Name: 小鼠急性心肌梗死的实时压力容积分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学习在小鼠急性心肌梗死模型中进行实时压力容积分析的方法。该技术通过左心室导管插入术实现先进血流动力学表征，帮助研究人员识别早期心脏保护机制并评估缺血再灌注期间的心功能变化。

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作者感谢以下资助来源：Else Kröner-Fresenius-Stiftung（Tienush Rassaf）；Hans und Gertie Fischer Stiftung（Tienush Rassaf）；德国杜伊斯堡-埃森大学医学院资助项目（Tienush Rassaf、Lars Michel）；Ernst- und Berta Grimmke-Stiftung（Christos Rammos）。

所有实验均按照相关法规进行并符合其要求&#160;（《用于实验和其他科学目的的脊椎动物保护欧洲公约》（指令 2010/63/EU）），动物护理遵循机构指南。所有实验均使用6月龄的雄性C57BL/6JRj小鼠进行。
1. 准备
<ol>
	<li>准备手术显微镜、加热垫以及用于监测体温的直肠探针。清洁并灭菌所有手术器械。</li>
	<li>准备2根10 cm长的5-0丝线用于血管结扎，1根5 cm长的6-0聚丙烯线，以及一段2 mm硅胶管用于左冠状动脉（LCA）结扎。</li>
	<li>将PV导管校准比色皿预热至37 °C，并准备一支装有100 µL含15%氯化钠（NaCl）的H2O 用于生理盐水校准。</li>
	<li>将PV导管（3 cm，1.4 F）置于37 °C预热的0.9% NaCl溶液中2在测量前至少30分钟给予生理盐水。将导管连接至数据采集装置，并将该装置连接至模拟/数字转换器。将两个设备均连接至计算机。</li>
	<li>设置软件。根据软件引导的工作流程，进行软件指导下的压力校准和导纳校准8.</li>
</ol>
2. 麻醉与镇痛
<ol>
	<li>使用氯胺酮（100 mg/kg 体重）和盐酸赛拉嗪（10 mg/kg 体重）通过腹腔注射麻醉小鼠。在缺血/再灌注（I/R）手术开始时，腹腔注射0.05 mg/kg 体重的丁丙诺啡以维持镇痛。</li>
	<li>10分钟后，使用20 G静脉（iv）导管进行气管插管，并以40%氧气（O₂） ventilate 小鼠。2）和 2%（v/v）异氟烷。设定适当的通气参数（例如， 220 µL 搏出量，150 次/分钟，适用于 25–30 g 的 C57BL/6JRj 小鼠。</li>
	<li>持续监测体温 通过 直肠探头。将小鼠固定在加热板上，头部朝向操作者。&#160;小鼠正常体温为36.5 - 38 °C。通过调节加热板温度，将体温维持在正常范围1度以内。</li>
</ol>
3. 左心室导管插入术
<ol>
	<li>消毒胸部和颈部&#160;用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭三次。&#160; 等待皮肤消毒剂干燥。&#160;使用小型动物剃毛系统去除胸部毛发。&#160;</li>
	<li>使用小型手术剪在下唇下方5 mm处向胸骨方向做一条10 mm的纵向正中切口。</li>
	<li>分离下颌下腺的左侧和右侧部分 通过 使用镊子进行钝性分离。在右侧气管旁区域分离肌肉和脂肪组织，暴露右侧颈总动脉。用弯头镊子沿血管小心进行钝性分离，将血管从周围结缔组织中游离出来，分离长度为5–10 mm。 
	注意：应始终避免对迷走神经或颈动脉体进行机械操作，因为这可能导致严重的低血压和心动过缓。</li>
	<li>将两条已准备好的丝线从血管下方穿过。用紧结结扎远端血管，并在近端暴露区域打一个松结，松结应保持足够宽松以允许导管通过。</li>
	<li>将颅侧（紧侧）结的线头固定在小鼠头部附近，对血管施加轻微张力，以利于导管插入。在近端血管的松结近心侧放置一把止血血管夹，以可逆地阻断血流。</li>
	<li>用显微剪刀在颅侧结扎结近端1 mm处作楔形切口以打开血管。 
	注意：出现少量血滴表明此步骤操作正确。</li>
	<li>小心插入导管10 mm。开始记录导管数据。 
	注意：用镊子拉伸切口可使此过程更容易。</li>
	<li>取出血管夹。在切口处加入1至2滴生理盐水，以利于导管移动。继续插入导管约10 mm。当传感器尖端通过近端结扎线后，小心收紧结扎线，力度以足以防止血液沿导管较细部分反流，同时不阻碍导管移动为宜。 
	注意：导管尖端传感器的尺寸可防止在取出血管夹时发生血液反流。</li>
	<li>轻柔地继续插入导管，直至压力分析显示动脉血压波形，表明导管已放置于主动脉内（图3A). 
	注意：导管到达主动脉瓣时，会表现出轻微阻力以及与脉搏同步的导管运动。</li>
	<li>当通过主动脉瓣遇到阻力时，将导管回撤5 mm后再次前进，直至左心室插管成功；左心室插管成功的指征是压力-容积（PV）分析发生变化，舒张压达到0–20 mmHg图3B）。注意观察容积监测的变化，以进一步确认传感器尖端位于左心室图3C。将近端结扎得更紧，以防止导管移动。</li>
</ol>
4. 缺血/再灌注手术
<ol>
	<li>从胸骨下端向左侧腋窝做皮肤切口，总长度为15 mm。随后钝性分离两层肌肉，直至可见肋骨。</li>
	<li>打开胸腔 通过 在左侧第三与第四肋骨之间做切口。使用手术钩暴露心包。切除心脏上方的心包组织。在继续进行左冠状动脉前降支（LCA）结扎前，保持30秒不触碰动物，以记录用于有效分析的压力-容积（PV）数据。</li>
	<li>定位左心耳下方出现并沿心脏左侧向心尖走行的左冠状动脉。使用6-0聚丙烯缝线，在左心耳下方2 mm处环绕该动脉打一结扎环。将一小段硅胶管置于结扎环下方，然后在其上方打紧结。 
	注意：远端心肌变为灰色可作为左冠状动脉结扎成功的阳性对照6I/R 手术应由操作研究人员独立完成，且手术时间应在 5 min 内。</li>
	<li>将缝线剪至1毫米长度。松开手术钩，手动闭合切口上方的肌层。持续记录PV数据，等待45分钟。</li>
	<li>45分钟后，重新打开切口并移除硅胶管以诱导再灌注。继续记录数据20分钟。 
