Name: 颅内 Subarachnoidal 感染对猪链球菌生物膜在小鼠感染模型中作用的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 了解小鼠颅内蛛网膜下腔感染模型研究猪链球菌生物膜在细菌性脑膜炎中的作用。该方法可直接研究细菌成分对中枢神经系统免疫反应的影响，为评估新药物疗效提供平台。

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本工作得到了中国国家重点研发计划 [2017YFD0500102]、国家自然科学基金委员会 [31572544]、兽医病原生物学国家重点实验室 [SKLVEB2016KFKT005] 和中国上海农业应用技术发展计划 [G2016060201] 的资助。

小鼠感染实验已获得中国江苏省实验动物管理委员会的批准，并在南京农业大学实验动物中心进行（许可证号：SYXK (苏) 2017-0007）。
1. 细菌的制备
注意：S. suis 2型强毒株P1/7分离自患脑膜炎的病猪19。P1/7菌株在Todd-Hewitt液体培养基（THB，每升THB配方：心浸液，3.1 g；新胨，20.0 g；葡萄糖，2.0 g；氯化钠，2.0 g；磷酸氢二钠，0.4 g；碳酸钠，2.5 g）中培养，并接种于Todd-Hewitt琼脂培养基（THA，每升THA配方：心浸液，3.1 g；新胨，20.0 g；葡萄糖，2.0 g；氯化钠，2.0 g；磷酸氢二钠，0.4 g；碳酸钠，2.5 g；琼脂，15.0 g）上，在37 °C、5% CO2条件下培养。
<ol>
	<li>收集浮游状态的 P1/7 菌株细胞
	<ol>
		<li>从对数中期培养物（OD600=0.6）中收集 5 mL 浮游细胞，以 8000 × g 离心 3 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>用 5 mL 含 25% 甘油的 THB 重悬细胞，分装至 5 支试管中，于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集生物膜状态的 P1/7 菌株细胞
	<ol>
		<li>取 20 mL 过夜培养物加入 180 mL 新鲜 THB 培养基中，将稀释后的培养物等量分装至 10 个圆形培养皿中，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 24 小时。</li>
		<li>培养结束后，&#160;轻轻振荡培养皿以重悬未贴壁的细菌，然后通过抽吸弃去上清液。 
		注意：轻轻振荡培养皿，避免重悬已沉淀的生物膜细胞。</li>
		<li>加入 5 mL PBS 收集生物膜状态细胞，充分重悬沉淀，然后将样品转移至新试管中。</li>
		<li>对上一步获得的生物膜状态细胞进行超声处理，参数如下：60 W，4 个循环，工作 5 秒，间歇 10 秒。</li>
		<li>以 8000 × g 离心 3 分钟，将上清液于 -80 °C 保存。 
		注意：上清液可能含有生物膜组分，可在动物实验（步骤 3）所述感染前用于重悬生物膜细菌。</li>
		<li>用 10 mL 含 25% 甘油的 THB 重悬沉淀，将生物膜状态细胞于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 扫描电子显微镜（SEM）分析
<ol>
	<li>使用4%多聚甲醛在4 °C下固定收集的生物膜状态细胞和浮游细胞12 - 24小时。</li>
	<li>用蒸馏水快速冲洗样品，并依次用浓度递增的乙醇（25%、50%、70%、90%和100%）进行脱水，每种浓度处理30分钟。</li>
	<li>用双面胶带将干燥后的样品固定在金属样品台上，最后在蒸发镀膜仪中镀上金和钯。</li>
	<li>采用以下参数通过扫描电子显微镜观察样品：EHT（额外高电压）= 10 kV；WD（工作距离）= 7.0 或 8.0 mm；放大倍数 = 5000 ×；信号A = SE1。</li>
</ol>
3. 动物实验
<ol>
	<li>本研究使用 SPF 级 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠。所有小鼠均通过颅内蛛网膜下腔途径感染，注射位点位于前囟前方 3.5 mm 处。该注射位点的立体定位坐标已在 Chiavolini 等17的研究中明确描述。
	<ol>
		<li>用于组织病理学分析时，分别使用浮游态细胞或生物膜态细胞以 3 × 107 菌落形成单位（CFU）的剂量感染两组小鼠（每组 5 只），另设 5 只小鼠注射 PBS 作为对照组。</li>
		<li>用于检测脑组织中 TLR2 和细胞因子 mRNA 表达时，分别使用浮游态细胞或生物膜态细胞以 3 × 107 CFU 的剂量感染另外两组小鼠（每组 6 只）。</li>
		<li>通过在 THA 培养基上进行系列稀释涂布，测定活菌数量。</li>
		<li>于感染后 12 小时处死所有小鼠，用于后续研究。 
		&#8203;注意：感染前必须去除保存菌种的甘油。从 -80 °C 取出的浮游态细胞和生物膜态细胞均需用 PBS 洗涤 3 次。随后，浮游态细胞用 PBS 重悬并稀释至适当感染剂量；生物膜态细胞则用保存的上清液（来自步骤 1.2.5）重悬并稀释至适当感染剂量。感染体积不应超过 50 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测脑组织中 TLR2 和细胞因子的 mRNA 表达
	<ol>
		<li>使用 RNA 提取试剂盒从脑组织中提取总 RNA。
		<ol>
			<li>每只小鼠使用全脑组织提取 RNA。将全脑组织分成 5 份，每份取不超过 100 mg 组织，加入 1 mL 裂解液及试剂盒提供的裂解基质至各离心管中。</li>
			<li>在匀浆器中以 6.0 档位处理 40 秒，然后于 12000 × g、4 °C 离心 5 分钟。</li>
			<li>离心后，将上清液转移至新的微量离心管中。</li>
			<li>将转移后的样品在室温孵育 5 分钟；加入 300 µL 氯仿，涡旋振荡 10 秒，再于室温孵育 5 分钟。</li>
			<li>于 12000 × g、4 °C 离心 5 分钟，将上清液转移至新管中。</li>
			<li>向管中加入 500 µL 冷的无水乙醇，颠倒混匀 5 次，然后于 -20 °C 至少保存 1 小时。</li>
			<li>于 12000 × g、4 °C 离心 15 分钟，弃去上清液。用 500 µL 冷的 75% 乙醇（溶于无 RNase 的 H2O 中）洗涤沉淀。</li>
			<li>去除乙醇，室温下空气干燥沉淀 5 分钟，然后将 RNA 重悬于 100 µL 无 RNase 的 H2O 中。</li>
