Name: 膜片钳后单细胞多重反转录聚合酶链反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学习膜片钳后单细胞多重反转录聚合酶链反应技术，用于分析单个神经元的基因表达谱。该方法可快速检测预筛选基因的表达特征，揭示细胞分子特性与功能多样性。

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感谢 Alexandre Mourot 博士对本文手稿的评论。本工作得到了法国国家研究署（ANR 2011 MALZ 003 01；ANR-15-CE16-0010 和 ANR-17-CE37-0010-03）的资助；BLG 得到了阿尔茨海默病研究基金会博士后奖学金的支持。感谢 IBPS 动物实验中心（法国巴黎）提供的帮助。

作者无任何利益冲突需要披露。

在膜片钳记录后进行单细胞多重RT-PCR，可同时且可靠地检测电生理学鉴定细胞中超过30个基因的表达5。在单细胞水平上分析基因表达需要高效能的PCR引物。其中最关键的限制步骤之一是细胞内容物的收集。其效率取决于膜片钳电极尖端的直径，该直径应尽可能大，同时与细胞大小相匹配。研究表明，尖端开口直径为1–2 µm的电极适用于大多数类型的神经元。还必须确保仅收集细胞内容物，而不混入周围组织。这可通过电生理手段监控采集过程中紧密封接的维持情况来实现。在撤回电极时形成外向-out膜片构型，可进一步保护所采集的细胞质免受细胞碎片污染。单细胞多重RT-PCR的成功率还取决于目标细胞类型中mRNA的丰度。例如，星形胶质细胞的mRNA表达量相对较低3，因此从中获得的产物量通常低于神经元，需增加样本数量以补偿15,16。逆转录反应在离心管中的效率较低48，是单细胞多重RT-PCR的限速步骤。因此，使用高...

大脑皮层包含多种参与不同生理过程的细胞类型。由于皮层细胞类型具有显著的形态学、生理学和分子多样性，要识别和鉴定这些细胞类型（理解其特定功能的前提）极具挑战性1,2,3,4。
单细胞多重RT-PCR技术基于膜片钳与RT-PCR技术的结合，能够同时检测电生理学鉴定的细胞中30多个预定义基因的表达5。在记录电极内加入神经元示踪剂，可在组织化学显影后进一步对记录的细胞进行形态学表征6,7,8,9,10。该技术对于基于多变量分析细胞表型特征来分类神经元类型极为有用5,9,10,11,12,13,14。单细胞多重RT-PCR也适用于星形胶质细胞等非神经元细胞的表征15,16,17，并且理论上可应用于所有脑区结构18,19,20,21,22,23和细胞类型，前提是这些细胞能够以全细胞构型进行记录。
当缺乏特异性抗体时，该技术对于鉴定传递系统的细胞来源和/或靶细胞尤其便捷7,8,15,16,20,21,24,25,26,27,28。该方法依赖于对视觉可识别细胞进行的膜片钳记录29，因此也可实现对特定细胞微环境中细胞的靶向研究8,15,16。此外，由于脑组织的细胞构筑在脑切片中得以保留，该方法还可用于研究已鉴定细胞与神经元及非神经元结构之间的解剖学关系7,8,18。
由于该技术受限于所获取细胞质的量以及逆转录（RT）效率，检测低拷贝数表达的mRNA可能较为困难。尽管基于RNaseq技术的其他方法能够分析单个细胞的全转录组3,4,30,31，但这些方法需要高通量且昂贵的测序仪，而并非所有实验室都具备此类设备。由于单细胞多重RT-PCR技术采用终点PCR，因此仅需广泛可用的PCR仪即可。该方法可在配备电生理实验装置的实验室中轻松开展，无需昂贵仪器。它能够在一天内完成对预定义基因集合的表达情况进行定性分析。因此，该方法为快速获取单细胞分子特征提供了便捷途径。

