Name: 猪节段性小肠缺血模型中肠道干细胞的分离与培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学习在猪节段性小肠缺血模型中分离和培养肠道干细胞的方法，用于研究缺血性损伤后的上皮修复机制。该技术为临床肠道疾病治疗提供重要研究基础。

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本项目由美国国立卫生研究院（NIH）K01OD0199、NIH T32 OD011130、NIH P30DK034987以及临床科学系传播基金资助

本实验的所有动物研究均经北卡罗来纳州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 培养前准备
注意：所有试剂均列于材料表中。特定生长因子的浓度列于表1中。
<ol>
	<li>在去离子蒸馏水（ddH2O）中配制 0.5 M 的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。充分混匀，并使用 NaOH 和/或 HCl 溶液调节 pH 至 7.4。 
	注意：每次实验前需新鲜配制 EDTA 储存液。</li>
	<li>按如下方法配制解离试剂 #1（DR #1），并置于冰上：将不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液（PBS）、0.5 M EDTA、1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT）、10 µM Y27632 以及含青霉素、链霉素和两性霉素 B 的 1× 抗生素-抗真菌素溶液（Anti-Anti）混合。 
	注意：在组织采集前立即加入 Y27632。</li>
	<li>按如下方法配制解离试剂 #2（DR #2），并置于 37 °C 水浴中预热：将不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS、0.5 M EDTA、10 µM Y27632 以及 1× Anti-Anti 混合。注意：在组织采集前立即加入 Y27632。</li>
	<li>按如下方法配制肠道上皮干细胞（IESC）培养基：将 25 mL 高级 DMEM/F12 培养基与 1× N2 添加剂、1× B-27 添加剂、10 mM HEPES、2 mM Glutamax 以及 1× Anti-Anti 混合。配制后于 4 °C 保存，待用。</li>
	<li>按如下方法配制低生长因子基底膜基质（基质）与补充生长因子的主混合液：将基质置于冰上解冻。在微量离心管中加入 100 ng/mL 重组人 Noggin、500 ng/mL 重组人 R-Spondin 1、50 ng/mL 重组人表皮生长因子（EGF）、100 ng/mL 重组人 Wnt3a、10 mM 烟酰胺、10 nM 胃泌素、500 nM A-83-01、10 µM Y-27632、10 mM SB202190、500 nM LY2157299 以及 2.5 µM 糖原合成酶激酶 3 抑制剂（GSK3i, CHIR99021）。待基质完全解冻后，加入上述生长因子混合物（形成主混合液），并立即置于冰上保存。 
	注意：操作时需小心避免引入气泡，否则在铺板过程中会在基质凝胶中产生人为假象。</li>
	<li>在开始细胞分离操作前，将 24 孔组织培养板放入 37 °C 培养箱中预热。</li>
</ol>
2. 缺血手术模型建立与组织采集
<ol>
	<li>选用八至十周龄的约克夏杂交猪（推荐），无论性别。术前 16–18 小时禁食，但可随时饮水。</li>
	<li>应安排实验猪至少在实验前 48 小时到达，以适应环境。 
	注意：由持证兽医监督下的专业兽医和/或实验室技术人员提供常规动物护理，并协助麻醉操作。</li>
	<li>以赛拉嗪（1.5 mg/kg，肌内注射（IM））和氯胺酮（11–20 mg/kg，肌内注射（IM））对猪进行术前给药15。待动物镇静后，经口进行气管插管。</li>
	<li>使用异氟烷（2–5%）在 100% O2 中汽化，维持猪的全身麻醉状态，直至实施安乐死。</li>
	<li>建立静脉（IV）通路（推荐耳缘静脉），并以 15 mL/kg/h 的维持速率输注乳酸林格液等替代液体。</li>
	<li>进行常规麻醉监测，包括脉搏血氧饱和度、心电图和无创血压测量15。&#160;监测猪的呼吸频率和呼吸努力，若呼气末 CO2 超过 55–60 mmHg，则根据需要进行手动或机械通气。 
	注意：适当的麻醉深度通过持续监测心率（80–130 次/分钟）、无创血压（平均动脉压 75–100 mmHg）和呼吸频率（10–25 次/分钟）16，并定期检查下颌张力和肛门张力是否消失来确认。也可通过手术刺激后肌肉松弛程度和肌束震颤情况判断麻醉深度。角膜反射通常无参考价值16。&#160;镇痛措施应根据机构动物护理与使用委员会（IACUC）的政策执行。本实验中可在手术期间给予阿片类药物（如布托啡诺）。&#160;</li>
	<li>将猪置于加热垫上，并以仰卧位固定，准备手术。</li>
	<li>剃除腹部腹侧毛发，并使用外科擦洗液（氯己定溶液）和异丙醇进行皮肤消毒。</li>
	<li>使用手术刀在脐部中心做一条 8–10 cm 的腹正中切口，以进入腹腔。</li>
	<li>在回盲瓣连接处近口端约 40 cm 处识别小肠（空肠）。在创建后续空肠袢之前，通过在肠管周围两次结扎形成间隔 1 cm 的结扎线，界定出长度为 10 cm 的空肠袢，各袢之间相距 10 cm，位于近口端（图 1）。</li>
	<li>每个缺血时间点创建两个相邻的肠袢，一个用于单纯缺血，另一个可额外进行 1 小时再灌注（如需要）。为实现完全缺血（动脉和静脉均无血流），使用血管夹（如鳄嘴钳）、弯头哈尔斯塔德蚊式止血钳或 2-0 不可吸收丝线夹闭或结扎肠系膜血管，分别持续 1、2、3 和 4 小时，如需再灌注，则在缺血后移除夹闭装置，进行 1 小时再灌注。 