			<li>室温孵育 RNA 5 分钟，使用 RNA 生物分析仪测定 RNA 浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用逆转录（RT）试剂盒和热循环仪进行 cDNA 合成，包括基因组 DNA（gDNA）的去除。
		<ol>
			<li>在离心管中加入 1 µg RNA、2 µL 5x gDNA 去除缓冲液、1 µL gDNA 去除酶，并用无 RNase 的 H2O 补足至 10 µL 体积。于 42 °C 孵育 2 分钟。</li>
			<li>向上述反应液中加入 10 µL 预混液（含 1 µL RT 酶混合液 I、1 µL RT 引物混合液、4 µL 5x Buffer 2 和 4 µL 无 RNase 的 H2O），轻轻混匀。立即进行逆转录反应：37 °C 15 分钟，随后 85 °C 5 秒。</li>
			<li>使用 SYBR RT-qPCR 试剂盒和实时荧光定量 PCR 仪进行定量实时 PCR（RT-qPCR）分析。反应体系为：10 µL 2x 酶液、0.8 µL 正向引物、0.8 µL 反向引物、0.4 µL 50x ROX 参比染料 II、2 µL cDNA 模板，用无 RNase 的 H2O 补足至 20 µL 总体积。</li>
			<li>每个样本设三个复孔，运行以下热循环程序：94 °C 30 秒，随后 40 个循环（95 °C 5 秒，60 °C 34 秒），最后进行熔解曲线分析（95 °C 15 秒，60 °C 1 分钟，95 °C 15 秒）。RT-qPCR 所用引物列于 表 1。内参基因选用 B2m 和 18s rRNA。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据 2-ΔΔCt 法计算相对表达倍数变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织切片观察
	<ol>
		<li>用 10% 福尔马林固定 24 小时后，将固定脑组织修整为 2–3 mm 大小的组织块。</li>
		<li>将组织块放入包埋盒中，置于新的固定液中，使用自动真空脱水机进行脱水处理。</li>
		<li>取出固定组织，依次在浓度递增的乙醇溶液（70%、80%、95%、95% 和 100%）中各浸泡 30 分钟进行脱水。</li>
		<li>用二甲苯透明 15 分钟，浸入 60 °C 液体石蜡中 90 分钟，然后使用包埋机进行石蜡包埋。</li>
		<li>将石蜡包埋的组织切成 3 µm 厚的切片，在 45 °C 水面上展平，随后自然晾干。</li>
		<li>切片于 60 °C 孵育 3 小时，采用苏木精-伊红（HE）染色法染色，中性树胶封片。</li>
		<li>使用光学显微镜观察脑组织的组织病理学改变。采用四分制评分系统评估组织学变化，并使用非配对 t 检验进行统计分析。 
		充血/出血：无，记 0 分；局部小范围充血/出血，记 1 分；大范围局部充血/出血，或多个小范围局部充血/出血，记 2 分；最多三个大范围局部充血/出血灶，记 3 分；弥漫性充血/出血，记 4 分。 
		坏死：无，记 0 分；局灶性坏死，记 1 分；弥散分布 1–10 个坏死细胞，记 2 分；融合性坏死灶，记 3 分；广泛融合性坏死，记 4 分。 
		炎性细胞浸润：无，记 0 分；少量且局灶性浸润，记 1 分；多灶性浸润或形成细胞聚集，记 2 分；最多三个聚集灶，记 3 分；超过四个聚集灶，记 4 分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%3A+a+new+emerging+or+an+old+neglected+zoonotic+pathogen%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?</a> Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).</li>
<li>Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%2C+an+important+pig+pathogen+and+emerging+zoonotic+agent-an+update+on+the+worldwide+distribution+based+on+serotyping+and+sequence+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing.</a> Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45(2014).</li>
<li>Kerdsin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Streptococcus+suis+serotype+9+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).</li>
<li>Hatrongjit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+case+report+of+sepsis+due+to+infection+with+Streptococcus+suis+serotype+31+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Diseases%22%5BJournal%5D)">First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand.</a> BMC Infect Diseases. 15, 392(2015).</li>
<li>Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+involved+in+the+pathogenesis+of+the+infection+caused+by+the+swine+pathogen+and+zoonotic+agent+Streptococcus+suis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis.</a> Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA%3A+a+major+proinflammatory+component+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).</li>
