Name: 球注射阿霉素对小鼠肾病综合征的诱导作用及缓释抑肽酶预防容积保留率的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 了解通过球后注射阿霉素在129S1/SvImJ小鼠中诱导肾病综合征的实验方法。本研究利用缓释抑肽酶颗粒抑制尿丝氨酸蛋白酶活性，从而预防钠潴留，为阐明肾病综合征发病机制提供重要模型。

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本研究得到了德国研究基金会（DFG, AR 1092/2-1）资助项目的资助。

所有方法均依照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》以及德国动物福利法进行，并已获得当地主管部门（蒂宾根行政区政府）的批准。
1. 通过向眶后窦注射阿霉素诱导实验性肾病综合征
<ol>
	<li>使用标记活塞的止动位置，准备一支带有固定30G套管针的0.5 mL注射器。</li>
	<li>根据早晨测得的小鼠体重，计算雄性小鼠（7.25 µL/g体重（bw），相当于14.5 µg/g bw阿霉素）和雌性小鼠（6.9 µL/g bw，相当于13.8 µg/g bw阿霉素）的注射体积。 
	注意：所给剂量适用于诱导肾病综合征。剂量的微小变化会导致肾病进程显著不同，从仅表现为肾小球滤过率轻微改变的轻度慢性肾病（12.6 µg/g bw阿霉素）到急性肾衰竭（15.4 µg/g bw阿霉素）7,15。</li>
	<li>将计算量的阿霉素溶液（2 µg/µL）置于37 °C温育箱中预热。 
	警示：阿霉素吞食有害，并可能致癌。操作阿霉素时务必佩戴手套，避免任何皮肤接触。</li>
	<li>用阿霉素溶液预填充注射器至标记位置，并将天平归零。将注射体积的溶液吸入注射器，并通过称重注射器来核对体积。</li>
	<li>使用蒸发器和2 L/min的氧气流，以5 vol%异氟烷深度麻醉小鼠。
	<ol>
		<li>注射前不要在眼睛上涂抹眼膏。操作者需要清晰观察眼眶，以确保进行安全且成功的眶后注射。</li>
		<li>通过足底反射评估麻醉深度，并在开始注射前根据需要调整麻醉剂量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠置于右侧卧位，背部朝向操作者身体，头部朝向操作者进行注射的手。 
	注意：本操作描述适用于右利手人员；左利手人员使用左手注射时，建议将体位和操作左右对调，更为方便。</li>
	<li>轻柔地对眼球背侧和腹侧的皮肤施加压力，使小鼠左眼球从眼眶中轻微突出。</li>
	<li>从内眼角（内眦）穿刺左侧眶后窦。避免与小鼠眼球发生任何接触。</li>
	<li>轻微倾斜注射器，一次性注入全部体积。确保注射过程无阻力，且无眼球突出或注射部位渗漏等外渗迹象。</li>
	<li>由于阿霉素为高毒性物质，应每天至少一次使用Morton和Griffiths et al.16的评分表评估小鼠健康状况，并特别关注注射部位。若注射后或随后几天内出现眼球突出、眼睑闭合障碍等外渗迹象，或肿胀、皮肤损伤等坏死征象，应立即实施安乐死。</li>
</ol>
2. 植入含抑肽酶的缓释颗粒
<ol>
	<li>提前订购所需每日剂量和释放持续时间的药丸。若使用抑肽酶，选择每日释放 1 mg、持续 10 天的剂量。 
	注意：本研究中使用的抑肽酶药丸含有 10 mg 剂量。
	<ol>
		<li>将药丸储存在干燥环境中，避免接触任何湿气。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备手术所需物品，包括一把修毛剪、一把皮肤准备剪、手术刀、外科镊子、两把组织镊子、持针器和 15 cm 单股不可吸收缝线。
	<ol>
		<li>使用热力灭菌器在 240 °C 下对器械灭菌 5 分钟。使用前等待 5 分钟，使器械冷却至室温。
		<ol>
			<li>避免灭菌后的器械尖端接触非无菌表面。</li>
			<li>防止热器械造成皮肤烫伤。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用异氟烷（5 vol%）诱导麻醉，随后以 1.5 vol% 维持麻醉，氧气流速为 2 L/min。</li>
