Name: 小鼠致耐受性树突状细胞的发育及功能表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 了解小鼠致耐受性树突状细胞的发育与功能表征方法，用于评估其在多发性硬化症等自身免疫疾病中的免疫治疗潜力。该技术为细胞免疫疗法研究提供标准化方案。

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我们感谢Reata Pharmaceuticals提供了CDDO-DFPA。同时感谢Jane和Lee Seidman儿科癌症创新讲席（John Letterio）的支持。本研究得到了美国国防部[W81XWH-12-1-0452]、凯斯综合癌症中心Angie Fowler青少年与年轻成人癌症研究计划以及F.J. Callahan基金会授予Hsi-Ju Wei的Callahan研究生学者奖的资助。

所有研究均按照凯斯西储大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的程序进行。
1. 准备骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）
<ol>
	<li>通过高压灭菌对所有手术器械进行灭菌，并在II级生物安全柜中按照适当的安​​全规程进行实验。</li>
	<li>使用CO2麻醉箱处死8至10周龄的C57BL/6小鼠。将小鼠置于解剖板上，用70%乙醇冲洗。使用手术剪剪下胫腓骨和股骨，并将其放入盛有70%乙醇的10 cm培养皿中。</li>
	<li>在10 cm培养皿盖上使用手术刀片和镊子尽可能剥离组织，分离出胫骨和股骨，并将其转移至盛有70%乙醇的6 cm培养皿中。</li>
	<li>使用手术刀片切除胫骨和股骨两端。使用装有3 mL PBS的3 mL注射器（配备23G针头），从骨的一端将骨髓内容物冲洗至含有12 mL PBS的锥形管中。对每根骨的两端重复此步骤3次。</li>
	<li>将细胞悬液在300 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用1 mL ACK裂解缓冲液重悬细胞沉淀，孵育5分钟以去除红细胞。</li>
	<li>加入9 mL PBS稀释ACK裂解缓冲液，并在300 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用10 mL培养基（RPMI-1640，含L-谷氨酰胺、10% FBS、1%非必需氨基酸（100×）、10 mM HEPES、50 nM β-巯基乙醇和5%青霉素/链霉素）重悬细胞。 
	注意：FBS中的内毒素水平必须低于0.1 EU/mL。</li>
	<li>将细胞悬液通过40 μm细胞筛过滤，取20 µl细胞悬液与80 µl台盼蓝混合，使用细胞计数仪计数活细胞数量。</li>
	<li>用含15 ng/mL GM-CSF和10 ng/mL IL-4的培养基将细胞浓度调整为1 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>在6孔板的每个孔中接种3 mL浓度为1 × 106 个细胞/mL的细胞悬液，并将细胞置于CO2培养箱中，在37°C、5% CO2和95%湿度条件下培养。 
	注意：一只小鼠的骨髓细胞数量约为3–5 × 107 个细胞，表明可接种2至3块6孔板。</li>
	<li>第3天，从每个孔中移除全部3 mL培养基，向每个孔中加入2 mL新鲜PBS，然后轻轻摇晃培养板，确保去除所有非贴壁细胞。</li>
	<li>向每个孔中更换3 mL含15 ng/mL GM-CSF和10 ng/mL IL-4的新鲜培养基。将细胞置于CO2培养箱中，在37°C、5% CO2和95%湿度条件下继续培养。</li>
	<li>第5天，直接向每个孔中添加3 mL含15 ng/mL GM-CSF和10 ng/mL IL-4的新鲜培养基。将细胞置于CO2培养箱中，在37°C、5% CO2和95%湿度条件下继续培养。 
	注意：此时每个孔中的总体积为6 mL。</li>
	<li>第7天，将整个培养板置于冰上10分钟。轻轻吹打每个孔中的培养基，使松散贴壁的骨髓来源树突状细胞（iDCs）脱落并悬浮于液体中。 