	注意：作者按顺序创建所有缺血肠袢，从 4 小时缺血组开始，逐步向近端推进（以尽量缩短总手术时间）。为避免邻近缺血肠段对相邻肠袢造成损伤，可调整缺血肠袢的排列顺序，但可能影响总手术时间。 
	注意：再灌注时间可根据研究问题或是否需在再灌注期间测试治疗干预而调整。然而，随着缺血时间延长导致组织损伤加重，再灌注损伤对上皮损伤的额外贡献可能较小；但在轻度缺血损伤后，再灌注可能发挥一定作用。</li>
	<li>在不同缺血时间点之间，使用无菌纱布和/或纱布钳覆盖或关闭腹腔。 
	注意：在单只动物中，本实验最多可创建八个缺血肠段。另选取一段至少位于最后一个缺血袢近端 5–10 cm 的空肠段，作为内部正常对照。</li>
	<li>每个鳄嘴钳或弯头哈尔斯塔德蚊式止血钳应夹闭约三支肠系膜血管。应用止血钳时需格外小心，避免血管损伤。尽量将血管整齐排列于钳口内。</li>
	<li>实验结束时，经静脉注射戊巴比妥（85–100 mg/kg）实施安乐死后，在确认无心音听诊及角膜反射消失后，使用梅岑鲍姆剪刀采集所有肠段组织。&#160;首先采集一段位于最后一个缺血袢近端至少 5–10 cm 的正常空肠组织作为对照。</li>
	<li>将各损伤时间点的肠袢分别分离，并置于盛有冰冻 PBS 的小容器中，待进行隐窝分离时使用。 
	注意：如需要，可将缺血肠袢制作得足够长，以便分割为组织学和肠道干细胞培养的独立样本；但作者发现，长度超过约 10 cm 的肠袢更易发生出血性改变。</li>
</ol>
3. 缺血与对照肠袢中隐窝（干细胞）的分离
<ol>
	<li>使用20号金属丝和组织镊子将每段小肠袢翻转，以暴露其黏膜面。用缝线（2-0非吸收性丝线或同等材料）将肠袢的顶端和底端牢固地绑在金属丝上。</li>
	<li>翻转后，用预冷的PBS冲洗每个肠袢，以去除管腔内的碎片。</li>
	<li>立即将样本放入含有DR #1的50 mL锥形管中，置于冰上孵育30分钟。</li>
	<li>从对照组开始收集肠袢，随后依次收集缺血时间逐渐延长的肠袢。来自损伤较轻组织的样本（即对照组和缺血1小时的组织）可用力振荡，通过手腕快速甩动以获得最佳效果。来自严重损伤组织的样本（缺血3和4小时）应轻轻摇动或仅进行翻转，过度振荡会导致隐窝破坏和额外的组织损伤。所有锥形管在冰上处理期间应每隔5分钟振荡或翻转一次。</li>
	<li>将样本转移至DR #2中，在37°C水浴中孵育10分钟。每隔5分钟振荡或翻转一次试管。</li>
	<li>转移组织后，将含有DR #1的2–4小时损伤肠袢的锥形管进行离心（200 × g，5分钟），以去除EDTA上清液。由于这些组织损伤严重，隐窝可能已经解离。弃去上清液，用少量PBS（5 mL）重悬沉淀，并进行步骤3.9。</li>
	<li>从DR #2中取出样本，直接将组织样本放入盛有25 mL预冷PBS的容器中（标记为Wash #1），置于冰上，以60 rpm在轨道摇床上振荡。每隔2至5分钟，持续振荡或翻转每根试管30秒。</li>
	<li>转移组织后，将含有DR #2的2–4小时损伤肠袢的锥形管进行离心（200 × g，5分钟），以去除EDTA上清液。由于这些组织损伤严重，隐窝可能已经解离。弃去上清液，用少量PBS（5 mL）重悬沉淀，并进行步骤3.9。</li>
	<li>从Wash #1（或DR）中取出50 µL样品，检查隐窝解离程度及碎片量。将组织转移至新的50 mL锥形管（Wash #2、#3等），加入25 mL预冷PBS，持续振荡直至获得完整隐窝且碎片和绒毛最少。 
	注：目标是分离出含有完整隐窝且碎片极少的纯净组分。每次额外清洗可进一步净化细胞，但过度振荡将导致继发性组织/细胞损伤。此外，若从清洗步骤而非解离试剂步骤中接种隐窝，可获得最佳结果且污染最少。</li>
	<li>去除剩余组织，将50 mL锥形管在200 × g下离心5分钟以去除上清液，然后用较小体积的PBS（5 mL）重悬剩余的隐窝沉淀。</li>
	<li>使用倒置显微镜检查每份样本的50 µL等分试样，确定每份中的隐窝数量。目标为每50 µL含50–100个隐窝，此浓度适用于最终基质小饼的制备。 
	注：若样本浓度过高，继续添加预冷PBS直至达到理想浓度；若浓度过低，计算达到目标隐窝产量所需的等分试样数量并进行调整。</li>
	<li>根据等分试样观察结果，将适当体积的隐窝等分至微量离心管中。例如，若样本含50个隐窝/50 µL，则每饼取50 µL × 3个重复 = 150 µL/微量离心管；若样本仅含25个隐窝/50 µL，则每饼需2份等分 × 3个重复 = 300 µL/管。</li>
	<li>在4°C下以200 × g离心5分钟，沉淀隐窝。</li>
	<li>用适量主混合液（每孔50 µL）轻柔重悬沉淀的隐窝。通过快速移液15次充分混匀，避免产生气泡。 
	注：吸取主混合液前，先用预冷的无菌PBS预冷移液器吸头，有助于防止主混合液扩散。吸头也可提前置于冰箱冷藏，并在使用前立即放入生物安全柜中。</li>
	<li>将50 µL主混合液与隐窝液滴加入预热的24孔板每孔中央。</li>
	<li>将培养板在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>在每个基质小饼上覆盖500 µL/孔的IESC培养基（第0天无需额外添加生长因子，因其已包含在主混合液中）。</li>
	<li>向板上未使用的孔中加入500 µL无菌PBS，以维持湿度。</li>
	<li>在第0天统计接种的隐窝数量。 
	注：预先将每个细胞培养板划分为四个象限有助于提高计数准确性。</li>
	<li>每24小时统计一次肠球体数量，并每日监测类肠体发育情况。</li>
	<li>每48小时向每孔添加生长因子。每96小时更换一次IESC培养基，加入500 µL新鲜培养基（需在培养基中重新添加生长因子）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

