Name: 免疫刺激性剂评价: 淋巴组织提取与注射路径依赖性树突状细胞活化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学习从小鼠体内分离纵隔淋巴结的技术，用于评估免疫刺激性纳米材料对淋巴树突状细胞活化的影响。该方法通过多种注射途径研究免疫反应机制，为免疫学研究提供可靠的实验方案。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过创意材料发现计划资助，该计划由韩国科技、信息通信和未来规划部资助（NRF-2017M3D1A1039421），并由韩国海洋水产部资助的海洋生物技术计划及一项拨款（20150220）支持。

所有实验操作，包括动物处理、处死和器官分离，均严格遵循上海公共卫生临床中心和峨山医学中心国际动物护理与使用委员会的规定进行。本研究方案已获得上海公共卫生临床中心动物实验伦理委员会（小鼠实验许可编号：SYXK-2010-0098）和峨山医学中心（2016-02-168）的批准。
1. 材料准备
注意：本研究采用了一种由自组装脂质-DNA载体U4T和含CpG基序的寡核苷酸eCpG组成的纳米佐剂INP，用于测试在小鼠中进行免疫治疗和疫苗接种的合适注射途径2。重要的是，其他潜在的治疗分子，如抗原、抗体和佐剂，可替代INP，并使用下述相同的方法进行测试。
<ol>
	<li>INP 制剂2,4,7
	<ol>
		<li>在 1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和 MgCl2（2 mM）存在下，将 U4T（160 µM，载体）与 eCpG（80 µM，含 TLR9 激动剂序列）退火。退火的标准体积为 50 至 110 µL，置于 PCR 管中。使用热循环仪将混合物加热至 95 °C 持续 10 分钟，然后缓慢冷却（1 °C/16 分钟）至 25 °C。退火程序约需 2 小时。 
		警告：含 U4T 的液体极易起泡，必须小心操作。</li>
		<li>将 INP 制备物分装为每份 50 µL；每次注射使用 50 µL 材料。 
		注意：若每次注射需 100 µL，则应按照适当计算重新进行步骤 1.1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 动物实验通用操作规程
注意：可根据实验室要求和批准的动物实验方案采用不同的小鼠操作方法8。所使用的小鼠为6周龄C57BL/6品系雌性小鼠。
<ol>
	<li>材料清单
	<ol>
		<li>准备液态麻醉剂（异氟烷）、麻醉机、二氧化碳（CO2)&#160;吸入室、灭菌纱布、镊子、小鼠固定器、手套、弯头镊、1英寸解剖剪、2英寸解剖剪、用于消毒的酒精以及胰岛素注射器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸入麻醉 
	注意：对小鼠进行鼻内、皮下、足垫及静脉注射时，必须实施麻醉9。本操作使用连接有挥发器和氧气瓶的诱导室。
	<ol>
		<li>将动物放入诱导室，并确保盖子紧密关闭。</li>
		<li>以1 L/min的流速通入氧气，并将挥发器设定为4%的异氟烷诱导浓度。</li>
		<li>根据动物体重调整其在诱导室内的暴露时间；但至少需暴露10秒以上，并每5分钟监测一次麻醉状态10。 
		注意：无足底反射表明麻醉成功。</li>
		<li>关闭异氟烷诱导装置，继续以1 L/min流速通入氧气，以防止操作人员接触异氟烷气体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安乐死
	<ol>
		<li>按照美国国立卫生研究院（NIH）&#34;使用二氧化碳对啮齿类动物实施安乐死的指南&#34;11准备用于CO2吸入法安乐死的密闭室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测试咽反射以确认动物已完全死亡。
	<ol>
		<li>通过夹捏小鼠足尖并确认无咽反射来验证其是否已正确实施安乐死。若存在反应，则重复步骤2.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消毒
	<ol>
		<li>使用酒精喷雾和灭菌纱布对所有用于注射或解剖的表面区域进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>器官储存
	<ol>
		<li>使用镊子去除所采集器官周围的所有脂肪和血液。将这些采集的组织分别存放于含有3 mL PBS的培养皿中。容器和保存液可根据后续实验要求有所不同。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 注射途径
<ol>
	<li>采用六种注射方法研究与注射途径相关的免疫反应：口服、鼻内、皮下、足垫、腹腔和静脉注射8,12,13。</li>
</ol>
4. 淋巴结和脾脏的分离
注意：应使用年轻且健康的瘦型小鼠（6周龄）进行这些操作，因为老年小鼠淋巴结周围通常会积聚脂肪，难以清除，可能影响器官的清晰观察。