	注意：贴壁的巨噬细胞仍附着在培养板上。低温处理和轻柔操作是避免树突状细胞活化、影响后续实验的关键。</li>
	<li>将细胞悬液在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清后用新鲜培养基重悬细胞，用于后续实验。 
	注意：可通过荧光标记的CD11c抗体结合流式细胞术鉴定BMDCs，我们在图1中展示了BMDCs的设门策略，供后续实验参考。</li>
</ol>
2. 表征耐受性树突状细胞的基因与蛋白谱型
<ol>
	<li>在6孔板中，每孔加入2 ml含1 × 106 个BMDCs/ml的细胞悬液，加入培养基，并在CO2培养箱中37°C、5% CO2、95%湿度条件下孵育1小时，同时加入或不加入100–400 nM CDDO-DFPA。 
	注意：CDDO-DFPA是一种合成三萜类化合物，为核因子（红系衍生2样）2（Nrf2）的诱导剂和核因子-κB（NF-κB）的抑制剂。也可使用其他诱导剂（如IL-10、维生素D3、地塞米松或BAY 11-7085）将iDCs诱导为TolDCs，此时应根据各试剂优化本步骤条件。</li>
	<li>加入10或100 ng/ml的LPS，继续孵育4–24小时以诱导生成成熟树突状细胞（mDCs）（孵育时间根据mRNA或蛋白检测需求而定）。</li>
	<li>轻柔吹打各孔中的培养基，用1 ml移液器收集细胞悬液。以300 × g离心5分钟，分别收集细胞沉淀和上清液。</li>
	<li>通过流式细胞术分析细胞沉淀中的表面配体，如共刺激配体：CD40、CD80、CD86、MHC-II、OX40L、ICOSL，或共抑制配体：PD-L1、PD-L2、ILT3、ILT4。</li>
	<li>从细胞沉淀中提取RNA，并分别通过定量实时PCR（qRT-PCR）和ELISA检测RNA样本和上清液样本中的细胞因子谱、基因表达水平及蛋白水平。 
	注意：例如，促炎性细胞因子：TNF-α、IFNγ、EDN-1、IL-6、IL-12和IL-23，或抗炎性细胞因子：IL-4、IL-10、IL-15、TGF-β1和HO-1。</li>
</ol>
3. 评估耐受性树突状细胞（TolDCs）的功能 体外 和 在体 内
<ol>
	<li>T细胞同基因增殖实验
	<ol>
		<li>通过高压灭菌对所有手术器械进行灭菌，并在II级生物安全柜中按照适当的安全规程进行实验。</li>
		<li>使用500 ml PBS配制含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA的MACS缓冲液。通过0.2 µm滤器过滤以灭菌。 
		注意：在后续实验过程中将缓冲液置于冰上保存。</li>
		<li>为获取CD4+ T细胞，使用CO2舱对8-10周龄的OT-II T细胞受体（TCR）转基因小鼠实施安乐死。将小鼠置于解剖板上，并用70%乙醇冲洗。使用手术剪和镊子从腹部左侧分离脾脏。</li>
		<li>将脾脏与2 ml PBS置于6 cm培养皿中，用3 ml注射器推杆的末端通过40 μm细胞筛网研磨脾脏组织。</li>
		<li>收集细胞悬液，以300 x g离心5分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于400 μl MACS缓冲液中。</li>
		<li>在4°C下加入100 μl CD4+ T细胞生物素标记抗体混合物，孵育5分钟。 
		注意：该抗体混合物结合除CD4+ T细胞以外的其他细胞类型，例如CD8a、CD11b、CD11c、CD19、CD25、CD45R（B220）、CD49b（DX5）、CD105、抗MHC II类分子、Ter-119以及TCRγ/δ。</li>
		<li>在4°C下加入300 μl MACS缓冲液和200 μl抗生物素磁珠（材料表），孵育10分钟。</li>
		<li>将由铁磁性微球组成的分选柱（材料表）与预分离滤器共同置于磁场中，并用3 ml MACS缓冲液冲洗。</li>
		<li>向细胞中加入9 ml MACS缓冲液，以300 x g离心5分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于3 ml MACS缓冲液中，加样至分选柱，收集流穿液，其中含有CD4+ T细胞。</li>