	注意：再灌注成功的标志是缺血前观察到的颜色变为红色。</li>
</ol>
5. 校准
注意：PV 导管系统的校准包括 4 个必要步骤，其中两个步骤必须在测量完成后进行。每次实验后都应重复校准，以确保结果的有效性。
<ol>
	<li>在实验前按照步骤1.5所述进行压力校准和电导校准。</li>
	<li>实验结束后，当导管仍置于左心室时进行生理盐水校准。在已备好的区域中定位颈总动脉外侧的右颈静脉。注入10 µL 25% NaCl溶液2O 通过 使用 Hamilton 注射器记录数据。</li>
	<li>使用采集软件，通过在容积曲线上选择上升相来计算校准图5C）。重复此步骤共3次。在注射器抽出后，使用血管夹迅速夹闭穿刺部位，以避免血液流失。</li>
	<li>进行体积校准，通过分析标准体积来校准体积数据采集。使用经轻微肝素化的1 mL注射器经心脏穿刺获取约500 µL小鼠血液。例如，每200 IE肝素使用5 µL。回撤门静脉导管10 - 15 mm，以避免损伤导管。</li>
	<li>将获取的血液注入已预热至37 °C的校准比色皿中（图5A）。避免产生气泡，以免干扰实验结果。将导管尖端插入每个孔中并记录数据。通过软件引导分析获得标准曲线（图5B重复该过程，共计3次。</li>
	<li>在持续维持足够异氟烷麻醉的条件下，通过放血或颈椎脱臼法处死小鼠。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>完成校准步骤后，按照软件引导进行数据分析。因此，在PV Workflow的分析部分中选中适当区间（至少十个心动周期），并执行基线分析。如有必要，排除因通气或操作干扰导致异常的周期（图3D）。</li>
	<li>在主动脉瓣通过前（仅动脉压）、左前降支冠状动脉（LCA）阻塞前即刻及阻塞后即刻进行PV基线分析。随后在缺血期间及再灌注后每5分钟进行一次PV基线分析。实验结束时，在导管从左心室撤出后对压力数据进行分析（动脉压）。</li>
	<li>分析至少连续10个心动周期，以避免采样误差。若获得的数据受到通气强烈干扰，可考虑暂时中断通气，最长不超过5秒。</li>
	<li>使用基线分析中计算的以下参数（图3D）来评估左心室功能：
	<ol>
		<li>每搏输出量（µL）</li>
		<li>射血分数：每搏输出量 / 舒张末期容积（%）</li>
		<li>心输出量：每搏输出量 × 心率（µL/min）</li>
		<li>心脏指数：心输出量 / 体表面积（µL/(min·cm²)）</li>
		<li>每搏功：压力-容积环的内面积（mmHg·µL）</li>
		<li>最大压力（Pmax）；平均压力（Pmean）</li>
		<li>max dP/dt（mmHg/s），用于评估左心室收缩功能</li>
		<li>min dP/dt（mmHg/s），用于评估左心室顺应性</li>
		<li>等容舒张时间常数：Tau（ms）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sanchis-Gomar, F., Perez-Quilis, C., Leischik, R., Lucia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+coronary+heart+disease+and+acute+coronary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of coronary heart disease and acute coronary syndrome.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (13), 256(2016).</li>
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<li>Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Langendorff+perfused+isolated+mouse+heart+model+of+global+ischemia-reperfusion+injury%3A+Impact+of+ischemia+and+reperfusion+length+on+infarct+size+and+LDH+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: Impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).</li>
<li>Task Force on the management of ST-segment elevation acute myocardial infarction of the European Society of Cardiology (ESC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation.</a> European Heart Journal. 33 (20), 2569-2619 (2012).</li>
<li>Shigemitsu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction+due+to+left+main+coronary+artery+occlusion.+Therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction due to left main coronary artery occlusion. Therapeutic strategy.</a> Japanese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 50 (4), 146-151 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

