Name: 高效生成粘附培养中 Hpsc 的胰腺-二叶多布蛋白 1+后后福格内胰腺祖细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学习利用单层贴壁培养技术将人多能干细胞高效分化为PDX1+胰腺祖细胞的方法。该方案通过均匀分散细胞实现同质性群体，适用于胰腺发育与再生医学研究。

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本工作部分得到了日本促进科学协会（JSPS）科研费（C）项目（JSPS KAKENHI 项目编号15K09385 和 18K08510）对 T.T. 的资助，以及 JSPS 研究员奖励金（JSPS KAKENHI 项目编号17J07622）对 A.K. 的资助，同时得到了日本医疗研究开发机构（AMED）研究资助项目“iPS细胞研究核心中心、再生医学实现研究网络中心”的支持，授予 K.O.。作者感谢 Peter Karagiannis 博士对稿件的审阅。

使用hPSCs的实验已获得京都大学医学部及医学院研究生院伦理委员会的批准。
1. 材料准备
注意：所有细胞培养用培养基和试剂均需在无菌环境中配制。使用前将基础培养基恢复至室温（RT）。分化用培养基在室温下需于6小时内使用。试剂的详细信息见材料表。
<ol>
	<li>分化（图1A）
	<ol>
		<li>第1A阶段培养基：使用移液器将RPMI 1640培养基转移至离心管中。依次加入无血清添加剂、activin A、CHIR99021和Y-27632，使其终浓度分别为1x、100 ng/mL、3 μM和10 μM。</li>
		<li>第1B阶段培养基：使用移液器将RPMI 1640培养基转移至离心管中。依次加入无血清添加剂、activin A和CHIR99021，使其终浓度分别为1x、100 ng/mL和≤1 μM。 
		注意：CHIR99021的浓度应低于第1A阶段培养基中的浓度；该成分的添加并非必需，但可增加细胞数量。</li>
		<li>第2阶段培养基：使用移液器将改良型MEM（iMEM）培养基转移至离心管中。加入无血清添加剂和角化细胞生长因子（KGF），使其终浓度分别为0.5x和50 ng/mL。</li>
		<li>第3阶段培养基：使用移液器将iMEM培养基转移至离心管中。依次加入无血清添加剂、KGF、NOGGIN、3-Keto-N-aminoethyl-N’-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine（CYC）和4-[(E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]-苯甲酸（TTNPB），使其终浓度分别为0.5x、50 ng/mL、100 ng/mL、0.5 μM和10 nM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术（FCM）
	<ol>
		<li>1x 穿透/洗涤缓冲液：使用移液器将水转移至离心管中，再加入穿透/洗涤缓冲液，使其终浓度为1x。</li>
		<li>FCM封闭液：使用移液器将1x 穿透/洗涤缓冲液转移至离心管中，再加入驴血清，使其终浓度为2%（体积比）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色
	<ol>
		<li>封闭液：使用移液器将杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）转移至离心管中，再加入驴血清和Triton X，使其终浓度分别为5%（体积比）和0.4%（体积比）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人类多能干细胞向后部前肠细胞/胰腺前体细胞（PDX1+ 细胞）的分化
注意：所有操作均需使用无菌技术进行。根据制造商说明书17,26，将人多能干细胞（hPSCs）培养于涂有hPSC专用合成基质材料的6孔板中，并使用hPSC维持培养基进行培养。当细胞融合度达到50–80%（第0阶段）时，可用于诱导分化。
<ol>
	<li>准备基底膜基质包被的培养板。
	<ol>
		<li>将 6 mL RPMI 1640 培养基（4 °C）转移至预冷至 4 °C 的离心管中。使用预冷的 1 mL 移液枪头加入 2 mg 基底膜基质（4 °C），并通过轻柔吹打充分混匀，制备成浓度为 0.33 mg/mL 的基底膜基质溶液。</li>
		<li>用移液器将 2 mL 稀释后的基底膜基质溶液加入 6 孔细胞培养板的每个孔中。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 60–90 分钟。之后在室温下保存，于 3 小时内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种 hPSCs 并启动向定型内胚层的分化（第 1A 阶段）。
	<ol>
		<li>吸除旧培养基，用移液器向 6 孔板中每孔加入 2 mL 0.5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）（室温）以洗涤培养的 hPSCs。</li>
		<li>吸除 0.5 mM EDTA，再用移液器向每孔加入 2 mL 0.5 mM EDTA。将培养板置于 37 °C 孵育 5 分钟。</li>
		<li>吸除 0.5 mM EDTA，用移液器向每孔加入 1 mL 室温的 hPSC 维持培养基&#160;并补充 10 μM Y-27632。&#160;轻柔但迅速地吹打，使贴壁细胞脱落，并将细胞团块解离为单细胞。吹打过程中避免产生气泡。</li>