		<li>用另外3 ml MACS缓冲液洗涤分选柱，并收集流穿液。</li>
		<li>为获取脾脏总树突状细胞（pan DCs），使用CO2舱对8-10周龄的C57BL/6小鼠实施安乐死。将小鼠置于解剖板上，并用70%乙醇冲洗。使用手术剪和镊子从腹部左侧分离脾脏。将脾脏放入含有2 ml胶原酶D溶液（2 mg/ml胶原酶D溶于含钙、镁的HBSS中）的6 cm培养皿中。</li>
		<li>使用1 ml注射器和25G针头向脾脏内注射1 ml胶原酶D溶液两次，并用小剪刀将脾脏剪成小块。</li>
		<li>室温下振荡并孵育25分钟。</li>
		<li>室温下加入500 μl 0.5 M EDTA，孵育5分钟。 
		注意：步骤3.1.13至3.1.14对于提高DCs的得率至关重要。</li>
		<li>使用3 ml注射器推杆的末端通过40 μm细胞筛网研磨脾脏匀浆，收集细胞悬液并以300 x g离心5分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于350 μl MACS缓冲液、50 μl FcR阻断试剂和100 μl总树突状细胞生物素标记抗体混合物中，在4°C下孵育10分钟。 
		注意：该抗体混合物针对DCs不表达的抗原。</li>
		<li>加入9 ml MACS缓冲液洗涤细胞，以300 x g离心5分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于800 μl MACS缓冲液中，在4°C下加入200 μl抗生物素磁珠，孵育10分钟。</li>
		<li>重复步骤3.1.9至3.1.11以收集DCs。</li>
		<li>用另外3 ml MACS缓冲液洗涤分选柱两次，并收集流穿液。</li>
		<li>将2 x 105 DCs/ml在37°C下与或不与100-400 nM CDDO-DFPA共同孵育1小时。另取CD4+ T细胞（1 x 107/ml），在37°C下用1 μM CFSE标记15分钟，用PBS洗涤后调整体积，使最终浓度为2 x 106 T细胞/ml。</li>
		<li>接下来，在96孔板中，将100 μl经处理的树突状细胞与等体积CFSE标记的CD4+ T细胞共培养（均来自上述步骤），使DCs与T细胞比例为1:10。每孔加入100 ng/mL卵清蛋白（OVA）肽323-329，在37°C孵育2-3天后，通过流式细胞术检测T细胞的CFSE荧光强度。 
		注意：细胞数量及DCs与T细胞的比例已在我们先前的研究37中优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过注射负载髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）（35-55）的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）诱导被动性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）
	<ol>
		<li>在6孔板中，每孔加入2 ml含1 x 106 BMDCs/ml的培养基，同时加入或不加入100-400 nM CDDO-DFPA，37°C孵育1小时。</li>
		<li>加入10 ng/ml LPS，继续孵育24小时。</li>
		<li>加入100 μg/ml MOG（35-55）肽段，孵育4小时。</li>
		<li>收集细胞悬液，以300 x g离心5分钟。</li>
		<li>用PBS重悬细胞沉淀并计数。</li>
		<li>将2 x 106个细胞溶于200 μl PBS中，皮下注射至8-10周龄雌性C57BL/6小鼠（每只后肢注射100 μl）。</li>
		<li>在BMDC注射当天及48小时后，每只小鼠注射200 ng百日咳毒素（PTX）。</li>
		<li>连续4周，每周重复一次步骤3.2.6至3.2.7。</li>
		<li>每日依据标准评分标准37评估EAE临床症状（0.5分：尾尖无力；1分：尾巴无力；2分：后肢中度无力；3分：后肢严重无力；4分：后肢完全瘫痪；5分：四肢瘫痪或濒死状态；6分：死亡）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