急性心肌梗死中左心室血流动力学的PV监测是一种用于实时评估的新方法 体内 评估心源性休克及缺血/再灌注损伤中左心室功能障碍。压力-容积（PV）导管检查可提供关于左心室收缩与舒张功能的广泛参数。除通常通过超声心动图或磁共振成像获得的左心室容积参数（心腔容积、射血分数、每搏输出量和心输出量）外，PV分析还能通过同步提供左心室收缩性能指标（收缩力dP/dt、每搏功）和左心室顺应性指标（-dP/dt、Tau）作为舒张功能参数，从而更全面地评估左心室功能。
由于急性心肌梗死患者发生急性心力衰竭是院内早期发病和死亡的重要预测指标2，在实验条件下监测急性心肌梗死中的急性血流动力学损害和心源性休克，可作为识别潜在保护机制的有价值工具。
多个因素被证明对成功获取数据至关重要。稳定的麻醉对于获得有效的压力-容积（PV）数据尤为关键，因为异氟烷具有显著的心脏抑制作用，可导致血压、左心室射血分数（LV EF）和每搏输出量下降。颈动脉的无创性准备对于避免因失血导致的低血容量至关重要。此外...

心血管疾病是西方文明中最常见的死亡原因1急性心肌梗死是一种危重事件，与较高的急性和慢性死亡率相关2即使实现了再血管化 通过 急诊经皮冠状动脉介入治疗（PCI）后，急性心肌梗死患者的死亡率仍然较高，尤其是在症状发作后的前48小时内3由左心室（LV）功能急性下降所致的心源性休克是这些患者院内死亡的主要原因3这种左心室功能的早期下降是由缺血及再灌注后心肌损伤引起的。这种所谓的缺血/再灌注（I/R）损伤由细胞代谢组的改变所介导，例如活性氧物质的过度生成。4,5.
为了在临床前研究中探索可能的保护机制以减少心肌损伤，需要可靠的鼠类模型，包括评估缺血/再灌注（I/R）后左心室（LV）功能的方法6。在此背景下，经胸超声心动图7和磁共振成像（MRI）6被广泛用于功能表型分析8,9。然而，这些方法不适用于正在发生的急性心肌梗死过程中对严重左心室功能障碍和心源性休克的评估，且无法直接提供左心室压力数据。利用离体心脏进行体外（ex vivo）实验的朗根多夫（Langendorff）装置可提供有关早期缺血/再灌注损伤病理机制的信息10。但由于该方法无法重现体内（in vivo）的适应性机制，例如自主神经系统调节、激素调节以及酸碱稳态，因而存在局限性。目前尚无可用的方法能够对持续发生的心肌缺血/再灌注损伤期间的心源性休克和左心室功能障碍进行全面的功能表型分析。
结合压力-容积（PV）导管术与短暂外科左主冠状动脉（LCA）阻断的同步化方法可能具有优势，但在技术上具有挑战性。在缺血/再灌注（I/R）损伤期间维持稳定的外部心脏血流动力学对于获得有效结果至关重要，因为不稳定的麻醉或失血可能显著影响实验结果。一种用于I/R损伤血流动力学表型分析的新方法 通过 左心室压力-容积导管插入术与左冠状动脉前降支短暂阻断可为急性心肌梗死所致心源性休克及左心室功能障碍提供新的研究视角，并可作为未来心肌保护研究的分析方法。

<table><tbody><tr><td>贝塔碘溶液</td><td>Mundipharma</td><td>4162-1606/89x30mm</td><td>聚维酮碘</td></tr><tr><td>校准比色皿</td><td>Millar Instruments</td><td>910-1049</td><td>校准比色皿</td></tr><tr><td>Contura 专业动物毛发修剪器</td><td>Wella</td><td>HS-60</td><td>小型动物剃毛系统</td></tr><tr><td>Eclipse 27G 针头</td><td>BD</td><td>REF 305770</td><td>27G 针头</td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11203-25, 11069-08, 11616-15, 11506-12, 11051-10</td><td>手术镊</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Aesculap Braun</td><td>BN731R, BD 311R</td><td>手术镊</td></tr><tr><td>Foris FS2434</td><td>Eizo</td><td>0FTD2033</td><td>显示器</td></tr><tr><td>Hamilton 100&amp;micro;l 带针注射器</td><td>Hamilton</td><td>80621</td><td>100&amp;micro;l 