建立节段性肠缺血的猪模型，使得能够在同一动物体内研究组织损伤的多个时间点，从而拓展了以往的小鼠模型。本方案有几个关键的讨论要点，包括正确的血管结扎、组织再灌注以及成功的隐窝细胞培养。
正确的血管结扎对于建立完全性缺血模型至关重要。如果结扎缝合不均匀或血管夹未完全夹紧，来自管壁较厚的动脉的血液可能持续流入组织，而由于管壁较薄的静脉已塌陷，血液无法流出，从而导致血液外渗至固有层，引起额外的组织损伤。然而，根据所研究的缺血性损伤类型，有时可能需要完全性缺血或出血性缺血模型。例如，在肠移植过程中，手术切除阶段会将肠管完全从供血血管（动脉和静脉）分离，从而导致完全性肠缺血。相反，在发生肠扭转等事件时，肠系膜发生扭转，通常首先阻塞静脉回流，导致组织内血液积聚，随后才出现动脉供血阻塞，从而形成出血性缺血。
缺血性损伤导致组织损害，始于绒毛顶端并向下延伸至隐窝基底部3。在缺血期间，以三磷酸腺苷（ATP）形式存在的能量持续被消耗，并生成代谢产物次黄嘌呤。当组织重新灌注氧气时，次黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶代谢，产生超氧自由基，从而引起黏膜损伤并募集破坏组织的中性粒细胞17,18。由于不同物种在黏膜血管结构以及黄嘌呤氧化酶表达水平上的差异，再灌注损伤的程度也各不相同3。猫和啮齿类动物的缺血-再灌注模型对活性氧代谢物引起的再灌注损伤更为敏感19,20。相比之下，猪体内黄嘌呤氧化酶含量较低，因此再灌注损伤较轻，该模型更接近人类肠道缺血的情况21。目前尚未有关于使用基因敲除或转基因猪模型研究肠道损伤的报道，这成为该模型的一个主要局限性。选择合适的动物模型取决于研究人员希望研究的疾病过程或特定条件。例如，已有研究描述了长达6小时的猪缺血损伤模型22，而大多数小鼠模型中的缺血操作通常为45至60分钟23。
从正常及缺血损伤的肠道中成功分离出肠隐窝，可实现对上皮细胞在体外培养中恢复过程的研究。该系统使研究者能够单独专注于上皮层本身，因为无需考虑血管供应或免疫细胞成分的影响。这为研究上皮细胞在损伤后的相互作用与修复过程提供了机会，同时也可用于评估不同生长因子的作用，或在手术期间及隐窝分离后通过添加补充物至培养基中所施加的各种处理措施的效果。该步骤仍是整个流程中最困难的部分，因为从严重受损的肠段中分离时，需轻柔振荡，并在含有EDTA的溶液中一旦隐窝提前解离即迅速移除溶液。若这些肠段未充分清洗，隐窝在培养过程中可能存在污染风险。因此，在两种DR溶液以及IESC培养基中均添加了抗生素-抗真菌素溶液。另一个值得讨论的问题是作为正常对照所采集的肠道组织。由于动物在实验中接受了麻醉，可能导致全身组织灌注发生改变，同时缺血还可能引发循环中的炎症介质释放，因此即使是&#34;正常&#34;对照组织，也可能并不代表真正的对照状态。在这些实验中值得注意的是，对照组织在大体形态和组织学表现上与其他实验中未经历缺血的动物组织相似（Gonzalez, L.M.，未发表数据，2017）。
综上所述，本方法描述了一种可重复的猪肠道缺血模型，该模型能够紧密模拟人类缺血性损伤的发生过程。此外，还介绍了从缺血肠段中分离肠道干细胞的方法，可用于在体外培养条件下研究上皮修复过程及对治疗的可能反应。

