高效生成人多能干细胞在贴壁培养中分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1⁺ 后前肠/胰腺前体细胞

该技术的主要优势在于，刺激前细胞被均匀分散，并在细胞黏附过程中同时受到均匀刺激。为我们演示该实验步骤的是本实验室的研究生Azuma Kimura。开始此操作时，将六毫升RPMI 1640培养基转移至置于冰上、已预冷至4°C的离心管中。

使用预冷的1毫升移液枪头，加入2毫克基底膜基质。通过轻柔吹打充分混匀，制成浓度为0.33毫克/毫升的基底膜基质溶液。接着，用移液器将2毫升稀释后的基底膜基质溶液转移至6孔细胞培养板的每个孔中。

将培养板在37摄氏度下孵育60至90分钟。之后，将培养板置于室温下，最多可保存3小时，直至准备使用。首先，吸除用过的培养基，然后使用移液器向六孔板中每个孔加入2毫升0.5毫摩尔的EDTA，以洗涤培养的hPCSs。

然后，吸出各孔中的EDTA，并向每孔加入2毫升新鲜的0.5毫摩尔EDTA。将培养板在37°C孵育5分钟。随后，吸出每孔中的EDTA。

向每个孔中加入1毫升室温的hPSC维持培养基，培养基中添加10微摩尔Y27632。用移液器轻柔但迅速地吹打，使贴壁细胞脱落，并将聚集成团的细胞解离为单细胞。将细胞悬液转移至含有4毫升hPSC维持培养基（每孔培养基中均添加10微摩尔Y27632）的50毫升离心管中，通过移液吹打混匀。

接下来，将15微升细胞悬液与15微升台盼蓝在离心管中混合。使用10微升移液器，将10微升稀释后的细胞悬液重复加入细胞计数板中。利用自动细胞计数仪对细胞数量进行计数，并计算细胞悬液中的细胞密度。

将细胞悬液按每孔100万至150万个细胞的密度分装至50毫升离心管中。在室温下以200 × g离心5分钟。随后，用移液器吸除上清液，并按每孔加入1毫升阶段1A培养基重悬细胞。

轻轻吹打细胞悬液，然后每孔加入一毫升阶段1A培养基。使用1000微升移液器，从先前准备好的细胞培养板的孔中吸取稀释后的基底膜基质。立即轻轻吹打管中的悬液，并将两毫升转移至六孔板的每个孔中。

用铝箔覆盖培养板以避光，并将培养板置于室温下的洁净台面上静置10至15分钟。之后，小心地将培养板转移至37摄氏度、含5%二氧化碳及湿润环境的培养箱中孵育24小时。首先轻轻振荡培养板，然后使用移液器吸取弃去旧培养基。

然后，向每个孔中加入 2 毫升 DPBS。轻轻再次振荡培养板，并吸除用过的 DPBS。向每个孔中加入 4 毫升预热至 37 摄氏度的 1B 阶段培养基。

将培养板小心转移至37摄氏度、含5%二氧化碳及湿润环境的培养箱中，培养48小时。此后，轻轻振荡培养板并吸除用过的培养基。向每孔加入2毫升DPBS。

用 DPBS 再重复一次吸液和添加操作。轻轻摇晃培养板，吸去用过的 DPBS。向每个孔中加入 4 毫升预热至 37 摄氏度的 1B 阶段培养基。

将培养板小心转移至37摄氏度、含5%二氧化碳及湿润环境的培养箱中，培养24小时。首先，轻轻摇动培养板并吸除用过的培养基。向六孔板的每孔中加入2毫升DPBS。

然后，轻轻晃动培养板并吸去用过的 DPBS。向每个孔中加入 4 毫升预热至 37 摄氏度的第二阶段培养基。小心将培养板转移至含 5% 二氧化碳及湿润环境的 37 摄氏度培养箱中，培养四天。

轻轻摇动培养板并吸去用过的培养基。每孔加入 2 mL DPBS。重复吸去和加入 DPBS 的操作一次。

此后，轻轻摇动培养板并吸除用过的 DPBS。向每孔加入 4 mL 预热至 37 °C 的第三阶段培养基。小心将培养板转移至 37 °C、含 5% CO₂ 及湿润 atmosphere 的培养箱中，培养三天。

本研究中，扩增的hIPSEs相互聚集并形成均一的单层细胞，适用于诱导分化。未分化的hIPSEs被解离后以单细胞形式重铺于培养板上，细胞密度较低。一小时内，细胞即贴附于培养板表面，并开始出现突起。

第一天，细胞增殖良好并均匀分布，覆盖培养表面面积的80%至90%。在第三天和第四天，细胞形成一层均一的单层细胞片，呈现鹅卵石样外观。此时，大多数细胞停止表达未分化细胞标志物SOX2，转而表达定型内胚层标志物SOX17，阳性率超过90%。大多数SOX17阳性细胞同时表达FOXA2。

随后，细胞开始表达原始内胚层标志物 HNF1-beta 和 HNF4-alpha，最终表达后部前肠胰腺前体标志物 PDX1，阳性率超过 90%。PDX1 阳性细胞的诱导在另一株 hIPSC 系 1231A3 以及一株 hESC 系 KhES-3 中均可重复。各阶段标志物 mRNA 表达的 qRT-PCR 结果与免疫染色结果一致，PDX1 的 mRNA 表达在第三阶段已明显出现，并在后续显著增加。由于未分化的 ES/iPS 细胞以克隆集落形式生长，单个细胞在局部处于不同的状态。

本方案提供了一种均匀刺激细胞以实现选定分化的途径。