带针注射器</td></tr><tr><td>加热式小型动物手术台</td><td>Harvard Apparatus</td><td>15001</td><td>加热手术台</td></tr><tr><td>肝素钠 25000</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.04</td><td>肝素</td></tr><tr><td>氯胺酮 10% 100 mg/ml</td><td>bela-pharm</td><td>FS1670041</td><td>氯胺酮</td></tr><tr><td>Labchart Pro 8 + Pro 模块</td><td>AD Instruments</td><td>MLS260/8</td><td>压力-容积数据分析软件</td></tr><tr><td>LAS EZ</td><td>Leica</td><td>LAS EZ</td><td>显微镜相机软件</td></tr><tr><td>Leica IC80 HD</td><td>Leica</td><td>IC80 HD</td><td>显微镜相机</td></tr><tr><td>Leica M80</td><td>Leica</td><td>M80</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>微尖导管换能器</td><td>Millar Instruments</td><td>SPR-839</td><td>压力-容积导管</td></tr><tr><td>MiniVent</td><td>Harvard Apparatus</td><td>845</td><td>呼吸机</td></tr><tr><td>MPVS Ultra</td><td>Millar Instruments</td><td>PL3508B48/M</td><td>压力-容积导管数据采集装置</td></tr><tr><td>Octenisept</td><td>Sch&amp;uuml;lke</td><td>20000832-A</td><td>消毒剂</td></tr><tr><td>Plastipak 1ml</td><td>PD</td><td>REF 303172</td><td>1ml 注射器</td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td>模拟/数字转换器</td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Ethicon</td><td>XNEH7814.P31</td><td>聚丙烯缝合线</td></tr><tr><td>牵开器套装</td><td>FST</td><td>18200-20</td><td>手术部位牵开装置</td></tr><tr><td>Seraflex 5-0</td><td>Naila</td><td>IC108000</td><td>丝线缝合线</td></tr><tr><td>小型及微型剪刀</td><td>FST Essen</td><td>14059-11, 15007-08, 14064-11</td><td>手术剪</td></tr><tr><td>小型硅胶管</td><td>Reichelt Chemietechnik</td><td></td><td>用于左冠状动脉阻塞的导管</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>氯化钠</td></tr><tr><td>testo 108</td><td>testo</td><td>5631080</td><td>直肠温度计</td></tr><tr><td>Thinkcentre 台式计算机</td><td>Lenovo</td><td>PC0EJS2V</td><td>计算机</td></tr><tr><td>Vasofix Safety 20G</td><td>Braun</td><td>4269110S-01</td><td>插管导管</td></tr><tr><td>Windows 10</td><td>Microsoft</td><td>KW9-00240</td><td>操作系统</td></tr><tr><td>赛拉嗪 2%</td><td>Ceva</td><td>6324464.00.00</td><td>盐酸赛拉嗪</td></tr></tbody></table>