<ol>
	<li>收获前步骤 
	注意：本节描述了从小鼠中收获注射后腹股沟淋巴结（iLN）、脾脏和纵隔淋巴结（mLN）的步骤，用于分析免疫刺激。有关处死、gag反应及消毒方法，请参见步骤2.3-2.5。
	<ol>
		<li>将小鼠四肢用大头针固定于手术泡沫板上，并用70%乙醇对小鼠腹侧进行消毒。</li>
		<li>选择距生殖器区域上方约2 cm处，使用弯头镊子将外层皮肤向上提起呈帐篷状。在此位置做约1 cm切口，将剪刀（2英寸）插入皮下并继续剪开组织。</li>
		<li>对于皮肤组织，使用剪刀双臂（2英寸）垂直剪开外层皮肤，暴露被腹膜覆盖的内脏器官。</li>
		<li>将外层皮肤用大头针固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹股沟淋巴结（iLN）的分离
	<ol>
		<li>在腿部左侧沿左后肢下行血管的分叉处（呈倾斜的“Y”形）定位iLN。 
		注意：对于皮下注射的小鼠，应选择与注射部位同侧的iLN。</li>
		<li>使用两把镊子分离组织层，撕开覆盖的脂肪层，收获呈浅黄色、豆状、长约2 mm的iLN。后续组织处理与保存方法见步骤2.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脾脏的分离14
	<ol>
		<li>一手使用弯头镊子在腹膜中央提起形成帐篷状，另一手持小而细的剪刀（1英寸）剪开腹膜。</li>
		<li>左手持弯头镊子抓住肠道并翻转，以定位附着于小鼠腹部左上方、形似红芸豆的脾脏（长约14 mm）。</li>
		<li>右手使用另一把镊子轻轻拉出脾脏，同时用弯头镊子分离周围其他组织。脾脏的保存方法见步骤2.6。 
		注意：脾脏为柔软易损器官，收获时需格外小心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纵隔淋巴结（mLN）的分离 
	注意：mLN位于肋骨下方约1 cm处，被心脏和肺等器官覆盖。由于其位置较深且体积较小，需使用镊子和剪刀（1英寸）仔细暴露周围区域。
	<ol>
		<li>剪开膈肌并将其从肋骨分离。用镊子夹住肋骨部分，再用剪刀（1英寸）剪开左右两侧肋骨。将切断的肋骨翻折至小鼠右肩上方，以暴露心脏和肺。 
		注意：操作时需避免切断心脏和肺周围的血管，否则血液渗出会严重影响透明微小的mLN的定位。若发生出血，可用纱布轻轻吸除局部血液。</li>
		<li>右手持弯头镊子将心脏和肺轻轻向右翻转，直至脊柱充分暴露。左手持普通镊子，在右手弯头镊子协助下完成mLN的收获。</li>
		<li>抓住肺组织并翻转，直至脊柱区域广泛暴露。mLN（透明、豆状结构，大小约2 mm）位于肺与脊柱之间。</li>
		<li>使用弯头镊子暴露mLN周围区域，另一把镊子用于取出组织。 
		注意：mLN周围存在多种其他组织，收获前需用镊子小心去除。</li>
		<li>mLN收获后的保存方法见步骤2.7。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 流式细胞术样品的制备
注意：为了检测收获的iLN、脾脏和mLN中树突状细胞（DC）的活化情况，需将这些组织的单细胞悬液用荧光标记的抗体进行染色，抗体针对DC特异性标志物、共刺激分子以及主要组织相容性复合体分子，随后通过流式细胞术进行分析。
<ol>
	<li>单细胞悬液制备：脾脏
	<ol>
		<li>向6 mm培养皿中加入5 mL新鲜培养基（CM），并将样品置于冰上。</li>
		<li>去除周围的血液和脂肪组织，将组织置于培养皿盖内。</li>
		<li>用弯头剪刀将组织剪成小片段（&#60;1 mm），用PBS重悬后，以646 × g离心5 min，弃上清。</li>
		<li>再次将样品重悬于3 mL CM中，加入200 µL含胶原酶IV的2%胎牛血清（FBS）溶液，消化20 min。</li>
		<li>轻轻振荡并在37 °C孵育1 h。将消化后的组织通过尼龙滤网（100 nm）过滤，离心收集细胞。用5 mL PBS洗涤单细胞，离心弃上清。</li>
		<li>将细胞重悬于5 mL细胞分离液中。再加入一层5 mL透明的细胞分离液，形成水相分层结构。</li>
		<li>以2012 × g离心10 min，收集上清液，即为低密度组分（&#60;1.077 g/cm3），用于后续流式细胞术分析。</li>
		<li>用血细胞计数板计数细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞悬液制备：淋巴结
	<ol>
		<li>按照步骤5.1.1–5.1.2操作。</li>
		<li>用10 mL移液器加入5 mL CM，吹打3–4次使细胞充分悬浮。将细胞悬液通过无菌尼龙滤网过滤，收集至15 mL离心管中。</li>
		<li>在4 °C下以646 ×g离心7 min，弃上清。</li>
