通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

该方法有助于解答DNA修复领域中的关键问题，例如DNA修复复合物的形成、定位及解聚是如何被调控的。该技术的主要优势在于能够明确检测修复复合物的定位变化及其动力学特征。除了我实验室中的这些本科生研究人员外，还将有三名研究生参与实验操作。

这将是Changkun Hu、Dalton Dacus和Stephen Walterhouse。首先，在10厘米的组织培养皿中培养U2OS/DR-GFP细胞，直至细胞融合度达到85%至90%。然后吸去培养基，加入3毫升EDTA，并在室温下孵育细胞3分钟。

用 1 毫升胰蛋白酶替换 EDTA，将细胞在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。然后加入 5 毫升 DMEM 以中和胰蛋白酶。细胞计数后，在玻璃底 96 孔板中每孔接种 6 × 10³ 个细胞，每孔培养液体积为 200 微升。

或者，在10厘米培养皿中，将12毫米的盖玻片置于其中，每孔加入8毫升培养基，接种四次，每次10的6次方个细胞，然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜培养细胞。为诱导双链断裂（DSBs），将培养基更换为用含10%胎牛血清的DMEM稀释成25微摩尔浓度的过氧化氢溶液，在37摄氏度下孵育1小时。用1×PBS洗涤细胞三次，然后加入新鲜的DMEM培养基。

孵育结束后，用 PBS 洗涤培养板三次以固定细胞。然后使用针头和镊子小心地从每个时间点的 10 厘米培养板中取出一张盖玻片，并将其放入 24 孔板的单个孔中。加入 4% PFA，孵育细胞 15 分钟。

然后用 PBS 清洗盖玻片三次。为了通透细胞，加入 0.5% 非离子型去垢剂与 PBS。将细胞在室温下孵育 15 分钟。

然后用 PBS 再次洗涤细胞，共洗涤三次。接着在 24 孔板中向盖玻片加入用 PBS 稀释的 3% BSA 和 0.1% 非离子型去垢剂，于室温孵育一小时。然后加入针对目标修复蛋白的一抗，于室温孵育一小时。

用 PBS 洗涤细胞三次后，加入 DAPI，并在室温下孵育 5 分钟。然后用二抗孵育样品。按照之前的方法再次洗涤细胞，使用封片剂将盖玻片细胞面朝下封固在载玻片上。

轻轻按压盖玻片，并用擦纸吸去多余的封片试剂。用快干透明指甲油密封盖玻片，确保盖玻片与载玻片完全密封。通过聚焦 DAPI 通道，使用共聚焦显微镜拍摄图像。

为了在免疫荧光图像中定义细胞核，可通过将图像文件拖入 ImageJ 窗口，或在 ImageJ 的插件工具栏中选择 bio-formats 导入器来打开共聚焦图像。然后选择拆分通道。在颜色选项下，从下拉菜单中选择“彩色化”。

单击“确定”以将 DAPI 和组蛋白 H2AX 图像作为独立窗口打开，并选择 DAPI 图像。然后在“调整阈值”选项中选择图像工具栏以选中细胞核。接下来，通过将阈值窗口底部滑块完全向右滑动来调整图像阈值。

调节顶部工具栏，直至细胞核呈现完全红色且轮廓清晰，背景为黑色。然后选择分析工具栏中的“分析颗粒”选项。输入细胞核的最小尺寸。

从下拉菜单中选择“轮廓”，然后选择“添加到管理器”选项。单击“确定”以打开 ROI 管理器窗口。在 ROI 管理器窗口中，通过选择为细胞核分配编号。

使用 ImageJ 定量分析 H2AX 焦点和免疫荧光显微图像时，首先选择 H2AX 焦点窗口。然后选择“处理”工具栏，点击“查找最大值”以识别细胞核内的焦点。在输出类型下拉菜单中选择“单点”选项，并勾选“预览点选择”以可视化最大值焦点。

然后根据图像的荧光强度输入一个噪声容差值。在 ROI 管理器窗口中，选择需要定量 H2AX 焦点的细胞核。选择“测量”以测定所选细胞核内最大焦点的数量。

复制原始强度值，并将其粘贴到数据分析软件中。在本视频前面已演示过，将细胞接种于含有盖玻片的96孔板中后，使用基于脂质的转染试剂将I-SceI表达载体转染细胞，以诱导产生双链断裂。在按照前述步骤洗涤、通透并封闭细胞后，加入针对γH2AX和目的修复蛋白的抗体，以进行成像检测。

用 1× PBS 将 96 孔板盖玻片洗涤三次。然后将 96 孔板盖玻片与二抗孵育。最后，在鉴定出具有较大核内 γH2AX 焦点的细胞后，手动计数其中同时显示与目的修复蛋白共定位的细胞。

该图显示了90的噪声 Discrimination，并标记了正确的焦点数量。在定量分析过程中，位于边缘的细胞核以及细胞核外的焦点不被计入。此处所示的图示展示了50的低噪声容限。

在细胞核外和细胞核内均识别出多个信号高点。该细胞具有220的高噪声容限。仅检测到一个焦点信号。

本图展示了γH2AX焦点与一种感兴趣的修复蛋白的共定位。此处显示了一个未转染的细胞，以及一个具有非核内γH2AX焦点的细胞（位于右上角）。在更高放大倍数下，可以更清晰地区分真正的核内焦点与非核或外部焦点。

最后，此处展示了一个没有修复蛋白共定位的细胞核γH2AX焦点示例。一旦掌握，若操作得当，该技术可在数天内完成。在完成该步骤后，还可进行其他方法，如共免疫沉淀，以鉴定目标修复蛋白之间的相互作用。

观看本视频后，您应能够充分理解如何通过诱导DNA中的瞬时双链断裂来观察DNA修复复合物的形成与解聚过程。您还将学习如何通过诱导持久性损伤，明确区分修复因子的错误定位与招募延迟现象。