小鼠急性心肌梗死的实时压力-容积分析

Real-time Pressure-volume Analysis of Acute Myocardial Infarction in Mice

急性心肌梗死可导致急性心力衰竭和心源性休克。血流动力学评估对于任何针对急性左心室（LV）功能障碍的潜在治疗策略的评价至关重要。目前的成像方式（例如，超声心动图和磁共振成像）存在若干局限性，因为无法直接测量左心室压力。在冠状动脉闭塞小鼠模型中进行左心室导管插入术，可作为一种实时评估左心室功能的新方法。
在手术开始时，对小鼠进行麻醉，随后行气管插管。进行左心室插管时，暴露右侧颈动脉 通过 中颈部切口。插入导管并置于左心室腔内。行左侧开胸术，结扎左主冠状动脉（LCA）。为诱导再灌注，在45分钟后松解缝线。全程记录压力-容积数据。
结扎左冠状动脉（LCA）导致左心室（LV）收缩功能下降，表现为每搏输出量、左心室射血分数（EF）和心输出量减少30%。作为左心室收缩力指标的最大dP/dt也显著降低，舒张功能严重受损（最小dP/dt下降40%）。再灌注20分钟后，左心室功能未完全恢复。
实时压力-容积分析是监测小鼠急性心肌梗死期间心脏功能的有效方法。保持稳定的麻醉状态和标准化的手术操作对于确保结果的有效性至关重要。由于急性心肌梗死的早期阶段对发病率和死亡率具有关键影响，所描述的方法可能有助于对新型心肌保护策略进行临床前评估。

左心室插管后，进行可逆性左冠状动脉结扎45分钟，随后再灌注10分钟。全程记录压力-容积（PV）数据（图1）。
通过获得特征性的左心室压力-容积（LV PV）曲线图，确认了PV导管的正确放置位置（图2A）。左心室导管放置显示典型的心室压力范围，最小压力为0 - 20 mmHg；而若PV导管误置于主动脉内，则会呈现典型的动脉压力曲线，其最小压力为30 - 60 mmHg（舒张压），并在收缩末期出现提示主动脉瓣关闭的小幅波动（图3B 和 3C）。左冠状动脉（LCA）成功阻断通过肉眼观察左心室远端心肌变苍白得以确认（图2B）。
<p class="jove_content" fo:k...

