Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

该方案的总体目标是开发和表征小鼠致耐受性树突状细胞，以评估它们在治疗自身免疫性疾病（如多发性硬化症）中的免疫治疗效用。该方法通过提供一种标准化方法来开发和表征致耐受性树突状细胞，可以帮助回答致耐受性树突状细胞治疗领域的关键问题。该技术的主要优点是可用于成功的致耐受性树突状细胞发育和功能性致耐受性树突状细胞功效测试。

这种技术的意义是巨大的。它们延伸到自身免疫性疾病的细胞免疫疗法的开发，因为致耐受性树突状细胞可以重置异常免疫反应，同时保持受内在免疫调节机制的约束。根据标准方案，从 8 至 10 周龄的 C57BL/6 小鼠收获后腿骨后，使用手术刀片和镊子解剖尽可能多的组织，并将干净的胫骨和股骨放入含有 70% 乙醇的 6 厘米培养皿中。

用手术刀片修剪骨骼的两端，并使用配备 23 号针头的 3 毫升注射器，用 3 毫升 PBS 将第一块骨头的骨髓冲洗到 15 毫升锥形管中。收集完所有骨髓后，离心细胞悬液并将沉淀重悬于 1 毫升红细胞裂解缓冲液中。5 分钟后，用 9 mL PBS 停止裂解，并通过离心收集细胞。

白色骨髓细胞沉淀重悬于 10 毫升培养基中，并通过 40 微米细胞过滤器将细胞过滤到新管中。在补充有 GM-CSF 和 IL-4 的培养基中，将细胞调整为每毫升浓度的 1 倍 10 到 6 个细胞。并将 3 毫升细胞接种到 6 孔板的每个孔中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 3 天。

第三天，用 2 mL PBS 洗涤每个孔中的细胞，轻轻旋转以去除非贴壁细胞。然后用 3 毫升补充有 GM-CSF 和 IL-4 的新鲜培养基喂养细胞，并在两天后将细胞放回细胞培养箱中，在每个孔中再添加 3 毫升补充有细胞因子的新鲜培养基。在培养的第七天，将板放在冰上。

10 分钟后，轻轻移液每个孔中的培养基，将松散粘附的未成熟骨髓来源的树突状细胞移入悬浮液中。然后，通过离心混合细胞进行收集，并将沉淀重悬于适当体积的新鲜培养基中，用于后续下游分析。为了测量同基因 T 细胞增殖，首先使用 3 毫升注射器柱塞的后端，通过 40 微米细胞过滤器捣碎 8 至 10 周龄 OT2 C57BL/6 小鼠的脾脏，然后用 PBS 冲洗过滤器。

通过离心沉淀混合的细胞悬液，并在 4 摄氏度下将沉淀重悬于 400 μL 磁性细胞分选缓冲液和 100 μL CD4 阳性 T 细胞生物素-抗体混合物中 5 分钟。孵育结束时，向细胞中加入 300 μL 分选缓冲液和 200 μL 抗生物素微珠，在 4 °C 下孵育 10 分钟，并将磁珠柱和预分离过滤器放入适当大小的细胞分离磁力架中。用 3 ml 分选缓冲液冲洗色谱柱，并向细胞中加入 9 ml 分选缓冲液。

离心后，将细胞和微珠沉淀重悬于 3 mL 分选缓冲液中，并将细胞悬液添加到柱中，以将 CD4 阳性 T 细胞洗脱液收集在适当的容器中。然后用另外 3 mL 分选缓冲液洗涤色谱柱，收集流出液并将 T 细胞置于冰上。对于同基因脾泛树突状细胞分离，将 8 至 10 周龄 C57BL/6 小鼠的脾脏放入 6 厘米的培养皿中，并使用配备 25 号针头的 1 毫升注射器将 1 毫升胶原酶 D 溶液注射到脾脏中两次。

接下来，用剪刀将脾脏切成小块，并在室温下摇动孵育 25 分钟。孵育结束时，向组织浆液中加入 500 μL 0.5 mol EDTA，在室温下进行最后 5 分钟的孵育。孵育结束时，使用 3 ml 注射器柱塞的后端通过 40 μm 细胞过滤器捣碎脾浆液，并通过离心收集细胞。

沉淀重悬于 350 μL 磁性细胞分选缓冲液、50 μL Fc 受体阻断试剂和 100 μL 泛树突状细胞生物素-抗体混合物中，在 4 °C 下孵育 10 分钟。孵育结束时，在 9 mL 分选缓冲液中洗涤细胞，并在 4 摄氏度下将沉淀重悬于 800 μL 新鲜分选缓冲液和 200 μL 抗生物素珠中 10 分钟，以便通过磁珠分选分离脾泛树突状细胞群，如刚才所示。以每毫升浓度的 2 倍 10 至第 5 个树突状细胞重悬细胞，并在 37 摄氏度下用适当的实验浓度的感兴趣的三萜类化合物处理它们 1 小时。

在孵育的最后三分之一期间，在 37 摄氏度下以每毫升 10 倍至第 7 个细胞的浓度重悬于一微摩尔 CFSE 中 15 分钟。然后用 PBS 洗涤细胞，并将体积重新调整至终浓度为每毫升 T 细胞的 10 倍至第 6 个 T 细胞的两倍。在 96 孔板的每个孔中共培养 100 微升处理的树突状细胞与 100 微升 CFSE 标记的 CD4 阳性 T 细胞，并向细胞中加入每毫升 100 纳克 OVA 肽 323-329，孵育两至三天后通过流式细胞术测量 T 细胞的 CFSE 强度。

在 GM-CSF 和 IL-4 存在下，在完全培养基中培养的骨髓祖细胞在培养 6 天后表现出未成熟的树突状细胞形态。对未成熟第 7 天的骨髓来源的树突状细胞的分析揭示了大多数培养细胞对 CD11c（一种特异性小鼠树突状细胞标志物）的强烈表达。尽管对 LPS 诱导的成熟标志物的表达没有影响，但骨髓来源的树突状细胞在响应 CDDO-DFPA 处理后表现出耐受性树突状细胞谱，即使在 LPS 刺激后，促炎基因表达的显着降低和抗炎细胞因子基因表达的增强也证明了这一点。

此外，在体外共培养中观察到同基因 OVA 特异性 T 细胞增殖的显着减少，其中 OVA 由 CDDO-DFPA 处理的树突状细胞和体内呈递，注射 MOG 脉冲 CDDO-DFPA 处理的树突状细胞后延迟进展为实验性自身免疫性脑脊髓炎，进一步证实了这些细胞的耐受性表型。一旦掌握了这项技术，如果实验进行得当，可以在 8 天内产生耐受性的树突状细胞。在尝试此过程时，重要的是要记住，致耐受性树突状细胞不是同质的。

它们的细胞表型取决于用于诱导其耐受性的药物的性质。在此程序之后，可以执行其他方法，例如详细的流式细胞术分析，以回答有关致耐受性树突状细胞诱导的抗原特异性 T 细胞能量或细胞凋亡或 T 细胞分化能力的其他问题。观看本视频后，您应该对如何使用已知试剂开发功能活跃的致耐受性树突状细胞或如何测试新物质诱导这些细胞的能力有很好的了解。