		<li>再用10 mL移液器加入额外5 mL CM，通过吹打使细胞更好地重悬。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞并计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术分析
	<ol>
		<li>将0.5–1 × 106个细胞分装至每支荧光激活细胞分选（FACS）管中。</li>
		<li>在4 °C下以646 × g离心5 min，吸除上清。</li>
		<li>向细胞中加入每种稀释后的荧光标记抗体溶液各5 µL，重悬细胞沉淀并涡旋混匀。 
		注意：应尽可能避免细胞沉淀暴露于光线下，因为荧光标记抗体对光敏感。建议配制抗体主混合液，并始终加入Fc阻断剂。</li>
		<li>使用100 µL PBS、1%热灭活常规FBS和0.1%叠氮化钠配制FACS缓冲液。</li>
		<li>将样品置于4 °C避光孵育30 min。用2–4 mL FACS缓冲液洗涤细胞，并在4 °C下以1700 rpm离心7 min。</li>
		<li>在避光条件下将细胞重悬于500 µL FACS缓冲液中，进行流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Park, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Preparation+of+dodecynyl+modified+DNA+nanoparticles+with+unmethylated+CpG+adjuvant+and+ovalbumin+for+immunostimulation%22">Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation</a>. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).</li>
<li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li>
<li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li>
<li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.7b00440">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li>
<li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li>
<li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li>
<li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://staff.unimelb.edu.au/__data/assets/pdf_file/0009/1974339/STANDARD-Anaesthesia-for-mice-and-rats-FINAL.pdf">General anesthesia of mice and rats</a>. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22">Guidelines for the Euthanasia of Animals</a>. , Veterinary Record. (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10215/compound-administration-iii">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nri1669">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过药物递送和免疫刺激的治疗研究，纳米技术和免疫学领域已取得诸多进展。众所周知，注射方法的谨慎选择对于免疫刺激至关重要，这也是本研究的重点。
评估了不同注射途径对一种天然无毒且可生物降解的基于DNA的材料INP（免疫刺激性纳米颗粒）的效果，以确定哪种途径能产生最佳结果。该方法也适用于递送其他治疗剂，包括抗体、抗原或其他佐剂。
为了分析对这类注射的免疫应答，需要采集淋巴组织（脾脏、肠系膜淋巴结[iLN]和肠系膜淋巴结[mLN]）。淋巴组织的分离是本实验方案中最关键的步骤，且需要使用一种此前尚未详细描述过的技术。此外，制备用于进一步分析免疫细胞的单细胞悬液的方法也未被充分阐明。本研究重点在于提取淋巴组织，特别是iLN、mLN和脾脏，以分析树突状细胞（DC）的活化情况。全身性免疫应答主要通过脾脏中的免疫细胞介导。此外，特定组织的局部免疫应答则由邻近的淋巴结调控。对于新开发的免疫调节分子，应评估其是否能够在组织中诱导免疫刺激作用。因此，该淋巴组织分离方法及组织中DC活化分析技术可用于评估新开发的免疫刺激分子。
<p class...