		<li>将细胞悬液转移至含有 4 mL 室温 hPSC 维持培养基（补充 10 μM Y-27632）的 50 mL 离心管中。轻柔吹打混匀细胞悬液。&#160;</li>
		<li>使用台盼蓝染色排除法计数细胞悬液中的细胞数量。
		<ol>
			<li>在离心管中混合 15 μL 细胞悬液与 15 μL 台盼蓝溶液。</li>
			<li>用 10 μL 移液器将台盼蓝稀释后的细胞悬液各取 10 μL，重复加入细胞计数板中。</li>
			<li>使用自动细胞计数仪计数细胞数量，并计算细胞悬液中的细胞密度。细胞活力通常&#62;98%。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将细胞悬液分装至 50 mL 离心管中，每孔 6 孔板接种 1–1.5 × 106 个细胞（即 1–1.5 × 105 个细胞/cm2）。</li>
		<li>在室温下以 200 ×g 离心 5 分钟。</li>
		<li>用移液器吸除上清液，每孔用 1 mL 第 1A 阶段培养基（室温）重悬细胞。轻柔吹打细胞悬液，再加入 1 mL 第 1A 阶段培养基（每孔总量为 2 mL）。</li>
		<li>用 1,000 μL 移液器吸除步骤 2.1.2 中制备的细胞培养板各孔中的稀释基底膜基质。立即进行下一步操作。</li>
		<li>再次轻柔吹打步骤 2.2.8 中的细胞悬液。混合后立即向 6 孔板的每孔中加入 2 mL 细胞悬液。用铝箔覆盖培养板以避光。将培养板置于室温的超净台中静置 10–15 分钟。 
		注意：接种后请勿移动培养板。</li>
		<li>轻柔地将培养板放入 37 °C、5% CO2 的培养箱（湿润环境）中，培养 24 小时。 
		注意：接种后请勿震荡培养板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导向定型内胚层分化（第 1B 阶段）。
	<ol>
		<li>吸除旧培养基，用移液器向各孔加入 2 mL DPBS。重复吸除和加入 DPBS 一次。 
		注意：为去除单层中的死细胞，每次吸除前请轻柔震荡培养板。</li>
		<li>用移液器吸除用过的 DPBS，每孔加入 4 mL 第 1B 阶段培养基（37 °C）。轻柔地将培养板放入 37 °C 培养箱（5% CO2 湿润环境）中，培养 48 小时。</li>
		<li>吸除旧培养基，用移液器向孔中加入 2 mL DPBS。重复吸除和加入 DPBS 一次。 
		注意：每次吸除前通过轻柔震荡去除单层中的死细胞。</li>
		<li>用移液器吸除用过的 DPBS，每孔加入 4 mL 第 1B 阶段培养基（37 °C）。轻柔地将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2 湿润环境）中，培养 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导向原始肠管分化（第 2 阶段）。
	<ol>
		<li>吸除旧培养基，用移液器向孔中加入 2 mL DPBS。 
		注意：每次吸除前通过轻柔震荡去除单层中的死细胞。</li>
		<li>用移液器吸除用过的 DPBS，每孔加入 4 mL 第 2 阶段培养基（37 °C）。将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2 湿润环境）中，培养 4 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导向 PDX1+ 细胞分化（第 3 阶段）。
	<ol>
		<li>吸除旧培养基，用移液器向孔中加入 2 mL DPBS。重复吸除和加入 DPBS 一次。</li>
		<li>用移液器吸除用过的 DPBS，每孔加入 4 mL 第 3 阶段培养基（37 °C）。将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2 湿润环境）中，培养 3 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导向胰腺内分泌细胞分化。
	<ol>
		<li>按照先前描述的方案3,16,26，进行 NKX6.1+ 细胞诱导（第 4 阶段，持续 8 天），随后进行内分泌细胞诱导（第 5 阶段，持续 12 天）。通过免疫染色和定量实时反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析对内分泌细胞分化进行表征和验证。 
		注意：详细实验步骤请参考 Toyoda 等人16 和 Kimura 等人26 的研究。qRT-PCR 分析所用引物序列见表 1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 流式细胞术（FCM）
<ol>
	<li>吸弃旧培养基，用移液器向孔中加入 2 mL 0.5 mM EDTA。重复吸弃并加入 0.5 mM EDTA 一次。 
	注意： 每次吸取前，轻轻振荡培养板，以去除单层细胞中的死细胞。</li>
	<li>为了消化细胞（约 3-6 × 106 每孔加入含0.5 mM EDTA的0.25%胰蛋白酶2 mL。将培养板于37℃孵育 °C，5-10 分钟。</li>
	<li>轻柔而迅速地吹打，将成团的细胞分散为单细胞。吹打过程中避免产生气泡。</li>
	<li>每孔加入8–10 mL含0.5倍血清替代添加剂和10 μM Y-27632的基础培养基（RPMI 1640或iMEM，室温），混匀细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管中。</li>
