营养培养基</td><td>Gibco</td><td>12591-038</td><td>Fitton-Jackson 改良型，含 L-谷氨酰胺和酚红（BGJB）</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>10000 单位/mL 青霉素-链霉素稳定溶液</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>1454 090</td><td>半透性滤纸，直径 90 mm</td></tr><tr><td>受精鸡胚</td><td>达尔豪西大学农学院</td><td>n/a</td><td>可从本地农场获取</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>EMD</td><td>SX0420-3</td><td>氯化钠晶体，试剂级</td></tr><tr><td>1 L 玻璃瓶</td><td>VWR</td><td>89000-240</td><td>1 L 耐热玻璃可高压灭菌瓶</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>菲舍尔科技</td><td>BP82011</td><td>70% 分子生物学级</td></tr><tr><td>塑料密封盒</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>市售并用乙醇灭菌</td></tr><tr><td>一次性剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>单刃工业剃须刀片（外科级碳钢）</td></tr><tr><td>塑料勺</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>市售并用乙醇灭菌</td></tr><tr><td>防尘口罩</td><td>3M</td><td>n/a</td><td>3M 8500 舒适型口罩</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>多聚甲醛，试剂级，结晶状</td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林</td><td>菲舍尔科技</td><td>72210</td><td>10% 中性缓冲福尔马林</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>10X 磷酸盐缓冲液，pH 7.4（137 mM NaCl，2.5 mM KCl，4.3 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.4 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td>预灭菌离心管</td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>n/a</td><td>精细镊子</td></tr><tr><td>鸡生理盐水&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>n/a&amp;nbsp;</td><td>0.85% NaCl</td></tr><tr><td>锡箔纸</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>市售</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>市售</td></tr></tbody></table>

研究鸡胚胎组织发育的器官型培养方法

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

鸡胚胎通常被用作研究脊椎动物发育的一种可靠模式生物。由于其易于操作且孵化周期较短，非常适合开展实验研究。目前，对鸡胚胎中这些发育通路的研究通常通过多种方法，在局部位点以低浓度施加抑制剂和药物来实现。体外组织&#160;培养是一种使组织在脱离宿主生物体的情况下进行研究的技术，同时可规避使用完整胚胎时存在的诸多物理限制，例如胚胎对可能致命的高剂量化学物质的敏感性。本文介绍了一种鸡胚胎半侧头部的器官型体外培养方案，为超越现有方法进一步探究发育过程提供了新的机会。

利用该方法，可将鸡胚胎眼睛从发育第8天（HH34）开始进行体外培养 体外 4天。4天的 在卵内 发育阶段对应 HH38。
该培养方法可支持眼周及眼睑上羽毛芽的发育（图1B。这些羽毛芽不存在 在卵内 在培养前的HH34期图1A），表明羽毛芽的发育是在培养期间启动的，与体内情况一致 在卵内13 (图1C）。在培养过程中，眼睑和瞬膜逐渐生长以覆盖眼球。图1B). 眼睑在之后显得更加成熟 体外 培养至HH34阶段时的培养情况相较于培养初期<strong c...

