猪节段性小肠缺血模型中肠道干细胞的分离与培养

该程序的总体目标是评估肠缺血对肠上皮干细胞的影响。这种方法可以帮助回答干细胞生物学领域的关键问题，例如干细胞如何抵抗损伤并有助于缺血性损伤后的修复。该技术的主要优点是它是一种大型动物模型，可用于临床肠道疾病的研究和修复。

演示该程序的是研究生 Amy Stieler Stewart 和我实验室的研究专家 John Freund。首先使用手术刀刀片在以 8 至 10 周龄的约克郡杂交猪的脐部为中心的腹部做一个 8 到 10 厘米的腹侧中线切口。找到空肠，位于回盲部交界处口约 40 厘米处。

周结扎肠道两次，以勾勒出 10 厘米长的空肠袢，每条结扎线之间 1 厘米。在每个彼此相邻的缺血时间点创建两个循环，一个用于缺血，一个用于缺血，并额外进行一小时的再灌注。为了诱导可逆的完全性缺血，在适当的实验时间内，使用 Bulldog 血管夹或止血钳阻塞每个夹子大约三个肠系膜血管。

在整个缺血期间保持腹部覆盖。在实验结束时，使用 Metzenbaum 剪刀首先在最后一个缺血环近端至少 5 至 10 厘米处收集正常空肠的对照片，然后收集其余的环。将每个损伤时间点的环储存在冰冷的 PBS 小容器中，直到隐窝分离。

要分离隐窝干细胞，请使用 20 号金属丝和组织镊子倒置小肠的每个环，以便露出粘膜表面。将每个环的顶部和底部牢固地缝合到金属丝上，然后用冰冷的 PBS 冲洗每个倒置的环。清除所有管腔碎片后，立即将样品放入含有 30 毫升解离试剂 1 号的 50 毫升锥形管中，在冰上放置 30 分钟，每 5 分钟摇动一次。

在孵育期结束时，将样品转移到相应的 50 毫升试管中，其中含有 30 毫升解离试剂 2 号，并通过离心沉淀 2 至 4 小时的缺血环样品。将沉淀重悬于 5 毫升 PBS 中，并从每个样品中使用 50 微升等分试样，通过光学显微镜检查隐窝结合的程度和碎片的数量。接下来，将样品置于 37 摄氏度的水浴中 10 分钟，每 5 分钟摇动或倒置一次。

然后将样品直接转移到 25 mL冰冷的 PBS 中，在设置为 60 RPM 的轨道摇床中，在冰上振荡 2 至 5 分钟，每 30 秒进行一次额外的手动振荡或倒置。在振荡孵育结束时，检查隐窝结合的程度和碎片的数量，并将样品转移到含有 25 毫升冷 PBS 的新 50 毫升锥形管中进行振荡，直到分离出完整的隐窝，碎片和绒毛最少。当环完全解离后，去除剩余的组织，通过离心沉淀样品，并将剩余的隐窝沉淀在 5 毫升新鲜 PBS 中。

然后将每管 150 个隐窝分装到单独的微量离心管中，并通过微量离心沉淀隐窝。使用预冷的移液器，用每孔 50 微升预混液轻轻重悬沉淀，然后快速移液 15 次以混合。接下来，将 50 微升隐窝液滴分配到预先蠕虫和网格化的 24 孔板的每个孔的中心，并将板放入 37 摄氏度的培养箱中。

30 分钟后，在每个基质肉饼上覆盖每孔 500 μL 的肠上皮干细胞培养基，向任何未使用的孔中加入 500 μL 无菌 PBS，以保持湿度并计算铺板的零日隐窝的数量。每 48 小时向每个孔中加入生长因子，每 96 小时用 500 μL 补充新鲜生长因子的培养基替换上清液。如图所示，通过用缝合线或夹子利用血管闭塞，在小肠袢中产生完全性肠缺血。

如果作正确，缺血性损伤将从肠绒毛尖端开始，并随着缺血持续时间的增加在隐窝内向下迁移。当血管没有结扎或夹紧均匀时，可能会出现手术技术的一个常见错误，导致出血性缺血，其中薄壁静脉在动脉之前塌陷，允许额外的血液渗入组织。去除缺血性肠袢后，可以按照刚刚演示的解离方案成功分离肠隐窝。

与没有损伤或轻度损伤的隐窝相比，来自更严重损伤时间点的隐窝通常会破裂，并且包含更多的背景细胞碎片。当正常和轻度受损的肠隐窝接种培养物时，肠球会在 24 至 48 小时内形成。由于严重的缺血性损伤，肠隐窝可以存活但受损，导致最初形成更小的球体。

到 72 到 120 小时，来自所有隐窝的类肠杆菌变得更加复杂，具有明显的中央管腔和出芽结构，并且隐窝生长效率总体降低，以及来自严重受损肠道组织的类肠杆菌的大小减小。一旦掌握，如果执行得当，隐窝隔离电镀程序可以在大约两到三个小时内完成。收集用于铺板的隐窝最好来自洗涤液，而不是来自解离级分，因为解离级分中培养物污染的可能性增加。

该方法也可用于测试药物治疗缺血正负再灌注引起的上皮损伤的疗效。开发后，这项技术为胃肠道生物学领域的研究人员在转化的、临床相关的大型动物模型中探索缺血对上皮的影响，特别是对肠道干细胞的影响铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何在有或没有再灌注的情况下产生肠缺血以及在体内损伤后分离肠隐窝进行 3D 培养有一个很好的了解。