免疫学和纳米材料领域的进步已催生出大量潜在的新型治疗策略，可用于生物医学领域，包括药物递送和免疫刺激。给药途径的优化是影响免疫刺激剂疗效的关键因素之一。一种由DNA组成的免疫刺激性纳米颗粒（INP）是一种新开发的纳米免疫佐剂，其通过脂质-DNA的两亲性结构引发微相分离而自组装形成1。因此，本文描述了通过不同途径将该材料1&#160;in vivo给药的INP操作方案，以及三种获取适当组织（如腹股沟淋巴结（iLN）、纵隔淋巴结（mLN）和脾脏）的程序。最后，对这些组织中的树突状细胞（DC）活化情况进行分析，树突状细胞是免疫系统中最强大的抗原呈递细胞。该方案也可用于评估抗原、抗体或其他免疫佐剂2。
我们测试了INP制剂，因为它是一种具有良好前景的试剂。INP是一种含核酸的Toll样受体9（TLR9）佐剂材料，需评估其免疫刺激效能，以验证不同注射方法的效果3在此背景下，树突状细胞（DCs）的刺激是一个强有力的终点指标 体内 评估。当抗原或免疫刺激分子被外周组织或血液中的树突状细胞（DCs）吞噬后，这些细胞会迁移至脾脏和淋巴结等淋巴器官4,5因此，需分析注射动物脾脏、iLN 和 mLN 中的 DC 活化情况。正确采集这些组织对于评估新型佐剂或病原体的免疫应答也至关重要5此类组织采集对于开发新型免疫学方法作为癌症治疗手段也具有重要意义。此外，本方案还可用于验证其他药物（如抗人类免疫缺陷病毒药物）的疗效。6.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td>器官清洗</td></tr><tr><td>(PBS, pH 7.4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷溶液&amp;nbsp;</td><td>Aesica Queenborough limited</td><td>26675-46-7</td><td>麻醉过程</td></tr><tr><td>1 mL 结核菌素注射器 -</td><td>Junglim</td><td>N/A</td><td>注射</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管&amp;nbsp;</td><td>S.P.L</td><td>50050</td><td>麻醉过程</td></tr><tr><td>1 mL 胰岛素注射器&amp;nbsp;</td><td>(BD Ultra-Fine&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;&amp;shy;II)_短针</td><td>324826</td><td>肌肉注射</td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Hyclone</td><td>SH30081.01</td><td>器官保存</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>FACS 分析</td></tr><tr><td>无水乙醇 99.5 %&amp;nbsp;</td><td>Daejung</td><td>4022-4110</td><td>消毒剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FineCycler C100（热循环仪）</td><td>Ssufine</td><td>-</td><td>退火</td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td>离心</td></tr><tr><td>FACS 管&amp;nbsp;</td><td>FALCON</td><td>2052</td><td>FACS 分析</td></tr><tr><td>自动化高性能流式细胞仪</td><td>BD (USA), FACSVerse</td><td>-</td><td>FACS 分析</td></tr></tbody></table>