肠缺血性损伤是由于肠道血流减少或完全阻塞导致氧气供应下降所致，在人类和动物患者中仍是发病率和死亡率的重要原因1,2。缺血性损伤以及随之发生的炎症反应和细胞浸润会导致黏膜屏障功能受损。黏膜屏障对于防止细菌及其毒素向体循环移位至关重要3,4。随后缺血组织的再灌注可产生有害的活性氧物质，从而加重组织损伤5。由于肠缺血通常难以预防，目前大多数研究集中在推进缺血早期检测技术，以及开发新型治疗策略，以减轻再灌注损伤或促进黏膜修复。
动物模型已被广泛用于拓展我们对缺血-再灌注损伤的基础科学认知，并且在转化医学研究中仍然至关重要。啮齿类动物模型因其可进行基因操作而被最广泛使用6。然而近年来，由于猪在解剖学和生理学上与人类具有高度相似性等多方面优势，大型动物模型（特别是猪）已被提倡用于未来的转化研究7,8。目前已开发出多种损伤模型用于研究缺血-再灌注损伤，包括完全性血管阻塞、低流量缺血以及节段性肠系膜血管阻塞。尽管本文不拟全面综述这些模型，但作者建议读者参考近期的一篇综述文章3。
此外 体内 模型，使用 离体 细胞培养系统为研究肠道稳态及损伤后的修复提供了有力工具。肠道干细胞负责肠道上皮细胞的增殖与更新。当从正常或受损的肠道组织中分离后，肠道干细胞可在体外培养中维持其活性，并作为研究干细胞和上皮细胞生物学的工具或模型。针对多种物种和器官系统，已建立了从小肠和大肠分别分离并构建三维培养系统（分别称为类肠体和类结肠体）的方法。9,10,11,12,13具体而言，在胃肠道中，这些培养系统已被用于模拟胃肠道疾病，包括癌症、病原体感染和炎症性肠病。14目前尚无任何物种中关于从缺血损伤的小肠组织中分离和培养肠道干细胞的报道。因此，本文介绍了一种新型大型动物猪模型中的肠道缺血造模方法，该模型可产生可重复的损伤，并能够从正常及缺血损伤的肠道组织中分离肠道干细胞，以进一步研究其修复与恢复过程。 离体.