本文描述了一种高效且可重复的实验方案，可用于生成未成熟树突状细胞（iDCs），并进一步将其分化为耐受性树突状细胞（TolDCs）。我们建议该方案可用于评估新型分子靶向药物诱导TolDC表型的能力。如本报告所述，我们采用以下流程：首先通过流式细胞术分析TolDC表面配体的表达，随后利用qRT-PCR和ELISA检测DC的细胞因子谱型。最后，通过验证TolDC抑制T细胞增殖的能力，确认其免疫调节功能。 体外 及其在体内抑制自身免疫的疗效，使用多发性硬化症的临床前小鼠EAE模型。
在我们的实验方案中，未成熟树突状细胞（iDCs）由小鼠骨髓前体细胞在GM-CSF和IL-4联合诱导下生成并分化。其他方案则在培养基中使用类似酪氨酸激酶3配体（Flt3L）来生成iDCs44。尽管使用Flt3L可提高iDCs的产量，但这些iDCs通常需要更长的培养时间（9天）才能收获，而使用GM-CSF/IL-4则仅需7天44。更重要的是，由Flt3L生成的iDCs通常会分化为cDCs（CD8<sup...

树突状细胞（DCs）是先天免疫系统的重要组成部分，由拉尔夫·斯坦曼（Ralph Steinman）和赞维尔·科恩（Zanvil Cohn）于1973年首次发现并鉴定为主要的专业抗原呈递细胞1树突状细胞（DCs）已被证实通过在次级淋巴器官中经由主要组织相容性复合体（MHC）向T细胞和B细胞呈递经处理的抗原，在连接先天免疫与适应性免疫系统中发挥重要作用。2在哺乳动物免疫系统中，至少存在两类树突状细胞（DC），即髓系树突状细胞和浆细胞样树突状细胞（pDCs）。3髓样树突状细胞（也称为传统树突状细胞，cDCs）以表达CD11c为特征，可分化为未成熟树突状细胞（iDCs） 体外 分别从鼠源或人源的骨髓前体细胞或外周血单核细胞，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-4诱导生成4.
激活“危险”信号（如病原体相关分子模式（PAMP）或损伤相关分子模式（DAMP））可通过与树突状细胞（DC）表面多种模式识别受体结合，驱动未成熟DC（iDCs）向具有免疫原性的成熟DC（mDCs）分化5。具有免疫原性的DC通过上调MHCII2、共刺激配体（CD80、CD86和CD40）6、细胞因子及其他可溶性介质7，进一步启动初始T细胞的增殖与分化。免疫原性DC产生的一系列促炎介质对于细胞因子介导的T细胞分化至关重要。例如，IFN-γ和IL-12均是Th1细胞分化的必要因子8，而IL-1、IL-6和IL-23对初始T细胞向Th17细胞极化具有关键作用9。尽管成熟DC可对异源抗原产生反应，但若由自身抗原不受控地激活DC，则可能导致免疫耐受的破坏，并通过产生自身反应性T细胞促进自身免疫性疾病的发展，这些T细胞的活化可导致组织损伤10。
近期研究报告为树突状细胞（DC）的可塑性提供了明确证据，例如它们能够与组织微环境中的不同信号相互作用，并分化为功能各异的效应型/抑制型DC亚群。抗炎介质如IL-1011，TGF-β12，以及 HO-113 已被证明在免疫抑制中发挥重要作用，其机制是诱导产生耐受性树突状细胞（TolDCs）。这些TolDCs获得调节功能，并抑制T细胞增殖14此外，树突状细胞（DCs）缺乏共刺激作用以及耐受性树突状细胞（TolDCs）产生抗炎介质，均可促进调节性T细胞（Tregs）的诱导，并有效抑制Th1和Th17细胞的分化与扩增。15在过去的二十年中，多位研究人员已报道了耐受性树突状细胞（TolDCs）的治疗潜力。在这些研究中，给予 离体 诱导生成的耐受性树突状细胞不仅改善了多种自身免疫性疾病临床前模型中的病理症状16 但也导致了患者体内免疫耐受的发展17,18有趣的是，目前在包括1型糖尿病在内的多项临床试验中，耐受性树突状细胞（TolDCs）疗法已被视为治疗自身免疫性疾病的一种替代性或辅助性策略。19类风湿性关节炎20,21，多发性硬化症（MS）22,23,24，以及克罗恩病25.
已有多种方案被用于诱导耐受性树突状细胞（TolDCs）的分化，多个实验室已报道了TolDCs的制备及表型鉴定方法。这些方法可用于可重复地生成TolDCs。 体外 从造血祖细胞分化并稳定维持其在耐受性状态 体内26,27,28,29. 通过暴露于多种免疫调节药物或抗炎性细胞因子，可将iDCs转化为TolDCs。例如，维生素D3是一种已知的药理学试剂，可促进DCs产生IL-10并抑制其分泌IL-12，从而增强其免疫抑制功能30此外，当树突状细胞暴露于强效炎症刺激物（如脂多糖（LPS））时，多种药物试剂（如地塞米松）31，雷帕霉素32和皮质类固醇33 已被证明可通过降低树突状细胞表面CD40、CD80、CD86和MHCII的表达来诱导耐受性树突状细胞（TolDC）表型34IL-10 和 TGF-β 是研究最为广泛的可诱导树突状细胞耐受的抗炎细胞因子35 同时暴露于这两种细胞因子已被证明可诱导树突状细胞（DCs）产生耐受性表型36.
由于耐受性树突状细胞（tolerogenic DC）由其功能特征而非表型标志物定义，因此迫切需要建立一种稳定的方法，用于对耐受性树突状细胞（TolDCs）进行细胞和功能表征。此外，若要在实验室中有效且可重复地比较新试剂诱导TolDC表型的能力，则必须建立一套严格且一致的实验方案，以实现对耐受性树突状细胞表型的稳定评估与表征。本文提供了一套详细的操作流程，逐步介绍如何从小鼠造血祖细胞中分离未成熟树突状细胞（iDCs），并进一步分析待评估新试剂将iDCs转化为TolDCs的能力，从而对TolDCs进行可靠的表型和功能特征分析。 体外 和 体内。该描述包含一种详尽的方法，用于通过TolDCs的表面配体、细胞因子谱型及其免疫抑制功能对其进行表征 体外我们还提供了一种方法示例，用于探索这些耐受性树突状细胞（TolDCs）在多发性硬化症（MS）临床前模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的潜在治疗应用。该已建立的实验方案将有助于研究人员评估新药剂促进TolDCs诱导的能力，并推动拓展TolDCs在治疗开发中的应用范围。