免疫刺激剂评估：淋巴组织提取及依赖注射途径的树突状细胞激活

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

为了评估一种用于免疫治疗或疫苗接种的新治疗剂，对淋巴组织中免疫细胞活化的分析至关重要。本文研究了以纳米颗粒形式存在的新型脂质-DNA 免疫刺激剂在小鼠中通过不同给药途径（口服、鼻内、皮下、足垫、腹腔和静脉注射）所产生的免疫学效应。这些注射方式会直接影响免疫反应，而获取淋巴组织并分析其中树突状细胞（DC）的活化状态是此类评估的关键环节。纵隔淋巴结（mLN）的提取因该器官的大小和位置而显得尤为重要且较为复杂。本文详细描述了一种分步获取腹股沟淋巴结（iLN）、纵隔淋巴结（mLN）和脾脏，并通过流式细胞术分析 DC 活化状态的操作流程。

为了评估INP在淋巴组织树突状细胞（DC）激活中的合适注射途径，将脾脏、iLN和mLN中的DC群体定义为-CD11c+细胞，并分析了共刺激分子的表达水平。通过皮下（s.c.）和静脉（i.v.）注射INP处理后，脾脏和iLN中DC的CD40、CD80和CD86表达水平显著升高（图2B和2C）。与PBS处理的对照组相比，足垫和腹腔（i.p.）注射INP也显著上调了脾脏和iLN中DC的CD40、CD80和CD86表达水平（图2B和2C）。在mLN DC中，与PBS对照组相比，鼻内（i.n.）注射INP对共刺激分子的上调作用最为显著（图2D）。i.p.和i.v.注射INP也在mLN中诱导...

在给予免疫刺激性纳米材料处理后，描述了后续提取淋巴组织以检测淋巴样树突状细胞活化的实验步骤。

为了评估一种新的免疫治疗或疫苗接种用治疗剂，对淋巴组织中免疫细胞活化的分析至关重要。这里，我们……

本实验的总体目标是熟悉从小鼠中分离纵隔淋巴结所需的独特技术。该手术操作是在小鼠体内通过六种不同途径注射免疫刺激物后进行的。在本研究中，我们使用了一类能够形成纳米级结构的新型材料。表面活性剂由亲水性头部基团和疏水性尾部组成。由于微相分离，这些分子会形成球形胶束或其他二级结构。我们利用这一特性来作用于DNA这种生物大分子。DNA 两亲分子如图所示，与常规核苷酸 A、C、G、T 一样具有亲水区段，而脂质修饰的神经细胞碱基则作为疏水单元。该修饰寡核苷酸通过 DNA 合成仪大规模合成了八聚体。在等介质中，这些两亲性脂质 DNA 可自发形成纳米级球形胶束。当胶束形成时，DNA 保持单链状态，作为直径约10纳米的空载体存在。为了使载体具备免疫刺激功能，只需将DNA序列延伸，加入以eCpG命名的Toll样受体9佐剂即可。因此，脂质DNA与eCpG在此结合，使得胶束的外表面带有CpG序列。随后我们将这种免疫刺激性纳米颗粒命名为INP。为了确定INP引发免疫反应的最佳方式，我们通过64种不同的注射途径将INP注射到小鼠体内，并对相应的淋巴结组织进行了分析。有关更详细的注射操作说明，请参考Charles River于2012年发表的一篇JOB文章。本视频的主要优势在于直观展示如何获取纵隔淋巴结。视频明确标出了纵隔淋巴结的位置，而许多人在分离器官时对此感到困难。所有实验均按照上海公共卫生临床中心或首尔大学医学院机构动物护理和使用委员会的指南进行。本部分将展示用于免疫学分析的关键器官或组织的具体位置。将分离脾脏和两个淋巴结。首先，根据机构动物护理和使用委员会的指导原则，通过吸入二氧化碳的方式对小鼠实施安乐死，并尽一切努力将动物痛苦降至最低。从现在开始，让我们找到器官并将其分离。首先，用四枚大头针将小鼠的掌部固定在手术台上，确保小鼠被妥善固定。用酒精对解剖区域进行消毒。使用大号剪刀解剖小鼠腹部底端的外层组织。用镊子打开两侧附着处，并用大头针固定在手术台上。通过寻找通向左后肢的血管交汇处，暴露腹股沟淋巴结的位置。容器的形状类似于倾斜的字母 Y。用镊子揭开该层组织，并从皮肤上将其拉开。使用较小的剪刀剪开腹膜，以暴露内部器官。用镊子将肠道移向右侧，然后在腹腔左上方可见的脾脏周围进行包裹。由于脾脏容易破损，操作过程中需格外小心。最后是本视频的关键步骤：获取纵隔淋巴结。该淋巴结位于肺上部的下方，因其体积较小且位置较隐蔽，较难观察。使用小剪刀和镊子小心地暴露该区域。同时剪开肋骨两侧和膈肌。用夹子夹住胸腔上方剪下的肋骨断端。操作过程中应避免损伤心脏和血管，以免血液遮蔽视野，影响寻找透明的纵隔淋巴结。若不慎导致血管破裂，应用纱布轻轻擦拭清除血液。抓住肺的左侧，轻柔地将其翻转至另一侧，以观察肺下方区域。使用镊子提起纵隔淋巴结。在收获纵隔淋巴结后，务必彻底去除淋巴结周围的所有脂肪和血液，因为不需要的组织可能会影响分析结果。最后，将所有分离的器官置于盛有培养基的培养皿中。在此流式细胞仪上分析了总计 0.1 × 10⁶ 个细胞。根据前向散射光和侧向散射光信号对白细胞群体设门，并通过阴性染色排除非特异性细胞。在通过 64 种注射途径进行 INP 注射后 24 小时，收集脾脏、腹股沟淋巴结和纵隔淋巴结，并通过流式细胞术分析树突状细胞（DC）的活化情况。根据流式细胞术策略，DC群体被定义为活体白细胞中CD11C阳性且谱系标记阴性的细胞。值得注意的是，与PBS对照组相比，鼻内注射INP显著促进了纵隔淋巴结中CD40、80和86的表达。因此，这些数据表明，鼻内注射INP可作为黏膜佐剂，用于增强肺部免疫反应。