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液，不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP-399</td><td>按 1:10 稀释</td></tr><tr><td>蒸馏去离子水 (ddH₂O)</td><td></td><td></td><td>用于配制 EDTA 和 PBS</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>每次实验前新鲜配制；pH 7.4</td></tr><tr><td>1,4-二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM/F12 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/两性霉素 B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>抗-抗溶液</td></tr><tr><td>重组人 Wnt-3a</td><td>R &amp; D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>重组人 R-spondin1</td><td>R &amp; D Systems</td><td>4645-RS</td><td></td></tr><tr><td>重组人 Noggin</td><td>R &amp; D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF</td><td>R &amp; D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>人 [Leu]¹⁵-胃泌素 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>注射用水（WFI 级）</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>简称无菌水 (SW)；用于生长因子储备液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质胶，GFR 级</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>无酚红</td></tr><tr><td>24 孔培养皿</td><td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管&amp;nbsp;</td><td>Corning, Inc.</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>碳钢外科手术刀片，10 号</td><td>World Precision Instruments</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>组织镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Debakey 组织镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo 剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>501752</td><td>弯型或直型</td></tr><tr><td>Metzenbaum 剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>蚊式钳，弯型</td><td>World Precision Instruments</td><td>503724-12</td><td>弯型或直型 (503728-12)</td></tr><tr><td>Hopkins 蛙嘴钳</td><td>Stoelting Co.</td><td>52120-40P</td><td>直型</td></tr><tr><td>丝线，2-0&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>任何类似品牌均可接受</td></tr><tr><td>巾钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>金属缝合线，20 号</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>使用前剪断并拉直</td></tr><tr><td>手术巾</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>任何类似产品均可接受</td></tr><tr><td>乳酸林格氏液</td><td>Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>氯己定消毒液（4%）</td><td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>任何类似品牌均可接受</td></tr><tr><td>70% 异丙醇</td><td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>任何类似品牌均可接受</td></tr><tr><td>静脉导管，22 号</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>根据静脉大小，可能需要 20 号或 24 号</td></tr><tr><td>赛拉嗪（100 mg/ml）</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（100 mg/ml）</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>管制药品</td></tr><tr><td>异氟烷溶液</td><td>Henry Schein</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠（Fatal Plus 安乐死溶液（390 mg/ml））</td><td>Vortech Pharm.</td><td></td><td>有多个品牌的戊巴比妥钠可供选择</td></tr><tr><td>加热垫&amp;nbsp;</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump 核心加温系统；其他型号也可使用</td></tr><tr><td>Mindray Datascope 监护仪</td><td>Mindray North America</td><td></td><td>任何等效的监护设备均可接受</td></tr><tr><td>麻醉蒸发器&amp;nbsp;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>建议使用带 Y 型接头的循环系统；多家供应商可提供</td></tr><tr><td>输液泵</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+；推荐使用类似厂家产品</td></tr></tbody></table>