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>自行合成</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>小鼠 GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td><td>骨髓来源树突状细胞（BMDC）分化</td></tr><tr><td>小鼠 IL-4</td><td>Peprotech Inc.</td><td>214-14</td><td>骨髓来源树突状细胞（BMDC）分化</td></tr><tr><td>脂多糖（LPS）</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>百日咳毒素（PTX）</td><td>R&amp;D systems</td><td>3097</td><td>EAE 诱导</td></tr><tr><td>MOG (35&amp;ndash;55) 肽段</td><td>21stCentury Biochemicals</td><td>自行合成</td><td>EAE 诱导</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（100X）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>PE 标记 CD80 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>PE 标记 CD86 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>PE 标记 PD-L1 抗体</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>APC 标记 MHCII 抗体</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>APC 标记 CD11c 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>同型对照 PE 抗体</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>同型对照 APC 抗体</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>泛树突状细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>FcR 封闭试剂</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>泛树突状细胞生物素标记抗体混合物</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>抗生物素微珠</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>CD4+ T 细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>CD4+ T 细胞生物素标记抗体混合物</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>抗生物素微珠</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>骨髓来源树突状细胞（BMDC）分化</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>3 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>骨髓来源树突状细胞（BMDC）分化</td></tr><tr><td>25G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>23G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>骨髓来源树突状细胞（BMDC）分化</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>A2058</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>分离前过滤器</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>11088858001</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>卵清蛋白（OVA）肽段 323&amp;ndash;329</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>O1641</td><td>T 细胞增殖实验</td></tr><tr><td>小鼠 IFN-&amp;gamma; TaqMan 探针</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>小鼠 IL-12a TaqMan 探针</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>小鼠 IL-12 p70 DuoSet ELISA 试剂盒</td><td>R&amp;D systems</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>小鼠 EDN-1 ELISA 试剂盒</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha; TaqMan 探针</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>小鼠 TNF-&amp;alpha; Quantikine ELISA 试剂盒</td><td>R&amp;D systems</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 TaqMan 探针</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>小鼠 IL-6 Quantikine ELISA 试剂盒</td><td>R&amp;D systems</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a TaqMan 探针</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>小鼠 IL-23 DuoSet ELISA 试剂盒</td><td>R&amp;D systems</td><td>DY1887-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 TaqMan 探针</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 TaqMan 探针</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta; TaqMan 探针</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>抗血红素氧合酶 1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-肌动蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur 细胞分析仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞术</td></tr></tbody></table>

