膜片钳后单细胞多重逆转录聚合酶链式反应

该方法有助于回答神经科学研究中的关键问题，例如表征神经元群体或鉴定传导系统的来源与靶点。该技术的主要优势在于，能够快速、简便地确定单个细胞中预先选定的一组基因的表达谱。因此，该方法可为小鼠的随机多样性提供深入见解。

该方法也可应用于其他细胞类型，例如星形胶质细胞，以及多种动物模型。本方法的演示至关重要，因为固定和吸取步骤较难掌握，实验数据需要一定量的细胞质才能进行分析。在切片前，准备一套解剖工具，包括手术剪、精细虹膜剪、两个刮刀、镊子、一张滤纸片和氰基丙烯酸盐胶水。

然后用碳酰气体饱和冰冻切割液，并将切片室冷却至零下20摄氏度。接着去除动物的头皮并打开颅骨。小心取出脑组织，放入盛有通入碳酰气体的冰冻切割液的小烧杯中。

随后，将切片室从负20摄氏度取出，并用纸巾去除水分。小心解剖脑组织以分离目标区域。将组织粘附于切片室上，并加入碳酸化、冰冻的切片溶液。

使用振动切片机切出300微米厚的切片。将切片转移至含有充氧切割液的孵育室中，在室温下静置，使其恢复至少30分钟。进行单细胞RT-PCR和靶向细胞表征时，全细胞记录时间应限制在20分钟以内，以保护mRNA酶。

记录结束后，准备一个含有 2 微升 5xRT 混合液和 0.5 微升 20xDTT 的 500 微升 PCR 管。离心后置于冰上保存。然后通过施加轻微的负压收集细胞的细胞质。

在保持紧密封接的同时，监测并控制细胞内容物进入移液管，若涉及某些基因，则应避免收集细胞核。若涉及基因分析，必须避免收集细胞核，并需准备一组用于扩增基因组DNA（gDNA）的引物，以检测是否存在普遍污染。如果细胞核接近移液管尖端，应释放负压并将移液管移开。

确保密封性完好，并在新的移液管位置重新开始收集细胞质。接下来，轻柔地回撤移液管以形成外面向外膜片，从而减少细胞外碎片的污染，并有利于细胞膜闭合，以便后续进行组织化学分析。请注意，旋钮、显微操作器、计算机键盘或鼠标均是携带RNase污染的质子电荷源。

如果在记录过程中触碰过手套，请更换手套。随后，将移液枪头连接到排液器上，通过施加正压将其中的内容排入PCR管中。将移液枪头尖端折断至PCR管内，以帮助收集其内容物。

然后，短暂离心管子，加入0.5 µL RNase抑制剂和0.5 µL RTase。轻轻混匀，再次离心，并在37°C下孵育过夜。第二天，离心管子，于-80°C保存，可保存数月。

在进行PCR分析并执行第一步扩增之前。为验证PCR，混合并稀释一对引物，使用专用于单细胞RT-PCR的移液器加入一微摩尔的引物。将PCR仪设置为95摄氏度下反应3分钟，运行40个循环，最后在72摄氏度下延伸5分钟。

为最大限度减少引物二聚体的形成，将 PCR 管放入已预热至 95 摄氏度的热循环仪中，进行热启动。30 秒后，迅速将 20 微升引物混合物弹射至油层上方。引物对经验证后，使用多重扩增方案对其进行测试。

将外引物混合并稀释至一微摩尔。将多重引物混合液于负20摄氏度保存，可保存数周。接下来，配制预混液并置于冰上。

轻弹PCR管并离心，加入两滴矿物油。在95摄氏度下孵育3分钟后，进行20个PCR循环。按照所述方法进行热启动，加入20 µL多重引物混合物。

然后，准备与待分析基因数量相同的PCR管。使用每种基因的第一轮PCR产物各1微升作为模板，配制预混液。根据待分析的基因数量调整所有试剂的体积，并额外增加10%的体积以补偿移液误差。

轻轻振荡，离心管子，将80微升预混液分装至每个PCR管中。每管加入两滴矿物油，注意不要接触管壁或管盖。运行35个PCR循环，然后通过排出20微升内部引物混合液进行热启动。

通过琼脂糖凝胶电泳分析第二次PCR产物。通过其较大的胞体和明显的顶端树突在视觉上识别出第5层锥体神经元。膜片钳记录揭示了第5层规则放电神经元典型的电生理特性，包括低输入电阻、持续时间较长的动作电位以及显著的峰频适应现象。

对该神经元的分子分析显示其表达vGluT1，证实了其谷氨酸能表型。该神经元还表达生长抑素以及钠钾ATP酶的ATP1-alpha-1和三个亚基。对记录的神经元进行生物胞素标记，证实其具有锥体形态。

正如预期的谷氨酸能神经元特征，对26个第五层锥体细胞的分子分析显示表达vGluT1，但不表达两种GAD中的任何一种。如果操作得当，该技术可在两天内完成。在进行此操作时，务必格外小心，避免污染。

观看本视频后，您应能充分理解如何在脑切片中根据膜片聚集体对单个细胞进行表征，并在收集细胞质、逆转录及热启动 PCR 反应后，同时检测数十个基因的表达情况。请务必注意，溴化乙锭的操作具有极高危险性，在进行该实验步骤时，应始终采取佩戴手套和实验服等防护措施。