本文介绍了一种用于培养鸡胚胎器官的器官型培养方案 体外 利用该方法可在高度控制培养环境的条件下研究鸡胚胎组织的发育过程。

鸡胚胎常被用作研究脊椎动物发育的可靠模式生物。其易于获取且孵化周期短，使得……

本实验方案的总体目标是提供一种体外环境，以获取鸡胚胎的眼睛组织，从而深入研究胚胎中复杂发育通路。在鸡胚胎中，由于眼睑发育、胚胎活动以及胚外组织的生长，对眼睛的研究往往较为困难。此外，药物和抑制剂等化合物可能对胚胎产生致死效应，因此难以利用这些化合物来调控基因通路。体外组织培养技术的进步使科学家能够分离这些组织，并消除上述诸多障碍。本方案的优势在于，能够以整体视角研究眼球，包括在发育过程中可能相互作用的所有组织，例如神经视网膜和视网膜色素上皮。首先对材料进行高压灭菌，以确保所有溶液和器械在操作前均处于无菌状态。为此，将两升蒸馏水和一升鸡生理盐水连同一盒纸巾、半透性滤纸、金属网、盛水容器以及一次性玻璃移液管一同高压灭菌。使用70%乙醇彻底消毒培养箱的隔板和门，然后用高压灭菌过的蒸馏水填充容器，并将培养箱预热至37摄氏度。同时在培养箱中预热营养培养基以及一支青霉素-链霉素抗生素溶液。在工作区域铺上一张纸巾，并用70%乙醇消毒。对所有镊子和剪刀进行灭菌。将鸡头置于灭菌的鸡生理盐水中，沿中线切开鸡头，但保留每只眼睛周围的部分组织完整。多余的组织有助于眼睛在培养过程中保持一定的张力，同时促进营养物质在整个眼球中的吸收，并防止眼球从滤纸上滑落。这些组织在后续分析中定位眼球方向时也可作为解剖标志。在准备培养前，将解剖好的组织置于室温的鸡生理盐水中。准备培养皿。将两个35毫米的培养皿放入一个100毫米的培养皿中。在每个小培养皿中各放置一个金属网载物台。将带有眼睛的半头放置在滤纸片上，略微倾斜，以确保眼睛不会从纸上滑落。将组织和滤纸一起转移至金属网架上方的小培养皿中。对同一胚胎的另一侧半头重复上述操作。向两个小培养皿中分别加入培养基，使培养基液面升至滤纸水平，但不要将滤纸浸没在培养基中。向每个培养皿中的营养培养基加入 50 µL 抗生素青霉素-链霉素储备液，以防止细菌污染。在较大培养皿的内侧边缘放置一片折叠的薄纸巾，并用蒸馏水润湿。将培养物置于 37 °C 黑暗培养箱中孵育，最长不超过四天。培养后，将组织从滤纸上取下，并用4%多聚甲醛固定。第一列显示的是HH34期的眼，代表培养开始时的鸡胚眼睛。第二列显示的是从HH34期开始培养四天后的鸡胚眼睛。第三列显示的是HH38期的眼部结构，相当于在HH34期基础上继续在胚内培养发育四天。图A至图F未进行染色，而图G至图I则进行了碱性磷酸酶染色。最上方一行（图A至图C）显示，眼部在培养过程中持续发育，表现为羽毛芽的出现以及眼睑的生长，图中各面板中的箭头指示了这些结构。中间一行（D至F图）显示，结膜乳头在培养过程中开始退化。底部一行（G至I图）显示，巩膜骨片诱导的时空模式在培养中得以维持，表明该方法可用于研究特定的发育通路。本方案使组织在整个培养过程中保持发育过程中的关键空间和时间特征。该方案代表了全感觉器官培养领域的一项关键进展，为研究其

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

脊髓培养法研究胚胎鸡组织的发展

体外培养早期鸡胚的方法（新培养法）

本文介绍了一种简单的技术，可用于实现禽类胚胎的长期体外培养。ex-ovo...

一种适用于成像与显微手术应用的ex-ovo鸡胚培养系统

本文介绍了早期鸡胚的表面标记及ex...

追踪早期鸡胚中的形态发生组织形变

利用组织切片培养可通过对基因和药物的干预来调控胚胎发育。然而，培养条件必须确保在切片的简化环境中仍能进行正常的发育过程。本文展示了一种可支持脊髓正常发育至少持续24小时的实验方案。...

鸡胚脊髓切片培养方案

细胞培养模型能够对环境条件进行精确控制，因此为阐明神经元细胞生物学的诸多方面提供了一个强大的平台。我们描述了一种快速、经济且可靠的方法，用于从鸡胚中分离、解离和培养感觉神经元。本文还提供了基质制备和免疫细胞化学的详细步骤。...

从鸡胚中分离和培养离解的感觉神经元

在发育过程中观察和接触鸡胚具有一定的挑战性。我们开发了一种简单、经济的体外培养（ex ovo）方法，可广泛应用于课堂教学或科研环境。该方法能够使研究者在胚胎发育的较晚阶段（HH...

优化的 体外培养 培养鸡胚胎至发育的较晚阶段

本文结合新型技术，对经典的鹌鹑-鸡嵌合体系统进行了更新，以研究器官形成。 体外 和 在卵内 实验步骤...

探索鸟类模型中器官形成的早期和晚期阶段的两步法：胸腺与甲状旁腺器官发生范式

本文提供了一种从鹌鹑和鸡胚胎中分离纯胚胎组织的方法，这些组织可被组合以形成体外嵌合器官。...

以胸腺为例的胚胎组织分离及鹌鹑-鸡嵌合器官的构建

重组肢体是一种强大的实验模型，可用于研究在胚胎信号影响下细胞分化及模式形成的过程。本方案介绍了一种利用鸡肢芽中胚层细胞生成重组肢体的详细方法，该方法可适用于从不同生物体获得的其他细胞类型。...

鸡胚胎重组肢体实验：解析形态发生、模式形成及细胞分化早期过程

本文介绍了一种将肾类器官移植到鸡胚体腔的详细方案。该方法可在8天内诱导类器官的血管化并促进其进一步成熟，可用于高效研究这些过程。...

通过鸡胚体内移植实现肾类器官的有效血管化

本文介绍了三种禽类胚胎皮肤外植体培养的实验方案，可用于研究组织间的相互作用、4D成像延时电影（三维加时间）、分子功能的全局或局部干扰，以及系统生物学表征。...

利用禽类皮肤外植体研究组织模式形成与器官发生

了解器官型培养法研究胚胎鸡眼部发育的方法。该技术可在体外环境中分离神经视网膜与视网膜色素上皮，深入分析复杂发育通路，为发育生物学研究提供重要平台。

研究鸡胚胎组织发育的器官型培养方法

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