小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

免疫系统通过在针对外来抗原的免疫应答与对自身抗原以及共生微生物来源抗原的耐受状态之间维持精密平衡来发挥作用。这种免疫稳态的破坏可导致慢性炎症以及自身免疫性疾病的发生。树突状细胞（Dendritic cells, DCs）是天然免疫系统中的专职抗原呈递细胞，能够激活初始T细胞，从而启动针对外来抗原的免疫应答。然而，DCs也可被诱导分化为耐受性树突状细胞（Tolerogenic dendritic cells, TolDCs），后者通过维持和促进T细胞耐受、抑制效应细胞活性，防止自身免疫或慢性炎症性疾病的发生。近年来对TolDCs的深入研究揭示，通过调控DCs的分化条件可实现其耐受表型的建立。这一发现极大地推动了以TolDCs为基础的免疫疗法在多种因免疫耐受失衡所致免疫紊乱疾病中的应用发展。在多种自身免疫性疾病的临床前小鼠模型中，相关研究已成功验证了TolDCs作为免疫治疗手段的有效性。目前，TolDCs已成为临床中一种极具前景的免疫治疗工具，可在不影响保护性免疫的前提下，靶向抑制致病性自身免疫反应，从而重建多种免疫紊乱疾病中的免疫耐受。尽管多个实验室已提出多种诱导TolDCs的策略，但目前在这些细胞的细胞表型与功能特征鉴定方面仍缺乏统一标准。本实验方案提供了一套逐步操作指南，用于大量制备骨髓来源的DCs，采用合成三萜类化合物2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9-二烯-28-酸-二氟丙基酰胺（CDDO-DFPA）将其特异性诱导分化为TolDCs，并介绍用于确认其表型的技术方法，包括对TolDCs关键分子标志物的分析。最后，我们展示了一种通过检测其免疫抑制功能来评估TolDCs生物学活性的方法。

耐受性树突状细胞，免疫耐受，树突状细胞，CDDO-DFPA，骨髓来源树突状细胞，免疫疗法，自身免疫，慢性炎症，T细胞耐受，免疫稳态 体外 和 体内 在多发性硬化症的临床前模型中。

骨髓来源树突状细胞的分化与筛选：
骨髓祖细胞在含有GM-CSF和IL-4的完全RPMI培养基中培养7天，以诱导其分化为不成熟树突状细胞（iDCs）（图1A）。第1天时，细胞体积较小，呈球形。在第3天更换新鲜培养基前用PBS洗涤，有助于细胞形成聚集体，并增加CD11c+细胞的比例。第4天时，骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）体积增大，并开始形成聚集体；同时在培养板底部观察到贴壁的巨噬细胞转化为长梭形。第5天时，BMDCs形成较大规模的细胞聚集体。第6天时，可观察到大量半贴壁和悬浮生长的BMDCs。第7天收获BMDCs，并通过流式细胞术检测CD11c的表达，作为小鼠树突状细胞的特异性标志物。如图1B所示的代表性流式细胞术图谱，该方法获得的BMDCs中约有83.6%表达CD11c。</...