	<li>将小鼠俯卧位放置在覆盖纱布的加热装置上，以避免热损伤。表面温度约为 37 °C。</li>
	<li>使用眼膏保护眼睛。</li>
	<li>使用剪刀或修毛器去除背部中央约 0.5 cm2 区域的毛发，并使用适用于皮肤消毒的消毒剂对无毛皮肤进行消毒。尽可能少去除毛发，以便小鼠术后更难触及伤口和缝线末端，同时有助于维持体温。</li>
	<li>使用手术刀沿头尾方向切开无毛皮肤，切口长约 5 mm。使用钝性分离法在皮下结缔组织中制备一个左侧横向囊袋，深度约 1 cm。
	<ol>
		<li>通过足底反射评估麻醉深度，必要时在开始手术前调整麻醉给药。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌组织镊子将一枚 10 天释放药丸插入制备好的左侧囊袋中。将药丸平放于囊袋底部。
	<ol>
		<li>在放入制备好的囊袋前，避免药丸接触任何液体或湿气。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 2–3 道缝线关闭皮肤切口。仅保留很短的线尾，以增加小鼠通过啃咬打开缝线的难度。</li>
	<li>将小鼠单独饲养，以减少术后应激并防止其啃咬导致缝线裂开。在麻醉恢复期间应持续观察小鼠，直至其意识充分恢复。 
	注意：由于该操作耐受性良好，无任何不适或疼痛表现，因此无需术后镇痛处理。&#160;或者，我们建议使用局部镇痛药物，例如在缝合前于切口处滴加一滴布比卡因，可提供长达 8 小时的镇痛效果。</li>
</ol>
3. 模型诱导、肾病综合征体征及健康状况的评估
<ol>
	<li>从注射当天开始，每天早晨（08:00）通过按摩膀胱将晨尿收集到反应杯（1.5 mL）中。
	<ol>
		<li>使用Bradford蛋白测定法检测蛋白尿，并以肌酐进行标准化。 
		注：为诱导肾病综合征，注射阿霉素后第7至第10天之间，蛋白尿应达到120 mg/mg肌酐的阈值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察腹水的形成情况。检查腹部周长是否增加或出现悬垂侧腹。</li>
	<li>每天早晨（08:00）称量小鼠、食物颗粒和饮水瓶的重量。</li>
	<li>每天至少使用Morton和Griffiths等人et al.16的评分表检查一次动物福利状况。</li>
</ol>
4. 采用显色法测定尿液中丝氨酸蛋白酶
<ol>
	<li>将15 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）加入含有25 mg冻干显色底物S-2251的瓶中，配制底物工作液，终浓度为2 mM。用PBS溶解抑肽酶，配制成浓度为2 mg/mL的抑肽酶溶液。
	<ol>
		<li>将配制好的溶液储存于-20 °C。这可显著减缓S-2251的自降解。避免使用颜色明显偏黄的陈旧溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用新鲜配制或解冻的底物工作液，并在37 °C恒温孵育箱中预热。</li>
	<li>将尿液样本在室温下解冻。
	<ol>
		<li>为防止蛋白酶降解，避免反复冻融。尿液样本应储存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适用于光度测定的96孔微孔板。在两个孔中各加入3 µL未稀释尿液，然后向孔中加入50 µL底物工作液以及3 µL PBS或抑肽酶溶液。用微孔板封板膜覆盖微孔板。</li>
	<li>将封好的微孔板置于37 °C恒温孵育箱中孵育60分钟。</li>
	<li>使用酶标仪在450 nm波长下测定每孔的光密度值。</li>
	<li>以未加抑肽酶与加抑肽酶条件下的吸光度差值表示尿液中抑肽酶敏感性丝氨酸蛋白酶活性。 
	注意：通过同时检测加与不加抑肽酶的配对样本，可提高检测特异性，因为该底物也可能被其他无病理生理作用的蛋白酶切割。</li>
</ol>