	<li>将离心管在300 x g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，用 2 mL 0.5 mM EDTA（室温）重悬细胞。轻柔吹打细胞悬液。</li>
	<li>将离心管在300 x g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，每10⁶个细胞加入100 μL固定和透化缓冲液重悬细胞6 在通风橱中操作细胞。在通风橱中轻轻吹打细胞悬液。将离心管置于室温下30分钟。</li>
	<li>将试管在400 x g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>在通风橱中吸去上清液，并用每 10⁶ 个细胞 500 μL 的 FCM 封闭液重悬细胞6 细胞。轻轻吹打细胞悬液，将离心管置于室温静置30分钟。</li>
	<li>将50 μL细胞悬液转移至一个离心管中（约1 x 105 细胞）。将离心管在400 x g 室温孵育5分钟。弃上清液，加入100 μL稀释的一抗溶液重悬细胞（参见 材料表) 在 FCM 封闭溶液中于 4 ℃ 孵育 °C 为 &#62;16 小时。</li>
	<li>将试管在 400 x g 室温孵育5分钟。弃上清，加入180 μL 1×破膜/洗涤缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>将离心管在400 x g 室温孵育5分钟。弃上清液，加入100 μL稀释的二抗重悬细胞（参见 材料表) 在 FCM 封闭液中。将细胞在室温下孵育 60 分钟，或在 4 °C 为 &#62;避光孵育16小时。</li>
	<li>将试管在 400 x g 室温孵育5分钟。弃上清，加入180 μL 1×破膜/洗涤缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>将试管在400 x g条件下离心 g 室温孵育5分钟。弃去上清液，用180 μL含2%驴血清的DPBS重悬细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至带有细胞筛网（35 µm 尼龙滤网）的5 mL圆底聚苯乙烯管中过滤，并于4℃保存 °避光保护，直至分析。</li>
	<li>通过流式细胞仪分析阳性染色细胞的比例27.</li>
</ol>
4. 免疫染色
<ol>
	<li>用移液器吸除旧培养基，向孔中加入 2 mL DPBS。重复吸除和加入 DPBS 一次。 
	注意：每次吸除前，轻轻摇动培养板，以去除单层细胞中的死细胞。</li>
	<li>在通风橱内用移液器向每孔加入 2 mL 4% 多聚甲醛（PFA）（4 °C）。将培养板置于 4 °C 环境中固定 20 分钟。</li>
	<li>在通风橱内用移液器吸除 PFA 溶液。在通风橱内用移液器向每孔加入 2 mL 室温 DPBS。重复吸除和加入 DPBS 一次。</li>
	<li>向每孔加入 2 mL 封闭液，将培养板置于室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>吸除使用过的溶液，向每孔加入 1 mL 一抗（见材料表）溶于封闭液中。室温孵育 60 分钟，或 4 °C 孵育 &#62;16 小时。</li>
	<li>吸除使用过的溶液，向每孔加入含 0.4% Triton X-100 的 2 mL DPBS，室温孵育 10 分钟。重复吸除、加液和孵育步骤一次。</li>
	<li>吸除使用过的溶液，向每孔加入 1 mL 二抗（见材料表）溶于封闭液中。室温避光孵育 60 分钟。&#160;</li>
	<li>吸除使用过的溶液，向每孔加入含 0.4% Triton X-100 的 2 mL DPBS（室温），室温避光孵育 5 分钟。重复吸除、加液和孵育步骤两次。</li>
	<li>在荧光显微镜下拍摄显微图像，以评估分化效率28。</li>
</ol>

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<li>Suemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+establishment+of+human+embryonic+stem+cell+lines+and+long-term+maintenance+with+stable+karyotype+by+enzymatic+bulk+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).</li>
<li>Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+cell+seeding+density+influences+pancreatic+endocrine+development+during+in+vitro+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 8 (12), e82076(2013).</li>
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<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).</li>
<li>Hohwieler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+acinar%2Fductal+organoids+generate+human+pancreas+upon+orthotopic+transplantation+and+allow+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling.</a> Gut. 66 (3), 473-486 (2017).</li>