本文介绍了一种用于开发和表征耐受性树突状细胞（TolDCs）并评估其免疫治疗效用的实验方案。

免疫系统通过在协调针对外来抗原的应答与维持对自身抗原的无反应状态之间保持严格平衡来发挥作用……

本实验方案的总体目标是开发并表征小鼠耐受性树突状细胞，以评估其在治疗多发性硬化等自身免疫性疾病中的免疫治疗潜力。该方法通过提供一种标准化的耐受性树突状细胞培养与功能表征方法，有助于解答耐受性树突状细胞治疗领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，可用于成功诱导耐受性树突状细胞的生成，并进行其功能有效性检测。该技术的意义重大，可进一步推动针对自身免疫性疾病的细胞免疫治疗的发展，因为耐受性树突状细胞能够在保持自身固有免疫调节机制的前提下，重置异常的免疫反应。根据标准操作流程，取8至10周龄的C57BL/6小鼠的后肢骨骼，使用手术刀片和镊子尽可能剥离全部组织，将清洁的胫骨和股骨置于含有70%乙醇的6厘米培养皿中。使用手术刀修剪骨骼的两端，并用配备23号针头的3毫升注射器，将3毫升PBS冲洗液注入第一根骨骼中，以冲出骨髓至15毫升锥形管中。当所有骨髓均收集完毕后，离心细胞悬液，并将沉淀物重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中。5分钟后，加入9毫升PBS终止裂解反应，再通过离心收集细胞。将白色骨髓细胞沉淀重悬于10毫升培养基中，通过40微米细胞筛网过滤至新离心管中。用添加了GM-CSF和IL-4的培养基将细胞调整至浓度为1×10⁶个细胞/毫升。每孔加入3毫升细胞悬液至6孔板中，于37°C、5% CO₂条件下培养3天。第三天，用两毫升 PBS 轻柔振荡洗涤每个孔中的细胞，以去除未贴壁的细胞。随后，向每个孔中加入三毫升新鲜培养基（补充 GM-CSF 和 IL-4），并将细胞放回细胞培养箱中。两天后，向每个孔中再添加三毫升新鲜培养基（补充细胞因子）。培养第七天，将培养板置于冰上。孵育10分钟后，轻轻吹打每孔中的培养基，使松散贴壁的、未成熟的骨髓来源树突状细胞悬浮。随后，收集细胞悬液，离心后弃上清，并将细胞沉淀重悬于适当体积的新鲜培养基中，用于后续分析。为检测同基因型T细胞的增殖，首先取8至10周龄的OT2 C57BL/6小鼠脾脏，用3毫升注射器活塞尾端将其研磨通过40微米细胞筛网，并用PBS冲洗筛网。通过离心收集混合的细胞悬液，将沉淀重悬于400 µL磁性细胞分选缓冲液和100 µL CD4阳性T细胞生物素标记抗体混合液中，于4°C孵育5分钟。孵育结束后，向细胞中加入300 µL分选缓冲液和200 µL抗生物素磁珠，于4°C继续孵育10分钟，并将磁珠分选柱和预分离滤器放入合适尺寸的细胞分离磁铁中。用3 mL分选缓冲液冲洗分选柱，然后向细胞中加入9 mL分选缓冲液。离心后，用三毫升分选缓冲液重悬细胞和磁珠沉淀，并将细胞悬液加入柱中，以适当容器收集 CD4 阳性 T 细胞穿流液。随后用另三毫升分选缓冲液洗涤柱子，收集流穿液，并将 T 细胞置于冰上。对于同源性脾脏总树突状细胞的分离，取一只 8 至 10 周龄的 C57BL/6 小鼠的脾脏，置于一个六厘米培养皿中，使用配备 25 号针头的 1 毫升注射器，将一毫升胶原酶 D 溶液向脾脏内注射两次。接下来，使用剪刀将脾脏剪成小块，并在室温下振荡孵育25分钟。孵育结束后，向组织悬液中加入500微升0.5摩尔的EDTA，室温下再孵育5分钟。孵育结束后，用3毫升注射器活塞的末端将脾脏悬液碾压通过40微米细胞筛网，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于350微升磁性细胞分选缓冲液、50微升Fc受体阻断试剂和100微升泛树突状细胞生物素标记抗体混合液中，在4摄氏度孵育10分钟。孵育结束后，用9毫升分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于800微升新鲜分选缓冲液中，加入200微升抗生物素磁珠，在4摄氏度孵育10分钟，以通过磁珠分选法分离脾脏泛树突状细胞群体，方法如前所述。将细胞重悬至浓度为每毫升2×10⁵个树突状细胞，并在37摄氏度下用适当实验浓度的目标三萜化合物处理1小时。在孵育的最后三分之一阶段，将T细胞以每毫升1×10⁷个细胞的浓度重悬于1微摩尔CFSE中，在37摄氏度下孵育15分钟。