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<li>Schork, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Plasminuria+with+Overhydration+in+Patients+with+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究显示，通过129S1/SvImJ小鼠眶后窦注射阿霉素可诱导实验性肾病综合征，表现为蛋白尿、钠潴留、低白蛋白血症和高脂血症。然而，使用该模型时需考虑两个关键问题。首先，模型的诱导严格依赖于剂量，阿霉素剂量即使仅偏差0.3 µg/g，也会影响小鼠的反应15。当注射剂量较低（如14 µg/g体重或更低）时，阿霉素仅引起非肾病范围的蛋白尿，且不伴有明显的钠潴留、腹水和高脂血症。相反，注射较高剂量则会导致急性肾衰竭和高急性死亡率。根据剂量及小鼠的反应，阿霉素可引起类似于人类急性肾损伤（AKI）、肾小球滤过率保持的慢性肾脏病（CKD G1-3期），或进展性肾小球滤过率降低的慢性肾脏病（CKD G4-5期），最终导致尿毒症7,15。
其次，该模型仅适用于某些小鼠品系，而广泛使用的 C57Bl/6 品系具有抗性8。此外，在回交过程中可能存在的遗传污染会导致反应率显著降低。这在一定程...

肾病综合征的特征是大量蛋白尿、低白蛋白血症、水肿和高脂血症，可被视为蛋白尿性肾病最极端的表现形式。在啮齿类动物中，可通过单次注射蒽环类药物或嘌呤霉素诱导实验性肾病综合征，导致足细胞损伤，其病理表现类似于人类的微小病变性肾病和局灶节段性肾小球硬化（FSGS）1。自1955年Frenk et al.首次描述以来2，嘌呤霉素核苷肾病（PAN）在大鼠中已成为众多研究中探讨肾病综合征病理生理机制的标准模型3,4,5,6。在小鼠中，相应的模型可通过蒽环类药物阿霉素诱导建立7。然而，该模型存在显著的品系依赖性，其遗传基础至少由两个遗传位点决定8。此外，不同品系小鼠在蛋白尿反应及肾病综合征病程方面也存在差异9,10。使用129S1/SvImJ品系小鼠并通过眶后静脉窦快速静脉注射阿霉素，可产生足以引发肾病综合征典型特征的蛋白尿水平，尤其是表现为腹水和几乎无钠尿液的容量潴留7。实验性肾病综合征中的钠潴留被认为是由远端小管上皮钠通道（ENaC）异常激活所致，其机制涉及血浆丝氨酸蛋白酶（如纤溶酶）异常滤过并降解ENaC的γ亚基4,11,12。最近的研究证实，在肾病小鼠中，使用丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶治疗可有效阻断ENaC的蛋白水解激活和钠潴留，其效果与ENaC阻滞剂氨苯蝶啶相当13。为确保药物持续递送至远端小管，抑肽酶通过皮下植入的缓释丸剂给药。未来仍需进一步研究以鉴定在肾病综合征中负责ENaC蛋白水解激活的具体丝氨酸蛋白酶，这一机制被认为与人类疾病情况相似。为此，阿霉素诱导的肾病综合征是一种有价值的模型，既可用于野生型小鼠，也可扩展应用于基因工程小鼠。该模型的优势包括药物成本低、管理简便以及良好的可重复性14。
本文中，我们通过向眶后静脉窦快速静脉注射阿霉素诱导实验性肾病综合征，并植入含有抑肽酶的缓释小丸以抑制尿液丝氨酸蛋白酶活性，后者通过显色法测定。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Micro FINE + U-40（0.30 mm × 8 mm）</td><td>BD Deutschland GmbH，德国海德堡</td><td>PZN: 07468060</td><td>注射器</td></tr><tr><td>ETHILON*II（5/0，16 mm，3/8c，45 cm）</td><td>Johnson&amp;amp;Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, 诺德施泰特，德国</td><td>EH7823H</td><td>缝合线</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶（6000 KIU/mg）</td><td>LOXO，德国海德堡</td><td>CAS 9087-70-1</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen 眼鼻软膏</td><td>Bayer Vital GmbH，德国勒沃库森</td><td>PZN: 1578681</td><td>软膏</td></tr><tr><td>Chromogenix S-2251</td><td>HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH，德国埃森</td><td>82 0332 39</td><td>显色底物</td></tr><tr><td>阿霉素（2.0 &amp;micro;克/&amp;micro;L)</td><td>Cell Pharm，德国巴特维尔贝尔</td><td>CAS 25316-40-9</td><td>阿霉素</td></tr><tr><td>异氟烷 CP (1 mL/mL)</td><td>CP-Pharma，德国布尔戈多夫</td><td>CAS 26675-46-7</td><td>异氟烷</td></tr><tr><td>具有基质驱动持续释放功能的微球（定制）</td><td>Innovative Research of America，佛罗里达州萨拉索塔</td><td>X-999</td><td>沉淀物</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELx808 吸光度微孔板读数仪</td><td>BioTek，德国巴特弗里德里希斯哈尔</td><td>ELx808</td><td>酶标仪</td></tr><tr><td>MICROSTERIL - 436</td><td>意大利特雷斯科雷巴尔内阿里奥，B.M.S.</td><td>GAL/436</td><td>灭菌器</td></tr><tr><td>杂交炉/摇床</td><td>通用电气医疗英国有限公司，Amersham生命科学，小查尔方特，英国</td><td>RPN 2511</td><td>加热室</td></tr><tr><td>Thermo MAT Pro 10 W，15x25 cm，Lucky Reptile</td><td>进口出口 Peter Hoch GmbH，德国瓦尔德基尔希</td><td>61201</td><td>小鼠加热装置</td></tr></tbody></table>