<li>Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endodermal+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+insulin-producing+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture.</a> Scientific Reports. 4, 4488(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

PDX1+ 细胞的生成包含多个步骤，因此在适当的时间点对细胞进行处理至关重要。其中，定型内胚层的诱导效率在很大程度上影响最终的诱导效率，这可能是由于其他污染谱系细胞（如中胚层和外胚层）的干扰，这些细胞可能增殖和/或分泌干扰特定分化的因子。如果在第4天（第1B阶段）SOX17+ 细胞的比例低于80%，则向 PDX1+ 细胞的有效诱导很可能受到影响。&#160;
人多能干细胞（hPSCs）的未分化状态通常以紧密排列的细胞集落或聚集体形式维持。然而，从集落或聚集体起始的分化方法可能因集落内部和边缘区域的细胞黏附程度和密度不同22，以及细胞所处细胞周期阶段不同25，而导致分化结果存在异质性。相比之下，本方法起始于解离的单细胞，使得每个单细胞的黏附状态或细胞密度相对均一。在实现单细胞水平均一化操作方面，本方法可能比从集落或聚集体培养起始的其他方法更具优势。&#160;
尽管本方...

胰腺主要由外分泌细胞和内分泌细胞组成，其功能障碍或负荷过重可导致多种疾病，如胰腺炎、糖尿病和胰腺癌。为了阐明胰腺疾病的发病机制，有必要分析胰腺细胞的发育过程及其功能。此外，建立细胞/组织补充疗法还需要稳定且高质量的细胞来源。由人多能干细胞（hPSC）衍生而来的胰腺细胞是实现上述目标的有前景的细胞来源，针对胰腺细胞分化的诱导方案已得到深入研究1,2,3,4。近年来，体外生成胰腺β细胞的技术取得进展，所获得的β细胞在发育过程上模拟了成人人体内β细胞的形成，并在移植至糖尿病模型小鼠后表现出治疗效果2,3。此外，通过对健康供体和1型糖尿病患者来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）所生成的β细胞进行分析，发现二者在包括应激状态下的功能方面并无显著差异5。而且，利用患者来源的iPSCs或携带与患者相同位点基因突变的hPSCs所诱导生成的胰腺细胞，已部分重现了相关疾病的表型特征6,7。&#160;
为了从人多能干细胞（hPSCs）生成胰腺细胞，需采用逐步定向分化的方法，以模拟胚胎发育过程。胰腺起源于早期胚胎的内胚层，该层表达Y染色体性别决定区蛋白17（SOX17）和叉头框蛋白A2（FOXA2）8。根据小鼠研究，内胚层形成原始肠管，其标志为肝细胞核因子1-β（Hnf1β）和肝细胞核因子4-α（Hnf4α）的表达。原始肠管伸长后发育为呼吸系统、消化道及附属器官。在伸长之后，前肠后部区域成为预定的胰腺区域，其标志为转录因子胰腺/十二指肠同源框蛋白1（PDX1）的表达8,9,10。PDX1+肠管的背侧和腹侧部分增厚，形成胰腺芽，其标志为胰腺转录因子1α亚基（PTF1A）与NK6同源框1（NKX6.1）的共表达8,11。这一表达标志着胰腺器官发生的形态学起点。胰腺内胚层细胞作为胰腺芽的组成部分，形成分支状的上皮管状网络结构12，并最终分化为外分泌细胞和内分泌细胞，包括分泌胰岛素的β细胞和分泌胰高血糖素的α细胞。PDX1的表达最初出现在预定的胰腺区域，随后在整个胰腺发育过程中持续存在，并定位于β细胞和δ细胞9,13,14。尽管在小鼠发育的中晚期，不表达Ptf1a或Nkx6.1的Pdx1+细胞区域会分化为胃窦、十二指肠、肝外胆管以及部分肠细胞9，但在人类早期发育阶段，PDX1+细胞被认为是胰腺的前体细胞。&#160;
本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSCs）分化为PDX1+细胞以生成胰腺谱系的详细方案。该方案通过接种解离后的单细胞启动分化过程15,16,17。通常情况下，未分化的hPSCs以集落或细胞团的形式在悬浮状态或贴壁条件下维持培养。因此，大多数方案在传代后不久即启动分化。然而，在集落或细胞团状态下，细胞容易出现空间和转录水平的异质性18,19,20,21,22，这可能阻碍向定型内胚层的首次分化，进而导致向PDX1+细胞的分化效率低下。本方案可能更易于操作，有助于提高并稳定某些此前被发现向内胚层谱系及PDX1+细胞分化效率较低的hPSC细胞系的分化效率23,24,25。