<li>Isiaku, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+is+associated+with+chronic+streptococcal+meningoencephalitis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish.</a> Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).</li>
<li>Oggioni, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+from+planktonic+to+sessile+life%3A+a+major+event+in+pneumococcal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis.</a> Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).</li>
<li>Xiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+small+RNA+rss04+contributes+to+the+induction+of+meningitis+by+regulating+capsule+synthesis+and+by+inducing+biofilm+formation+in+a+mouse+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model.</a> Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+serotype+2%2C+an+important+swine+and+human+pathogen%2C+induces+strong+systemic+and+cerebral+inflammatory+responses+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).</li>
<li>Seitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intranasal+mouse+model+for+mucosal+colonization+by+Streptococcus+suis+serotype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2.</a> Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).</li>
<li>Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+of+pigs+against+Streptococcus+suis+serotype+2+infection+using+a+live+avirulent+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain.</a> Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).</li>
<li>Williams, A. E., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+Streptococcal+meningitis+following+intravenous+intracisternal+and+natural+routes+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+cochlear+inflammation+and+vestibular+syndrome+in+an+experimental+model+of+Streptococcus+suis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).</li>
<li>Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+Studies+of+Different+Sequence+Types+and+Geographical+Origins+of+Streptococcus+suis+Serotype+2+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection.</a> Pathogens. 5 (3), (2016).</li>
<li>Chiavolini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+inducing+experimental+pneumococcal+meningitis+in+outbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice.</a> BMC Microbiology. 4, 36(2004).</li>
<li>Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otitis+interna+is+a+frequent+sequela+to+Streptococcus+suis+meningitis+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs.</a> Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).</li>
<li>Holden, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+virulence+and+drug+resistance+in+the+emerging+zoonotic+pathogen+Streptococcus+suis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis.</a> PLoS One. 4 (7), e6072(2009).</li>
<li>Dominguez-Punaro Mde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+microglial+inflammatory+response+to+Streptococcus+suis%2C+an+important+emerging+zoonotic+agent+of+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis.</a> Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).</li>