通过眼后注射阿霉素诱导小鼠肾病综合征及缓释抑肽酶预防液体潴留

Induction of Nephrotic Syndrome in Mice by Retrobulbar Injection of Doxorubicin and Prevention of Volume Retention by Sustained Release Aprotinin

肾病综合征是蛋白尿性肾病最严重的表现形式，其特征为大量蛋白尿、低白蛋白血症、由于钠潴留引起的水肿以及高脂血症。为研究该综合征的病理生理机制，已开发出基于注射毒性物质（如导致足细胞损伤的阿霉素）的啮齿类动物模型。在小鼠中，仅有少数品系对该模型敏感。在野生型129S1/SvImJ小鼠中，通过快速静脉注射阿霉素至眶后窦可诱导出实验性肾病综合征，表现出人类疾病的所有症状，包括钠潴留和水肿。在蛋白尿发生后，小鼠尿液中丝氨酸蛋白酶活性升高，导致上皮钠通道（ENaC）激活和钠潴留。通过持续释放抑肽酶进行治疗，药理学抑制尿液中的丝氨酸蛋白酶，可消除ENaC的激活并防止钠潴留。该模型非常适合研究蛋白尿性肾病的病理生理机制， 即即活性丝氨酸蛋白酶的排泄，这些蛋白酶通过裂解ENaC的γ亚基使其激活。这可被视为蛋白尿性肾病中ENaC激活和钠潴留的主要机制。

在异氟烷麻醉诱导后，通过左侧眶后窦迅速注射阿霉素。全部体积的 7.25 µL/g bw 注射时无任何阻力和外渗，证明导管位置正确位于静脉内。小鼠从麻醉中迅速恢复，当日及之后均无异常表现，尤其是左眼未见任何损伤迹象。阿霉素注射后，由于阿霉素的普遍毒性作用，小鼠的食物和液体摄入量在前3天内下降，之后逐渐恢复。图1a）。注射后的前3天内，小鼠因食欲减退导致体重下降了3.4%（图1b）。从第5天开始th 当天，小鼠出现明显蛋白尿（图1c) 随后尽管食物摄入充足，尿钠排泄量仍出现显著下降（图1a，b）。这种钠潴留导致小鼠从第3天到第10天体重显著增加22.2%，并伴有腹水。由于蛋白尿，小鼠出现低白蛋白血症（图1c在第10天采集的血浆...