随后用PBS洗涤细胞，并调整体积至最终浓度为每毫升2×10⁶个T细胞。在96孔板的每个孔中，将100微升经处理的树突状细胞与100微升CFSE标记的CD4阳性T细胞共培养，并向其中加入每毫升100纳克的OVA肽323-329，孵育2至3天后通过流式细胞术检测T细胞的CFSE荧光强度。在完全培养基中培养骨髓祖细胞，并在存在GM-CSF和IL-4的条件下培养六天后，细胞呈现未成熟树突状细胞的形态。对培养第七天的骨髓来源树突状细胞进行分析，结果显示大多数培养细胞强烈表达CD11c，这是一种特异性的鼠源树突状细胞标志物。尽管CDDO-DFPA处理对LPS诱导的成熟标志物表达无明显影响，但骨髓来源树突状细胞在CDDO-DFPA处理下表现出耐受性树突状细胞的特征，表现为促炎基因表达显著降低，且即使在LPS刺激后，抗炎细胞因子基因表达仍增强。此外，在体外共培养实验中，当卵清蛋白（OVA）由经 CDDO-DFPA 处理的树突状细胞呈递时，可观察到同基因型 OVA 特异性 T 细胞增殖显著减少；在体内实验中，注射经 MOG 脉冲并用 CDDO-DFPA 处理的树突状细胞后，实验性自身免疫性脑脊髓炎的进展延迟，进一步证实了这些细胞的耐受性表型。一旦掌握该技术，若实验操作得当，可在八天内获得耐受性树突状细胞。在进行该操作时，需注意耐受性树突状细胞并非均一的细胞群体。其细胞表型取决于用于诱导其耐受性的试剂的性质。通过此操作步骤，还可进行其他方法，例如详细的流式细胞术分析，以进一步探究耐受性树突状细胞所诱导的抗原特异性T细胞无能或凋亡情况，以及T细胞分化能力等问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用已知试剂制备具有功能活性的耐受性树突状细胞，或如何检测新物质诱导此类细胞的能力。

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小鼠致耐受性树突状细胞的发育及功能表征

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从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

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用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

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从单核细胞生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞

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免疫调节药剂对树突状细胞与CD4+ T细胞相互作用的影响

本方案描述了利用FACS介导的细胞分离、水动力基因转移以及Peyer氏斑中免疫细胞亚群的流式分析等技术，评估浆细胞样树突状细胞由共同树突状细胞前体在Peyer氏斑中分化过程的实验步骤。...

采用造血祖细胞过继转移法评估派伊尔集合淋巴结中鼠源浆细胞样树突状细胞的发育

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一种高效且高得率的小鼠树突状细胞亚群分离方法

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外...

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

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一种简单高效的人CD14+单核细胞诱导耐受性树突状细胞以筛选免疫调节剂的方法

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小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

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