<table><tbody><tr><td>3-酮基-N-氨乙基-N&amp;prime;-氨基己酰基二氢肉桂酰基环杷明</td><td>多伦多研究化学品公司</td><td>K171000</td><td>CYC</td></tr><tr><td>4-[(E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]-苯甲酸</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-203303</td><td>TTNPB</td></tr><tr><td>50 mL 锥形无菌聚丙烯离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>抗 CDX2 抗体 [EPR2764Y]</td><td>Abcam</td><td>Ab76541</td><td>抗-CDX2， &amp;times; 1/1000 稀释</td></tr><tr><td>B-27 添加剂（50 &amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>无血清添加剂</td></tr><tr><td>BD FACSAria II 细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>用于流式细胞术</td></tr><tr><td>生物医学冰箱</td><td>SANYO</td><td>MDF-U538</td><td>对于 -30 &amp;deg;C 储存</td></tr><tr><td>用于TC10/TC20细胞计数仪的双通道细胞计数板</td><td>BIO-RAD</td><td>1450011</td><td>计数载玻片</td></tr><tr><td>细胞培养多孔板，6孔，聚苯乙烯，透明</td><td>Greiner bio-one</td><td>657165</td><td>用于分化培养/6孔板</td></tr><tr><td>离心</td><td>TOMY</td><td>AX-310</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>离心</td><td>TOMY</td><td>MX-305</td><td>用于 RT-qPCR</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>洁净台</td><td>SHOWA KAGAKU&amp;nbsp;</td><td>S-1601PRV</td><td>洁净台</td></tr><tr><td>Corning CellBIND 6 孔板</td><td>康宁</td><td>3335</td><td>无饲养层培养 hPSCs/6 孔板</td></tr><tr><td>康宁 Matrigel 基底膜基质 生长因子减量</td><td>康宁</td><td>354230</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>Corning Synthemax II-SC 基质</td><td>康宁</td><td>3535</td><td>无饲养层培养人多能干细胞/人多能干细胞用合成表面材料</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>Leica CM1510 S</td><td>用于细胞聚集体的免疫染色。</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 试剂盒</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td>Perm/Wash 缓冲液为&amp;nbsp; 通透/洗涤缓冲液。Cytofix/Cytoperm缓冲液为固定和通透缓冲液。</td></tr><tr><td>Dako笔</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>对于聚集体的免疫染色</td></tr><tr><td>dNTP 混合液（10 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>18427-088</td><td>用于RT-qPCR</td></tr><tr><td>驴抗山羊IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11055</td><td>二抗， &amp;times; 1/500 稀释度</td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A10036</td><td>二抗， &amp;times; 1/500 稀释度</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td>二抗， &amp;times; 1/500 稀释</td></tr><tr><td>驴血清</td><td>默克密理博</td><td>S30</td><td>驴血清</td></tr><tr><td>不含 Ca 或 Mg 的 D-PBS(-)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-95</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Essential 8 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>无饲养层培养 hPSCs/hPSC 维持培养基</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤网 snap 盖</td><td>康宁</td><td>352235</td><td>5 mL 圆底聚苯乙烯管，带细胞筛</td></tr><tr><td>滤尖，1,000 &amp;micro;L</td><td>Watoson</td><td>124-1000S</td><td>与移液器配合使用</td></tr><tr><td>20 微升滤芯吸头 &amp;micro;L</td><td>Watoson</td><td>124-P20S</td><td>与移液器配合使用</td></tr><tr><td>200 微升滤芯吸头 &amp;micro;L</td><td>Watoson</td><td>124-P200S</td><td>与移液器配合使用</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370A</td><td>培养箱</td></tr><tr><td>HNF-1&amp;beta; 抗体（C-20）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7411</td><td>抗HNF1&amp;beta;, &amp;times; 1/200 稀释度</td></tr><tr><td>HNF-4&amp;alpha; 抗体（H-171）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8987</td><td>抗HNF4&amp;alpha;, &amp;times; 1/200 稀释度</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>用于细胞核染色， &amp;times; 1/200 稀释度</td></tr><tr><td>人胰腺总RNA</td><td>Ambion</td><td>AM7954</td><td>用于 RT-qPCR</td></tr><tr><td>人PDX-1/IPF1抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2419</td><td>抗PDX1，山羊IgG， &amp;times; 1/200 稀释度</td></tr><tr><td>人类 SOX17 抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1924</td><td>抗SOX17， &amp;times; 1/200 稀释度</td></tr><tr><td>改良的MEM锌选项培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10373-017</td><td>iMEM</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Cosmo Bio</td><td>10DO</td><td>用于类器官的免疫染色</td></tr><tr><td>乳胶检查手套</td><td>Adachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS包被的载玻片</td><td>Matsunami Glass</td><td>83-1881</td><td>用于细胞聚集体的免疫染色</td></tr><tr><td>MicroAmp 快速 96 孔反应板</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td>用于 RT-qPCR</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX41N-31PHP</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Watoson</td><td>131-515CS</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗-&amp;alpha;甲胎蛋白</td><td>SIGMA</td><td>A8452</td><td>抗AFP， &amp;times; 1/200 稀释度</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>用于RT-qPCR</td></tr><tr><td>寡核苷酸dT</td><td>FASMAC</td><td>定制寡核苷酸&amp;nbsp;</td><td>用于RT-qPCR的序列是 &quot;TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&quot;</td></tr><tr><td>多聚甲醛，粉末</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26126-54</td><td>PFA，固定剂，用DPBS稀释</td></tr><tr><td>药品冷藏箱</td><td>SANYO</td><td>MPR-514</td><td>4 对于 &amp;deg;C 储存</td></tr><tr><td>PIPETMAN P&amp;nbsp;</td><td>GILSON</td><td></td><td>移液器</td></tr><tr><td>重组人KGF/FGF-7</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>251-KG</td><td>KGF</td></tr><tr><td>重组人Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td>NOGGIN</td></tr><tr><td>重组人/小鼠/大鼠 Activin A</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>338-AC</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>ReverTra Ace（100 