本文描述了通过快速眶后注射阿霉素在129S1/SvImJ小鼠中诱导实验性肾病综合征的方法。我们还使用含有抑肽酶的缓释丸对肾病小鼠进行治疗，以抑制尿液中丝氨酸蛋白酶活性并防止钠潴留。

肾病综合征是蛋白尿性肾病最严重的表现形式，其特征为大量蛋白尿、低白蛋白血症和水肿，原因在于……

该实验性肾病综合征小鼠模型的总体目标是展现从人类患者中所知的该综合征的所有特征，其中最重要的是钠潴留和水肿形成。该模型有助于阐明肾病综合征中钠潴留的机制。正如本文将要展示的，钠潴留是由于活性血清蛋白酶经尿液排泄所致，我们将这一现象称为蛋白酶尿（proteasuria）。该模型的主要优点在于易于诱导，并且具备人类肾病综合征和慢性肾病的所有特征。在实验操作的植入阶段，研究员Bohnert博士将演示这一技术。首先，在37摄氏度的培养箱中预热阿霉素。接下来，准备注射器。使用每微升含2微克的阿霉素溶液，在注射器上标记活塞的停止位置，以确保注入所需的剂量。然后，将已准备好的注射器归零质量，并将溶液注入至标记位置。为确认注射体积，需重新称量注射器。该注射必须在麻醉后约30秒内进行。麻醉小鼠后，将其置于右侧卧位，头部朝向操作者持注射器的手侧。然后，轻轻对眼球的背侧和腹侧施加压力，小心地使左眼球突出。接着，从内眼角处将导管插入左侧眶后窦，注意不要接触眼球。现在，将注射器略微倾斜，一次性快速注入团注液。不应有阻力或渗出迹象，例如眼球突出或注射部位液体渗漏。再次注射后，应重新检查静脉注射是否正确。应无任何渗出迹象，如前所述。然后，重新称量注射器并计算实际给予的阿霉素剂量。首先，在铺巾上准备好手术所需的物品：一把修毛剪、一把皮肤准备剪、手术刀、外科镊子、两把组织镊、持针器以及15厘米长的不可吸收单丝缝线。将加热装置放置于手术台上，用一层纱布覆盖，然后将麻醉后的小鼠俯卧位放置在纱布上。接着涂抹眼用软膏，使用剪刀从背部中央去除约0.5平方厘米的毛发。随后用酒精对皮肤进行消毒。通过尽量减少脱毛，伤口将具有天然保护作用。现在，沿头尾方向做一个长约5毫米的切口。然后，通过钝性分离皮下结缔组织，制作一个约1厘米深的左侧侧袋。接下来，从干燥容器中取出一枚10天缓释颗粒，将其平放在囊袋底部。然后用几针缝合皮肤，将线头剪得非常短，以防止小鼠通过啃咬打开缝线。现在，让小鼠单独恢复手术，以尽量减少术后痛苦和咬线行为。监测小鼠直至其恢复胸卧位。每天早晨在主观日出后约两小时内收集小鼠尿液。按摩小鼠的膀胱，以尽可能收集多的尿液至1.5毫升离心管中。同时观察腹水的形成情况，检查腹部周长是否增加或侧腹是否下垂。然后，称量小鼠、食物颗粒和饮水瓶的重量。随后，使用显色底物 S2251，根据尿液样本的蛋白水解活性测定蛋白尿。如果 S2251 工作液呈明显的黄色，则不得使用。将尿液样本在室温下解冻，为检测准备可被酶标仪读取的96孔板。每个样本取3 µL尿液加入两个孔中，然后向每孔中加入3 µL PBS或抑肽酶溶液。然后，向每个孔中加入 50 µL 底物工作液。所有样品设置完毕后，用酶标板封板膜覆盖酶标板，并在 37 °C 下孵育 1 小时。随后，使用酶标仪在 450 nm 波长下测定每个孔的光密度。在给小鼠注射阿霉素后，

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