<li>Hassan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+detection+methods+of+biofilm+formation+in+the+clinical+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates.</a> Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).</li>
<li>Vanier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+putative+virulence+factors+of+Streptococcus+suis+involved+in+invasion+of+porcine+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells.</a> Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).</li>
<li>Takeuchi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+suilysin+to+the+pathogenesis+of+Streptococcus+suis+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis.</a> Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).</li>
<li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的颅内蛛网膜下腔感染途径相较于其他感染途径具有明显优势。该方法可使研究人员直接在脑内研究宿主与细菌之间的相互作用，以及细菌组分对宿主免疫反应的影响，从而模拟细菌进入中枢神经系统的过程。因此，该感染途径可进一步用于研究其他细菌引起脑膜炎的机制。此外，该方法还可用于评估药物对细菌性脑膜炎的治疗效果。
为了使用该模型获得良好的实验结果，需明确以下关键步骤。生物膜的形成必须在实验条件下进行检测。在本研究中，采用扫描电子显微镜分析进行检测。其他方法也可用于检测生物膜的形成，例如组织培养板法和试管法21。感染前一天，需将浮游状态细胞和生物膜状态细胞的冻存样品从-80 °C解冻，以测定CFU。次日，应根据CFU将细菌稀释至适当的感染剂量。实验中需设置注射PBS的模拟感染对照组，该组小鼠在整个感染实验期间应无任何异常表现。不同菌株的感染剂量可能不同，因此强烈建议先进行预实验以确定合适的感染剂量。在本研究中，根据预实验结果采用3 × 107 CFU作为感染剂量。在预实验中，该剂量的生物膜细菌可在感染后48小时导致全部5只小...

猪链球菌 (S. suis是一种全球范围内猪的主要细菌性病原体，可引起脑膜炎、肺炎、败血症、心内膜炎和关节炎等严重疾病1它也是一种新出现的动物源性病原体。迄今为止，已有九种血清型被报道可引起人类感染，包括血清型2、4、5、9、14、16、21、24和312,3,4在人类和猪中，脑膜炎是主要的临床症状之一 S. suis 感染。在越南和泰国， S. suis 是成人脑膜炎的主要病因5微生物生物膜是相互黏附并集中于界面的微生物群落，对细菌的致病性、在多种环境中的存活以及抗生素耐药性具有重要作用。5生物膜通常被一种细胞外基质包裹，该基质通常含有多糖、蛋白质和DNA6后者能够引发宿主的炎症反应和细胞因子产生7已有研究表明，生物膜的形成与链球菌性脑膜炎相关。生物膜有助于 无乳链球菌 在罗非鱼模型中发现脑膜炎以及脑组织内和脑膜表面周围的生物膜形成 体内 通过腹腔内接种8. 在脑膜炎期间， 肺炎链球菌 处于类似生物膜的状态，且处于这种生物膜状态的细菌在小鼠感染模型中更有效地诱导脑膜炎9此外，在我们之前的研究中，与生物膜状态相关的 S. suis 在小鼠脑组织中通过生存分析揭示细菌毒力的贡献10然而，关于生物膜参与的直接证据 S. suis 脑膜炎需要进一步研究。
已利用小鼠建立多种S. suis感染的动物模型，包括腹腔内（i.p.）11、鼻内（i.n.）12、静脉内（i.v.）13以及颅池内（i.c.）感染途径14,15,16。然而，腹腔内、鼻内和静脉内感染途径并不适用于直接研究S. suis表面组分在脑部脑膜炎发病过程中的作用，这些组分包括生物膜中的细胞外基质。尽管已有研究采用颅池内接种进行S. suis感染，但相关文献中并未明确描述精确的注射位点。相比之下，先前一项研究已清晰地描述了颅内蛛网膜下腔接种的立体定位坐标17，这使得接种位点易于识别，并简化了实验操作流程。此外，颅内蛛网膜下腔感染途径可模拟细菌从鼻窦或中耳进入中枢神经系统的过程17，Madsen et al18已证实中耳与S. suis引起的脑膜炎之间存在关联。而且，在我们之前的研究中，通过在小鼠中应用颅内蛛网膜下腔感染途径，证明了S. suis的小RNA rss04在脑膜炎发生中具有促进作用10。
在本研究中，采用颅内蛛网膜下腔感染途径在小鼠中研究生物膜在猪链球菌（S. suis）脑膜炎中的作用。通过该感染途径，用浮游状态或生物膜状态的猪链球菌（S. suis）感染小鼠。对注射了生物膜状态细胞的小鼠脑组织进行组织病理学分析，并检测到TLR2及细胞因子mRNA表达水平升高，结果明确表明猪链球菌（S. suis）生物膜参与了脑膜炎的发生。

<table><tbody><tr><td>Todd Hewitt 肉汤（THB）</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>DF0492078</td><td>将 30 g 粉末溶解于 1 L 纯化水中。121&amp;deg; 下高压灭菌 15 分钟。</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>DSBIO</td><td>16C0050</td><td>将 15 g 粉末溶解于 1 L THB 中。121&amp;deg; 下高压灭菌 15 分钟。</td></tr><tr><td>Milli-Q Reference 水纯化系统</td><td>Merck KGaA</td><td>Z00QSVCUS</td><td>无 Dnase/Rnase</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>天津科密欧化学试剂有限公司</td><td>10019318</td><td>将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3 和 0.27 g KH2PO4 溶解于 1 L 纯化水中。