利用 Microrespiration 分析和显微解剖研究 Teliospore 萌发

此处介绍的程序的总体目标是确定孢子萌发的阶段，以便评估基因转录水平。对这些变化的分析将提供对疾病传播关键阶段的进一步了解。该方法可以帮助回答有关端孢子萌发过程中与基因转录水平变化有关的转换的关键问题，从而反映基因表达控制的变化。

该技术的主要优点是它可以识别与可见形态转换不对应的呼吸水平转变，并允许在发芽的不同阶段对端孢子进行物理隔离。这项技术对控制病原体传播具有意义，因为它使我们能够识别孢子萌发的关键转变，如果改变，可以阻止疾病传播。如文本方案中所述，从玉米芯感染、端孢子收获以及端孢子活力和发芽试验开始此过程。

为了诱导发芽，首先为每个呼吸实验称量等量的端孢子。在生物安全柜中，将端孢子添加到高压灭菌的呼吸室中。用马铃薯葡萄糖汤填充腔室，并补充硫酸链霉素和硫酸卡那霉素。

上下移液以产生端孢子悬浮液。将腔室盖放入腔室中，形成气密密封。要获得 OCR 测量，首先将腔室放在水浴内的腔室机架中。

然后，将氧探针放在腔室的开口内。实时监控传感器跟踪速率程序上显示的数据点。将探头放入腔室后，让探头稳定约 3 分钟。

单击测量可连续测量氧气水平 6 小时，并以 2 秒的间隔记录测量值。在将数据导出到 Microsoft Excel 并按照文本协议中的说明执行数据分析之前，停止测量并对每个要分析的样品重复这些步骤。将大约 10 毫克的 umatus 端孢子放入 1.5 毫升的微量离心管中。

将端孢子悬浮在 500 微升补充有硫酸链霉素的 PDB 中。轻轻移液混合，直到培养基中没有端孢子团块。将端孢子悬浮液转移到含有 PDB 的 250 毫升 Erlin Meyer 烧瓶中，并补充有硫酸链霉素。

将培养瓶在 28 摄氏度下孵育过夜，以 90 RPM 的速度摇动。通过在培养皿顶部吸取 4 到 5 滴 5 微升蒸馏水来制备培养皿。然后，在培养皿上吸取三个 2 μL 的 RNA 稳定液滴，用于样品采集。

还要在培养皿上吸取 30 个 5 微升发芽的端孢子液滴。将 15 毫升矿物油加入培养皿中。在继续之前，确保所有液滴都被油覆盖。

接下来，准备一个具有 15 微米间径、1 毫米法兰、55 毫升长度和 20 度尖端角的微毛细管。将其放入微毛细管支架中，然后将其浸入矿物油中，毛细管作用将使矿物油进入微毛细管。在将微毛细管带到水滴之前释放微毛细管中的压力。

吸出以用水制备微毛细管。使用显微纵器的控制，将制备的微毛细管移动到其中一个发芽液滴上，并穿透液滴。降低微毛细管，并在感兴趣的发芽阶段将微毛细管的口向上带到发芽的端孢子。

缓慢吸出以捕获发芽的端孢子。一旦端孢子进入微毛细管，就停止吸液。重复直到微毛细管中大约有五个端孢子。

用显微作器抬起微毛细管，并将其带到 RNA 稳定溶液的收集液滴中。穿透液滴，将端孢子注入液滴中。重复这些步骤，直到捕获大约 1， 000 个端孢子。

要回收收集液滴，请吸取收集液滴，并将其转移到 RNA DNA 的游离 2.0 ml 微量离心管的盖子上。用移液管小心地使用矿物油，不要干扰收集液滴。端孢子现在可用于下游应用，例如 RNA 分离。

该图说明了评估诱导发芽的端孢子悬浮液中氧水平变化的典型结果。相对于未诱导的端孢子，表明呼吸开始的分离发生在大约 30 分钟。考虑到设置样品并将其运输到氧气探头大约需要 15 分钟，这个时间实际上是 45 分钟。

这里显示的是端孢子萌发的五个阶段。在第一阶段，端孢子被诱导发芽，但没有表现出发芽的形态学迹象。第二阶段端孢子显示一个出现的原菌丝体，其长度小于端孢子的直径。

在第三阶段，原菌丝体长度大于端孢子的直径。第四阶段的特征是前菌丝体带有附着的担子孢子。在第五阶段，有萌芽的担子孢子。

在这里，显示了异步发芽的端孢子，微毛细管位于第三阶段端孢子附近。然后将第三阶段端孢子吸入微毛细管中，并转移到一滴收集溶液中。一旦掌握，这种显微切割技术可用于在 6 到 7 小时内分离 1， 000 个阶段特异性端孢子。

在尝试此过程时，请务必记住经常休息。观看此视频后，您应该对如何在形态不同的发芽阶段物理分离孢子有很好的了解。并确定呼吸开始的时间。

一般来说，由于需要保持不育，刚接触这种方法的人会很挣扎。并且需要耐心和通过显微解剖分离细胞类型。这项技术的发展为真菌植物病理学家探索威胁全球粮食安全的毁灭性黑穗病和锈菌发芽的形态和分子方面铺平了道路。

虽然这项技术适用于我们 ligomatist，但它也可以用于许多其他破坏性的农业作物病原体，每年造成数十亿美元的损失。按照此程序，可以执行其他方法（如 RNA 分离）来回答其他问题，例如，转录水平变化的概况和时间是什么？