肠道干细胞的分离与培养：基于节段性小肠缺血猪模型的研究

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

肠缺血仍然是人类和兽医临床患者发病和死亡的主要原因。许多疾病过程会导致肠缺血，即肠道的血液供应减少，从而导致氧气供应下降。这会引起肠屏障功能丧失以及深层组织的损伤。肠道干细胞位于利贝昆隐窝（Lieberkühn crypts）的基底部，在稳态条件下以及损伤后负责肠道的再生更新。ex vivo 细胞培养技术通过建立支持三维上皮类器官系统生长的培养条件，成功实现了对上皮干细胞相互作用的研究（分别从小肠和大肠来源的类器官称为“肠类器官”（enteroids）和“结肠类器官”（colonoids））。这些肠类器官包含隐窝样和绒毛样结构域，并可成熟分化为肠上皮中存在的所有细胞类型。传统上，研究肠道损伤多采用小鼠模型。然而，猪模型具有多项优势，包括其体型以及胃肠道解剖结构和生理功能与人类高度相似。通过采用猪模型，我们建立了一种实验方案，可在单个动物体内创建节段性肠缺血环路，从而实现对缺血性损伤及修复不同时间点的in vivo研究。此外，我们还描述了一种方法，用于从缺血肠段中分离并培养肠道干细胞，从而可在ex vivo条件下持续研究由干细胞介导的上皮修复过程。