U/&amp;mu;L)</td><td>TOYOBO</td><td>TRT-101</td><td>用于RT-qPCR</td></tr><tr><td>无RNase的DNase试剂盒（50）</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>用于RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>用于RT-qPCR</td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30264-85</td><td>RPMI 1640</td></tr><tr><td>实时密封膜</td><td>Takara</td><td>NJ500</td><td>用于 RT-qPCR</td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Costar/Corning</td><td>4488</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>25 mL 移液管</td><td>Costar/Corning</td><td>4489</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>Costar/Corning</td><td>4487</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>Sox2 (D6D9) XP 兔单克隆抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>3579S</td><td>抗SOX2， &amp;times; 1/200 稀释</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于RT-qPCR</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30406-25</td><td>用于类器官的免疫染色</td></tr><tr><td>TB Green&lt;br/&gt; Premix Ex Taq II&amp;nbsp;</td><td>Takara</td><td>RR820B</td><td>用于 RT-qPCR</td></tr><tr><td>TC20全自动细胞计数仪</td><td>BIO-RAD</td><td>1450101J1</td><td>自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT 化合物 4583&amp;nbsp;</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>对于类胚体的免疫染色</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold 模具/适配器</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td>用于细胞聚集体的免疫染色</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>BIO-RAD</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>SANYO</td><td>MDF-U33V</td><td>对于 -80 &amp;deg;C 储存</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15575-038</td><td>用 DPBS 稀释，配制 0.5 mM EDTA</td></tr><tr><td>Veriti 温控循环仪</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于 RT-qPCR</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>和光</td><td>251-00514</td><td></td></tr></tbody></table>

高效生成人多能干细胞在贴壁培养中分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+ 后前肠/胰腺前体细胞

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

由人多能干细胞（hPSC）衍生的胰腺细胞是再生医学领域一种极具前景的细胞来源，也可作为研究人类发育过程的平台。逐步定向分化是生成胰腺细胞（包括胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）胰腺前体细胞）的主要方法之一，该方法可模拟体内发育过程。传统方案通常在传代后不久，利用小克隆开始诱导分化。然而，在克隆或细胞聚集体状态下，细胞容易出现异质性，这可能阻碍向PDX1+细胞的分化。本文介绍了一种将hPSC分化为PDX1+细胞的详细实验方案。该方案包含四个步骤，起始于解离后的单细胞接种。首先诱导生成SOX17+定型内胚层细胞，随后表达两种原始肠管标志物HNF1β和HNF4α，最终分化为PDX1+细胞。本方案操作简便，可能提高并稳定某些此前被发现难以有效分化为内胚层谱系或PDX1+细胞的hPSC细胞系的分化效率。