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>用于引物设计的多序列比对</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>随机引物</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>逆转录与聚合酶链式反应</td></tr><tr><td>RNasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>PCR 引物</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td></td><td>PCR / 脱盐并稀释至200 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>0.5 mL平盖管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AB0350</td><td>逆转录与聚合酶链式反应</td></tr><tr><td>BT10 系列 - 10 &amp;micro;L滤芯吸头</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>逆转录与聚合酶链式反应</td></tr><tr><td>BT20 系列 - 20 &amp;micro;L滤芯吸头</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>逆转录与聚合酶链式反应</td></tr><tr><td>BT200 系列 - 200 &amp;micro;L滤芯吸头</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>逆转录与聚合酶链式反应</td></tr><tr><td>BT1000 系列 - 1000 &amp;micro;L滤芯吸头</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>逆转录与聚合酶链式反应</td></tr><tr><td>DNA热循环仪</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>E1510-10ML</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>Tris-硼酸-EDTA缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>T4415-1L</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>&amp;Phi;X174 DNA-Hae III 酶切</td><td>NEB（New England BioLabs）</td><td>N3026S</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>柯达</td><td></td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>电泳电源 EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>中型水平电泳仪型号 SHU13</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td></td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>表面光滑、具有缎面外观的纸张</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>膜片钳内液</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>60377</td><td>膜片钳内液</td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>E3889</td><td>膜片钳内液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>H4034</td><td>膜片钳内液</td></tr><tr><td>D-葡萄糖酸钾</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>G4500</td><td>膜片钳内液</td></tr><tr><td>氯化镁溶液</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>M1028</td><td>膜片钳内液</td></tr><tr><td>5500 蒸气压渗透压计</td><td>Wescor</td><td></td><td>膜片钳内液</td></tr><tr><td>生物胞素</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>B4261</td><td>膜片钳内液</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>S5016</td><td>组织切片制备</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖一水合物</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>49159</td><td>切片制备</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>S6191</td><td>切片制备</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>60128</td><td>切片制备</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>31437-M</td><td>切片制备</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>S5011</td><td>切片制备</td></tr><tr><td>氯化镁溶液</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>63069</td><td>切片制备</td></tr><tr><td>氯化钙溶液</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>21115</td><td>组织切片制备</td></tr><tr><td>犬尿喹啉酸</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>K3375</td><td>切片制备</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>切片制备</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>组织切片制备</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>H1009</td><td>膜片钳装置清洁</td></tr><tr><td>带细丝的薄壁玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>BX51WI 正置显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE 黑白CCD视频相机</td><td>索尼</td><td></td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>Axopatch 200B 放大器</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 软件套装</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>10 mL注射器</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>排出</td></tr><tr><td>直筒式E系列（支架）</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>排出</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>S7907</td><td>组织化学显色</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>S8282</td><td>组织化学显色</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>P6148</td><td>组织化学显色</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>X100</td><td>组织化学显色</td></tr><tr><td>来自冷水鱼皮的明胶</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>G7041</td><td>组织化学显色</td></tr><tr><td>链霉亲和素，Alexa Fluor 488 标记物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S11223</td><td>组织化学显色</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>组织化学显色</td></tr></tbody></table>

膜片钳后单细胞多重逆转录聚合酶链式反应

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

大脑皮层由多种细胞类型组成，这些细胞表现出不同的形态学、生理学和分子特征。这种多样性阻碍了对这些细胞类型的简便鉴定与表征，而鉴定与表征正是研究其特定功能的前提条件。本文描述了一种多重单细胞逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方案，该方法可在脑片上进行膜片钳记录后，同时检测单个细胞中数十个基因的表达情况。该方法操作简便，可与形态学表征相结合，广泛适用于确定各类细胞类型的表型特征及其特定的细胞微环境，例如血管周围区域的细胞特性。该方案的基本原理是：利用膜片钳技术记录单个细胞，收集并逆转录其胞质内容物，再通过多重PCR定性检测一组预定义基因的表达情况。该方法需要精心设计PCR引物，并使用与RT-PCR兼容的细胞内膜片钳溶液。为确保转录本检测的选择性和可靠性，从胞质采集到扩增的各个环节均需设置适当的对照。尽管本文讨论的注意事项必须严格遵守，但几乎所有电生理实验室均可应用多重单细胞RT-PCR技术。

多重RT-PCR的代表性验证结果如图3所示。该实验方案旨在同时检测12个不同基因的表达。囊泡型谷氨酸转运蛋白vGluT1被用作谷氨酸能神经元的阳性对照42。GABA合成酶（GAD65和GAD67）、神经肽Y（NPY）以及生长抑素（SOM）被用作GABA能中间神经元的标志物3,5,11。环氧化酶-2（COX-2）被用作锥体细胞亚群的标志物3,16。
选择Na+/K+ ATP酶的ATP1α1-3亚基以及AT...

本方案描述了在膜片钳记录后进行单细胞多重逆转录聚合酶链式反应所需的关键步骤和注意事项。该技术是一种简单而有效的方法，可用于分析通过膜片钳记录所鉴定的单个细胞中预设基因集的表达谱。