通过使用缝线或钳夹阻断血流，在小肠袢中建立完全性肠缺血，如图1所示。松开钳夹后，可进行可控时长的再灌注，以便根据需要进一步研究随后发生的再灌注损伤。所有动物在手术过程中均存活，直至实施安乐死，期间仅出现轻微并发症。最常见的手术并发症为低血压，补充正性肌力药物（如多巴酚丁胺）后可缓解。
若操作正确，缺血性损伤将从肠绒毛顶端开始，并随着缺血时间的延长逐渐向隐窝方向迁移（图2）。手术技术中一个常见的错误是血管结扎或夹闭不均匀。其结果是出血性缺血（图3），即薄壁的静脉在动脉之前塌陷，导致额外的血液渗入组织。肉眼可见浆膜面呈深紫色（图3，左），而完全性缺血时则表现为较苍白的表面（图3，右）。
切除缺血性肠段后，按照解离方案成功分离出肠隐窝（图4）。正如预期，来自损伤较严重时间点的隐窝常出现断裂（f；碎片），且隐窝组分中所含的背景细胞碎片较未受损或轻度损伤样本更多。在操作过程中，必须轻柔振荡严重受损的肠组织，以避免对底层组织造成额外损伤。振荡过于剧烈可能导致隐窝进一步受损，使大部分隐窝最终进入含EDTA的DR溶液中，从而造成更严重的破坏。
接种后，所有缺血时间点的隐窝均能存活并在培养中成功建立（图5）。当正常及轻度损伤的肠隐窝接种于培养体系时，可在24–48小时内形成肠类球体。在严重缺血损伤（3和4小时）情况下，肠隐窝虽可存活但已受损，导致最初形成的球体明显较小。至72–120小时，类肠体结构变得更加复杂，出现明显的中央腔和出芽结构。总体而言，来源于严重损伤肠组织的隐窝其生长效率降低，所形成的类肠体尺寸也减小（Gonzalez, L.M., 未发表数据, 2017）。
<img alt="肠管上的外科缝线及组织钳；术后观察；医疗操作。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：猪模型中完全性肠缺血的手术模型。 A) 外翻的正常猪空肠。B) 肠系膜血管已用缝线结扎，造成肠缺血。C) 使用无损伤血管夹（bulldog vascular clamps）夹闭血管以建立缺血模型，必要时可移除血管夹实现组织再灌注。D) 移除血管夹后立即观察到的肠管血管情况。<a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的肠道组织病理学改变，用于细胞结构分析的显微图像序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：完全性肠缺血持续时间延长后上皮损伤逐渐加重的组织学证据（苏木精-伊红（H&amp;E）染色）。 损伤始于绒毛顶端，随着缺血时间延长，单层上皮细胞逐渐丧失，绒毛变钝，细胞损伤向下延伸至隐窝基底部，在严重损伤时可达4小时。比例尺：100 µm。I = 缺血。 <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="缺血-再灌注肠道损伤；4小时内组织损伤进展的组织学表现。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：出血性缺血的大体及组织学证据。 A) 大体照片比较出血性缺血（左侧肠段）与完全性缺血（右侧肠段）。当血管未被均匀结扎或夹闭时，血液可继续渗入组织，导致额外的炎症反应和损伤。B) 出血性缺血持续时间分别为1至4小时的苏木精-伊红（H&amp;E）染色图像。除完全性缺血所见的细胞损伤外，周围固有层内可见红细胞浸润的证据。比例尺：100 µm。I = 缺血。 <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肠道隐窝显微镜观察、时间过程分析、组织形态学比较、生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：从缺血和正常肠段中分离出的肠道隐窝等分试样。从每一段肠组织中均成功分离出完整、结构完整的肠道隐窝（星号标记）。与未受损或轻度损伤的样本相比，损伤较严重的时点所获取的隐窝常出现断裂（f；碎片），且隐窝组分中含有更多的背景细胞碎片。比例尺：100 µm。I = 缺血。 <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="缺血条件下的细胞形态；显微镜图像；时间点：24、72、120 小时；对照组与缺血组。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：从小肠缺血肠段分离后的肠道干细胞生长时间进程。将正常的肠隐窝接种于培养体系中后，类肠体（enterospheres）在 24–48 小时内形成。在严重缺血损伤（3 和 4 小时）情况下，隐窝虽可存活，但最初形成的球体明显较小。至 72–120 小时时，类肠体结构更为复杂，出现明显的中央腔和出芽结构。标尺为 20 µm，另有注明者除外。<a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>生长因子</td>
			<td>稀释液</td>
			<td>储存液浓度</td>
			<td>储存液稀释倍数</td>
			<td>工作液稀释倍数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>1 µg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>10mM 乙酸</td>
			<td>10,000X</td>
			<td>500 µg/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000X</td>
			<td>500 µM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>烟酰胺</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胃泌素</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10,000X</td>
			<td>100 µM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10,000X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0.5 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000X</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td>2.5 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000X</td>
			<td>200 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：生长因子试剂表。 本方案中使用的生长因子储备液和工作液的汇总。