hiPSCs（585A129,30）在扩增过程中会凝聚并形成均一的单层细胞（图1B），适合用于分化。未分化的hiPSCs（第0阶段）被解离后以单细胞形式在低细胞密度（1–1.5 × 105 个细胞/cm2）下重新接种。接种后1小时内，细胞即贴附于培养板并开始出现突起。第1天时，细胞增殖良好且分布均匀，覆盖培养表面面积的80–90%。在第1B阶段，由于存在死亡细胞，培养基呈现浑浊状态。清除死亡细胞对于实现高效分化至关重要，因为死亡细胞可能干扰其下方存活细胞的生存与分化。第3–4天，细胞形成具有“鹅卵石样”外观的均一单层细胞片。此时，大多数细胞停止表达未分化细胞标志物——性别决定区Y框蛋白2（SOX2），转而表达定型内胚层标志物SOX17，阳性率超过90%（图2A 和B）。大多数SOX17+细胞同时表达FOX...

本文介绍了一种详细的实验方案，通过解离的单细胞非克隆型单层培养方法，将人多能干细胞（hPSCs）分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）细胞，以生成胰腺谱系细胞。该方法适用于制备均一的hPSC来源细胞，并可用于基因操作与筛选。

人多能干细胞（hPSC）来源的胰腺细胞是再生医学研究中有前景的细胞来源，也是研究人类发育与疾病机制的重要平台……

该技术的主要优势在于，刺激前细胞被均匀分散，并在细胞黏附过程中同时受到均匀刺激。为我们演示该实验步骤的是本实验室的研究生Azuma Kimura。开始此操作时，将六毫升RPMI 1640培养基转移至置于冰上、已预冷至4°C的离心管中。使用预冷的1毫升移液枪头，加入2毫克基底膜基质。通过轻柔吹打充分混匀，制成浓度为0.33毫克/毫升的基底膜基质溶液。接着，用移液器将2毫升稀释后的基底膜基质溶液转移至6孔细胞培养板的每个孔中。将培养板在37摄氏度下孵育60至90分钟。之后，将培养板置于室温下，最多可保存3小时，直至准备使用。首先，吸除用过的培养基，然后使用移液器向六孔板中每个孔加入2毫升0.5毫摩尔的EDTA，以洗涤培养的hPCSs。然后，吸出各孔中的EDTA，并向每孔加入2毫升新鲜的0.5毫摩尔EDTA。将培养板在37°C孵育5分钟。随后，吸出每孔中的EDTA。向每个孔中加入1毫升室温的hPSC维持培养基，培养基中添加10微摩尔Y27632。用移液器轻柔但迅速地吹打，使贴壁细胞脱落，并将聚集成团的细胞解离为单细胞。将细胞悬液转移至含有4毫升hPSC维持培养基（每孔培养基中均添加10微摩尔Y27632）的50毫升离心管中，通过移液吹打混匀。接下来，将15微升细胞悬液与15微升台盼蓝在离心管中混合。使用10微升移液器，将10微升稀释后的细胞悬液重复加入细胞计数板中。利用自动细胞计数仪对细胞数量进行计数，并计算细胞悬液中的细胞密度。将细胞悬液按每孔100万至150万个细胞的密度分装至50毫升离心管中。在室温下以200 × g离心5分钟。随后，用移液器吸除上清液，并按每孔加入1毫升阶段1A培养基重悬细胞。轻轻吹打细胞悬液，然后每孔加入一毫升阶段1A培养基。使用1000微升移液器，从先前准备好的细胞培养板的孔中吸取稀释后的基底膜基质。立即轻轻吹打管中的悬液，并将两毫升转移至六孔板的每个孔中。用铝箔覆盖培养板以避光，并将培养板置于室温下的洁净台面上静置10至15分钟。之后，小心地将培养板转移至37摄氏度、含5%二氧化碳及湿润环境的培养箱中孵育24小时。首先轻轻振荡培养板，然后使用移液器吸取弃去旧培养基。然后，向每个孔中加入 2 毫升 DPBS。轻轻再次振荡培养板，并吸除用过的 DPBS。向每个孔中加入 4 毫升预热至 37 摄氏度的 1B 阶段培养基。将培养板小心转移至37摄氏度、含5%二氧化碳及湿润环境的培养箱中，培养48小时。此后，轻轻振荡培养板并吸除用过的培养基。向每孔加入2毫升DPBS。用 DPBS 再重复一次吸液和添加操作。轻轻摇晃培养板，吸去用过的 DPBS。向每个孔中加入 4 毫升预热至 37 摄氏度的 1B 阶段培养基。将培养板小心转移至37摄氏度、含5%二氧化碳及湿润环境的培养箱中，培养24小时。首先，轻轻摇动培养板并吸除用过的培养基。向六孔板的每孔中加入2毫升DPBS。然后，轻轻晃动培养板并吸去用过的 DPBS。向每个孔中加入 4 毫升预热至 37 摄氏度的第二阶段培养基。小心将培养板转移至含 5% 二氧化碳及湿润环境的 37 摄氏度培养箱中，培养四天。轻轻摇动培养板并吸去用过的培养基。每孔加入 2 mL DPBS。重复吸去和加入 DPBS 的操作一次。此后，轻轻摇动培养板并吸除用过的 DPBS。向每孔加入 4 mL 预热至 37 °C 的第三阶段培养基。小心将培养板转移至 37 °C、含 5% CO₂ 及湿润 atmosphere 的培养箱中，培养三天。本研究中，扩增的hIPSEs相互聚集并形成均一的单层细胞，适用于诱导分化。未分化的hIPSEs被解离后以单细胞形式重铺于培养板上，细胞密度较低。一小时内，细胞即贴附于培养板表面，并开始出现突起。第一天，细胞增殖良好并均匀分布，覆盖培养表面面积的80%至90%。在第三天和第四天，细胞形成一层均一的单层细胞片，呈现鹅卵石样外观。此时，大多数细胞停止表达未分化细胞标志物SOX2，转而表达定型内胚层标志物SOX17，阳性率超过90%。大多数SOX17阳性细胞同时表达FOXA2。随后，细胞开始表达原始内胚层标志物 HNF1-beta 和 HNF4-alpha，最终表达后部前肠胰腺前体标志物 PDX1，阳性率超过 90%。PDX1 阳性细胞的诱导在另一株 hIPSC 系 1231A3 以及一株 hESC 系 KhES-3 中均可重复。各阶段标志物 mRNA 表达的 qRT-PCR 结果与免疫染色结果一致，PDX1 的 mRNA 表达在第三阶段已明显出现，并在后续显著增加。由于未分化的 ES/iPS 细胞以克隆集落形式生长，单个细胞在局部处于不同的状态。本方案提供了一种均匀刺激细胞以实现选定分化的途径。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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