immunostimulatory-agent-evaluation-lymphoid-tissue-extraction

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

免疫刺激性剂评价: 淋巴组织提取与注射路径依赖性树突状细胞活化

本视频演示了一种使用免疫调节药理学试剂将树突状细胞（DCs）转化为耐受性树突状细胞（TolDCs）的方法。通过评估TolDCs对CD4+...

免疫调节药剂对树突状细胞与CD4+ T细胞相互作用的影响

本文描述了用于肿瘤免疫治疗的自体树突状细胞（DCs）大规模制备的最常用方法。该方法利用IL-4和GM-CSF诱导单核细胞分化为树突状细胞。未成熟的树突状细胞经刺激成熟后，负载抗原，再回输至患者体内。...

用于免疫治疗的肿瘤抗原负载成熟树突状细胞的制备

预防性和治疗性疫苗常因疫苗向淋巴结引流较弱，导致免疫细胞参与不足，难以激发强烈的免疫反应。通过将疫苗直接注射至淋巴结，即所谓的淋巴内注射，可显著提高疫苗的有效性，并减少疫苗使用剂量。...

小鼠淋巴内免疫治疗与疫苗接种

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外...

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）能够感知微量的危险相关分子，因此极易被启动。本文提供了从血液和肿瘤中分离MoDC并利用免疫复合物对其进行激活的详细方案，同时强调了应考虑的关键注意事项，以避免其过早激活。...

小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活

本文介绍了一种标准免疫学技术（CFSE标记的OT-I增殖）的应用，旨在快速监测佐剂介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在体内的生成。in...

快速 体内 评估佐剂在疫苗开发中诱导细胞毒性T淋巴细胞的能力

本文介绍了一种用于开发和表征耐受性树突状细胞（TolDCs）并评估其免疫治疗效用的实验方案。...

小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

在此，我们介绍一种实验方案 体内 GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞（DC）对初始CD4...

一个 在体 内 用于测量骨髓来源树突状细胞诱导的初始CD4 T细胞活化、增殖及Th1分化的 小鼠模型

转免疫化（TI）装置或培养板及相关实验方案已在实验条件下开发，用于模拟体外光化学疗法（ECP）的关键特征，从而生成生理活化且可调控的树突状细胞（DCs），用于癌症免疫治疗。...

生成生理免疫原性树突状细胞的新方法

该方法描述了牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）的制备及其应用 体外...

利用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性

我们描述了一种评估药物制剂能否将未经处理的单核细胞来源的树突状细胞转化为耐受性树突状细胞的方法 体外...

一种简单高效的人CD14+单核细胞诱导耐受性树突状细胞以筛选免疫调节剂的方法

学习从小鼠体内分离纵隔淋巴结的技术，用于评估免疫刺激性纳米材料对淋巴树突状细胞活化的影响。该方法通过多种注射途径研究免疫反应机制，为免疫学研究提供可靠的实验方案。

免疫刺激剂评估：淋巴组织提取及依赖注射途径的树突状细胞激活

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