本方案将使读者能够成功建立节段性肠缺血的猪模型，并随后分离和培养肠干细胞，以研究损伤后上皮的修复过程。

肠缺血仍然是人类和兽医临床患者发病和死亡的主要原因。多种疾病过程可导致肠缺血……

本实验的总体目标是评估肠道缺血对肠上皮干细胞的影响。该方法有助于回答干细胞生物学领域的一些关键问题，例如干细胞如何抵抗损伤以及在缺血性损伤后如何参与组织修复。该技术的主要优势在于其采用大型动物模型，可用于临床肠道疾病及其修复过程的研究。为演示该操作的是来自我实验室的研究生艾米·斯蒂勒·斯图尔特（Amy Stieler Stewart）和研究专家约翰·弗罗因德（John Freund）。首先使用手术刀片在一只8至10周龄约克夏杂交猪的腹部脐部为中心，做一条8至10厘米长的腹正中切口。找到距回盲交界处口侧约40厘米的空肠。用缝线在肠管上环绕结扎两次，以界定出长度为10厘米的空肠袢，每条结扎线之间相距1厘米。每个缺血时间点创建两个相邻的肠袢，其中一个用于缺血处理，另一个用于缺血后额外再灌注1小时的处理。为诱导可逆性完全缺血，使用血管夹或止血钳夹闭每只钳子对应的约三条肠系膜血管，持续适当的实验时间。在整个缺血期间保持腹部覆盖。实验结束时，使用梅岑鲍姆剪刀首先采集距离最后一段缺血肠段近端至少5至10厘米处的正常空肠对照组织，随后采集其余肠段。将每个损伤时间点的肠段分别置于盛有冰冷PBS的小容器中，保存于冰上，直至进行隐窝分离。为了分离隐窝干细胞，使用20号钢丝和组织镊子将每段小肠翻转，使黏膜表面暴露。将每段肠管的顶端和底端牢固缝合到钢丝上，并用预冷的PBS冲洗每段翻转的肠管。当所有管腔碎片均被清除后，立即将样本分别放入含有30毫升解离试剂一的50毫升锥形管中，置于冰上孵育30分钟，并每隔5分钟进行振荡和翻转。孵育结束后，将样品转移至相应的含有30毫升解离试剂二的50毫升离心管中，并通过离心收集缺血2至4小时的肠段样品。将沉淀重悬于5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，从每份样品中取50微升等分试样，用光学显微镜检查隐窝结合程度及碎片量。随后，将样品置于37摄氏度水浴中10分钟，每隔5分钟振荡或颠倒混匀一次。然后将样品直接转移至装有25毫升预冷PBS的离心管中，置于冰上，在设定为60 RPM的摇床上振荡2至5分钟，期间每30秒额外进行一次手动振荡或颠倒混匀。振荡孵育结束后，检查隐窝结合程度及碎片量，将样品转移至新的50毫升锥形管中，管内含25毫升冷PBS，继续振荡直至获得完整隐窝且碎片和绒毛最少。当肠段完全解离后，移除残留组织，通过离心收集样品，将所得隐窝沉淀重悬于5毫升新鲜PBS中。然后将每管150个隐窝分装至若干个微量离心管中，并通过微量离心沉淀隐窝。使用预冷的移液器，每孔加入50 µL主混合液，轻柔重悬沉淀，并快速吹打15次以混匀。接着，将50 µL隐窝悬液滴加至已预铺基质胶并带网格的24孔板每个孔的中央，然后将培养板置于37°C培养箱中。30分钟后，向每个基质小饼上覆盖500微升每孔的肠道上皮干细胞培养基，并向任何未使用的孔中加入500微升无菌PBS以维持湿度，同时计数接种的第0天隐窝数量。每隔48小时向每孔添加生长因子，并每隔96小时更换上清液，加入500微升新鲜的含生长因子培养基。通过使用缝线或夹子进行血管阻断，可在小肠袢中建立完全性肠缺血，如图所示。若操作正确，缺血性损伤将从肠绒毛顶端开始，并随着缺血时间的延长逐渐向隐窝深处迁移。手术技术中一个常见错误是结扎或夹闭血管时不够均匀，导致出血性缺血的发生——即薄壁静脉在动脉之前塌陷，使得额外血液渗入组织。在切除缺血肠段后，可按照刚刚演示的解离方案成功分离肠隐窝。相较于未受损或轻度损伤的隐窝，损伤更严重的时相点所获取的隐窝通常结构破碎，并含有更多的背景细胞碎片。当正常或轻度损伤的肠隐窝被接种于培养体系中时，类肠体可在24至48小时内形成。而在严重缺血性损伤情况下，肠隐窝虽可存活，但因受损而最初仅能形成体积小得多的类球体。培养72至120小时后，所有类器官均变得更加复杂，出现明显的中央腔和出芽结构，但隐窝生长效率总体下降，且来源于严重受损肠组织的类器官尺寸减小。一旦掌握，若操作得当，隐窝分离与接种操作可在约两到三小时内完成。用于接种的隐窝最好来源于洗涤液，而非解离组分，因为解离组分更易导致培养污染。该方法还可用于测试药物在治疗由缺血伴或不伴再灌注所导致的上皮损伤中的有效性。该技术建立后，为胃肠道生物学领域的研究人员探索缺血对上皮层——特别是对肠干细胞——的影响开辟了道路，提供了一种具有转化意义且临床相关的大型动物模型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立伴或不伴再灌注的肠道缺血模型，以及如何在体内损伤后分离肠隐窝用于三维培养。

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科研

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Medicine

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