高效生成粘附培养中 Hpsc 的胰腺-二叶多布蛋白 1⁺后后福格内胰腺祖细胞

在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以区分人类多能干细胞 (Hpsc) 到胰十二指肠蛋白 1⁺ (pdx1⁺) 细胞的产生的非群体类型单层生长的基础上, 胰腺谱系离解的单细胞。该方法适用于同源 hPSC-derived 衍生细胞的产生、遗传操作和筛选。

这种技术的主要优点是，在刺激之前，细胞均匀地分散，然后在串联细胞粘附中均匀地刺激。演示这个程序的将是来自我们实验室的研究生AzumaKimura。要开始此过程，将六毫升 RPMI 1640 转移到冰面上冷却到摄氏四度的管中。

使用冷却的一毫升移液器尖端，添加两毫克的地下室膜基质。通过温和移液混合，使其成为浓度为每毫升0.33毫克的基底膜基质。接下来，使用移液器将稀释的地下膜基质的两毫升转移到六孔细胞培养板的每个孔中。

在37摄氏度下孵育板60至90分钟。在此之后，将板在室温下保持长达三个小时，直到准备好使用。首先，吸气使用介质，并使用移液器将两毫升 0.5 毫摩尔 EDTA 添加到每井中，以清洗六井板中培养的 hPCS。

然后，从井中吸出EDTA，并在每口井中加入两毫升新鲜0.5毫摩尔EDTA。在37摄氏度下孵育板5分钟。在此之后，从每个井中吸出 EDTA。

在室温下加入一毫升的hPSC维护介质，每井补充10微摩尔Y27632。移液器轻轻地，但快速吹掉板上附加的细胞，并分离任何团状细胞到单个细胞。将细胞悬浮液转移到含有4毫升hPSC维护介质的50毫升离心管中，每井补充10微摩尔Y27632，并通过移液混合。

接下来，在管中混合15微升细胞悬浮液和15微升的试盘蓝色。使用 10 微升移液器将稀释的细胞悬浮液的 10 微升转移到重复的细胞计数幻灯片中。使用自动单元格计数器，计算单元格数并计算单元格悬浮液中的细胞密度。

将悬浮液分配到50毫升管中，密度为1至50万个细胞，用于每一个井。在200倍G和室温下离心管5分钟。在此之后，使用移液器吸升液，并使用每井1A阶段介质的一毫升重新悬浮细胞。

轻轻移液细胞悬浮液，然后每井再加入一毫升的1A级介质。使用1000微升移液器，从先前准备的细胞培养板的孔中吸出稀释的基底膜基质。立即轻轻移液管中的悬浮液，将两毫升移入六井板的每个井中。

用铝箔盖住板，防止其光线，并在室温下将板放在干净的长凳上 10 到 15 分钟。之后，小心地将板转移到37摄氏度的孵化器中，用5%的二氧化碳和24小时的加湿气氛。首先，轻轻摇动板，并使用移液器吸气使用介质。

然后，向每井添加两毫升 DPBS。再次轻轻摇动板，吸气用过的 DPBS。在每个井中加入四毫升的1B级介质，预热至37摄氏度。

小心地将板在37摄氏度下用5%的二氧化碳和加湿大气转移到培养器上48小时。在此之后，轻轻摇动板并吸气用过的介质。在每个井中加入两毫升的 DPBS。

重复此愿望并再增加 DPBS 一次。轻轻摇动板并吸气用过的 DPBS。在每个井中加入四毫升的1B级介质，预热至37摄氏度。

小心地将盘子转移到孵化器，在37摄氏度下，用5%的二氧化碳和加湿的大气培养24小时。首先，轻轻摇动板，吸走用过的介质。在六井板的每个井中加入两毫升的 DPBS。

然后，轻轻摇动板，吸气用过的 DPBS。将二期介质的四毫升，预热至37摄氏度，到每井。小心地将盘子转移到37摄氏度的孵化器中，将5%的二氧化碳和加湿大气转移到培养器上四天。

轻轻摇动板，吸气用过的介质。在每个井中加入两毫升的 DPBS。重复此吸气和添加 DPPS 的过程。

在此之后，轻轻摇动板并吸气用过的 DPBS。在每个井中加入四毫升的三期介质，预热至37摄氏度。小心地将盘子转移到37摄氏度的孵化器中，将5%的二氧化碳和加湿的大气转移到培养三天。

本研究中，对繁殖的HIPSEs进行浓缩，形成一种适合分化的同质单层。未分化的hIPSEs在低细胞密度下分离并重新播种为单细胞。在一小时内，细胞连接到板，并开始显示突起。

第一天，细胞被扩散和分布良好，覆盖80%至90%的表面区域。第三天和第四天，细胞形成一个同质的单层表，可以描述为鹅卵石外观。此时，大多数细胞停止表达 SOX2，这是未分化细胞的标记，而是以超过 90% 的 SOX17 表示一个明确的内端标记，SOX17。

然后细胞开始表达原始的 goptupe 标记，HNF1-beta 和 HNF4-alpha，并最终在超过 90% 的后前前脑胰蛋白酶系标记，PDX1，PDX1 阳性细胞诱导可在另一条 hIPSE 线 1231A3 和 hESE 线 KhES-3 中重现。阶段标记的MRNA表达QRTPCR结果与免疫污染一致，PDX1的MRNA表达在第三阶段明显，之后会显著增加。由于未分化的ESIPS细胞作为菌落生长，单个细胞处于不同的状态。

该协议提供了一种方法，以均匀地刺激细胞为当选的分化。