大脑皮层由多种细胞类型组成，这些细胞表现出不同的形态学、生理学和分子特征。这种多样性阻碍了……

该方法有助于回答神经科学研究中的关键问题，例如表征神经元群体或鉴定传导系统的来源与靶点。该技术的主要优势在于，能够快速、简便地确定单个细胞中预先选定的一组基因的表达谱。因此，该方法可为小鼠的随机多样性提供深入见解。该方法也可应用于其他细胞类型，例如星形胶质细胞，以及多种动物模型。本方法的演示至关重要，因为固定和吸取步骤较难掌握，实验数据需要一定量的细胞质才能进行分析。在切片前，准备一套解剖工具，包括手术剪、精细虹膜剪、两个刮刀、镊子、一张滤纸片和氰基丙烯酸盐胶水。然后用碳酰气体饱和冰冻切割液，并将切片室冷却至零下20摄氏度。接着去除动物的头皮并打开颅骨。小心取出脑组织，放入盛有通入碳酰气体的冰冻切割液的小烧杯中。随后，将切片室从负20摄氏度取出，并用纸巾去除水分。小心解剖脑组织以分离目标区域。将组织粘附于切片室上，并加入碳酸化、冰冻的切片溶液。使用振动切片机切出300微米厚的切片。将切片转移至含有充氧切割液的孵育室中，在室温下静置，使其恢复至少30分钟。进行单细胞RT-PCR和靶向细胞表征时，全细胞记录时间应限制在20分钟以内，以保护mRNA酶。记录结束后，准备一个含有 2 微升 5xRT 混合液和 0.5 微升 20xDTT 的 500 微升 PCR 管。离心后置于冰上保存。然后通过施加轻微的负压收集细胞的细胞质。在保持紧密封接的同时，监测并控制细胞内容物进入移液管，若涉及某些基因，则应避免收集细胞核。若涉及基因分析，必须避免收集细胞核，并需准备一组用于扩增基因组DNA（gDNA）的引物，以检测是否存在普遍污染。如果细胞核接近移液管尖端，应释放负压并将移液管移开。确保密封性完好，并在新的移液管位置重新开始收集细胞质。接下来，轻柔地回撤移液管以形成外面向外膜片，从而减少细胞外碎片的污染，并有利于细胞膜闭合，以便后续进行组织化学分析。请注意，旋钮、显微操作器、计算机键盘或鼠标均是携带RNase污染的质子电荷源。如果在记录过程中触碰过手套，请更换手套。随后，将移液枪头连接到排液器上，通过施加正压将其中的内容排入PCR管中。将移液枪头尖端折断至PCR管内，以帮助收集其内容物。然后，短暂离心管子，加入0.5 µL RNase抑制剂和0.5 µL RTase。轻轻混匀，再次离心，并在37°C下孵育过夜。第二天，离心管子，于-80°C保存，可保存数月。在进行PCR分析并执行第一步扩增之前。为验证PCR，混合并稀释一对引物，使用专用于单细胞RT-PCR的移液器加入一微摩尔的引物。将PCR仪设置为95摄氏度下反应3分钟，运行40个循环，最后在72摄氏度下延伸5分钟。为最大限度减少引物二聚体的形成，将 PCR 管放入已预热至 95 摄氏度的热循环仪中，进行热启动。30 秒后，迅速将 20 微升引物混合物弹射至油层上方。引物对经验证后，使用多重扩增方案对其进行测试。将外引物混合并稀释至一微摩尔。将多重引物混合液于负20摄氏度保存，可保存数周。接下来，配制预混液并置于冰上。轻弹PCR管并离心，加入两滴矿物油。在95摄氏度下孵育3分钟后，进行20个PCR循环。按照所述方法进行热启动，加入20 µL多重引物混合物。然后，准备与待分析基因数量相同的PCR管。使用每种基因的第一轮PCR产物各1微升作为模板，配制预混液。根据待分析的基因数量调整所有试剂的体积，并额外增加10%的体积以补偿移液误差。轻轻振荡，离心管子，将80微升预混液分装至每个PCR管中。每管加入两滴矿物油，注意不要接触管壁或管盖。运行35个PCR循环，然后通过排出20微升内部引物混合液进行热启动。通过琼脂糖凝胶电泳分析第二次PCR产物。通过其较大的胞体和明显的顶端树突在视觉上识别出第5层锥体神经元。膜片钳记录揭示了第5层规则放电神经元典型的电生理特性，包括低输入电阻、持续时间较长的动作电位以及显著的峰频适应现象。对该神经元的分子分析显示其表达vGluT1，证实了其谷氨酸能表型。该神经元还表达生长抑素以及钠钾ATP酶的ATP1-alpha-1和三个亚基。对记录的神经元进行生物胞素标记，证实其具有锥体形态。正如预期的谷氨酸能神经元特征，对26个第五层锥体细胞的分子分析显示表达vGluT1，但不表达两种GAD中的任何一种。如果操作得当，该技术可在两天内完成。在进行此操作时，务必格外小心，避免污染。观看本视频后，您应能充分理解如何在脑切片中根据膜片聚集体对单个细胞进行表征，并在收集细胞质、逆转录及热启动 PCR 反应后，同时检测数十个基因的表达情况。请务必注意，溴化乙锭的操作具有极高危险性，在进行该实验步骤时，应始终采取佩戴手套和实验服等防护措施。

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膜片钳后单细胞多重反转录聚合酶链反应

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