小鼠急性心肌梗死会引发急性但尚未完全明确的左心室（LV）功能变化。在冠状动脉闭塞的小鼠中进行左心室插管，是一种用于实时评估左心室功能的新方法。

急性心肌梗死可导致急性心力衰竭和心源性休克。血流动力学评估对于任何……的评价至关重要。

该方法有助于回答心血管研究领域中的关键问题，例如识别急性心肌梗死中的早期保护机制。该技术的主要优势在于，可在小鼠心肌梗死并进行再灌注的过程中，实时完成高级血流动力学表征。气管插管及缺血-再灌注手术将由本实验室的生物学家 Pia Stock 操作。麻醉动物后，使用电动剪刀去除颈部和胸部的毛发。接着，用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭皮肤三次进行清洁。然后，使用小型手术剪，在下唇下方5毫米处朝向胸骨做一条10毫米长的纵向正中切口。接下来，使用镊子钝性分离下颌下腺的左侧和右侧部分。然后，分离右侧气管旁区域的肌肉和脂肪组织，以暴露右侧颈总动脉。使用弯头镊子小心地进行钝性分离，游离并分离出5至10毫米的血管。在腐蚀尸体中操作时，应始终避免移动迷走神经，因为这可能导致严重的低血压和心动过缓。在游离血管后，将两根预先准备好的5/0丝线缝线从血管下方穿过。然后用紧结结扎远端血管，并在近端缝线上打一个松结，以便放置导管。接下来，在暴露血管的近端、缝线近侧放置一把止血血管钳。该血管钳用于可逆性阻断血流。现在，使用显微剪刀在颅侧结扎线近端1毫米处作楔形切口，切开血管。应观察到少量血液渗出。然后，扩开切口，将导管插入血管内10毫米。此时，开始记录导管探头采集的数据。接下来，取出血管夹，然后向切口内加入一至两滴生理盐水，以帮助将导管沿血管再推进约10毫米。随后收紧结扎线，防止血液沿导管反流，但不要将导管固定死。此时，轻柔地继续推进导管，直至压力分析显示动脉血压波形，表明导管已到达主动脉。在主动脉瓣处，应感觉到轻微的阻力和同步的牵拉感。尝试将导管通过主动脉瓣时，可回撤导管约5毫米后再次前送，有助于通过。左心室导管到位的标志是舒张压发生变化。容积的任何变化也是导管进入左心室的提示。一旦确认导管已进入左心室，应将近端结扎线扎紧，以防止其移动。导管插入后，准备进行45分钟的缺血处理。首先，从胸骨尾端向左侧腋窝切开皮肤。然后钝性分离两层肌肉，暴露肋骨。接着，在左侧第三与第四肋骨之间切开胸腔。使用手术钩暴露心包膜，随后切除覆盖心脏的心包膜。在继续进行左主冠状动脉结扎之前，需等待30秒不触碰动物，以记录用于有效分析的压力和容积数据。现在，辨认左主冠状动脉。它从左侧冠状动脉开口下方发出，沿心脏左侧向下延伸至心尖。然后，用6/0聚丙烯缝线在左侧冠状动脉开口下方2毫米处环绕动脉打结。接着，将一小段硅胶管置于结环下方，并打结固定。如果远端心肌开始变灰，则表明左主冠状动脉已被阻塞。接下来，将缝线剪至一毫米长度，然后松开手术钩，并手动闭合切口上方的肌层。随后持续记录压力和容积数据，等待45分钟。45分钟后，重新打开切口并移除硅胶管以诱导再灌注。然后继续记录20分钟的数据。当心脏重新变为红色时，表明再灌注成功。再灌注期结束后，松开结扎线并拔出导管，同时迅速重新扎紧结扎线，以防需要为后续研究采集血液时发生失血。完成文

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