121&amp;deg; 下高压灭菌 15 分钟。用 KOH 调节 pH 至 7.4。</td></tr><tr><td>Na2HPO3</td><td>西陇科学股份有限公司</td><td>9009012-01-09</td><td>将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3 和 0.27 g KH2PO4 溶解于 1 L 纯化水中。121&amp;deg; 下高压灭菌 15 分钟。用 KOH 调节 pH 至 7.4。</td></tr><tr><td>KCl</td><td>西陇科学股份有限公司</td><td>9009017-01-09</td><td>将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3 和 0.27 g KH2PO4 溶解于 1 L 纯化水中。121&amp;deg; 下高压灭菌 15 分钟。用 KOH 调节 pH 至 7.4。</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>西陇科学股份有限公司</td><td>9009019-01-09</td><td>将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3 和 0.27 g KH2PO4 溶解于 1 L 纯化水中。121&amp;deg; 下高压灭菌 15 分钟。用 KOH 调节 pH 至 7.4。</td></tr><tr><td>KOH</td><td>西陇科学股份有限公司</td><td>9009014-01-09</td><td>将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3 和 0.27 g KH2PO4 溶解于 1 L 纯化水中。121&amp;deg; 下高压灭菌 15 分钟。用 KOH 调节 pH 至 7.4。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>西陇化学试剂有限公司</td><td>10010618</td><td>与等体积纯化水稀释后，121&amp;deg; 下高压灭菌 15 分钟</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>西陇化学试剂有限公司</td><td>80096675</td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛</td><td>西陇化学试剂有限公司</td><td>30092436</td><td>用纯化水稀释 10 倍用于固定。</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>西陇化学试剂有限公司</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>西陇化学试剂有限公司</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11+</td><td></td></tr><tr><td>超声波细胞破碎仪</td><td>宁波新芝生物科技股份有限公司</td><td>JY96-IIN</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>日立工机株式会社</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>冰箱</td><td>澳柯玛股份有限公司</td><td>DW-86L500</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>蔡司</td><td>EVO-LS10</td><td></td></tr><tr><td>FastRNA Pro Green 试剂盒</td><td>MP Biomedicals</td><td>#6045-050</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 仪器</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>1124310110</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4485689</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>宝日医生物技术（北京）有限公司</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>含 gDNA 消除剂的 PrimeScript RT 试剂盒</td><td>宝日医生物技术（北京）有限公司</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>全封闭组织处理仪</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ASP200S</td><td></td></tr><tr><td>加热式石蜡包埋模块</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>半自动旋转切片机</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片水浴</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>自动染色机 XL</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100</td><td>安捷伦科技</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>BX51</td><td></td></tr></tbody></table>

颅内蛛网膜下腔感染途径用于研究功能 猪链球菌 小鼠感染模型中脑膜炎的生物膜研究

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Streptococcus suis 不仅是全球猪群中重要的细菌性病原体，也是一种新发的人畜共患致病菌。在人类和猪中，脑膜炎是 S. suis 感染的主要临床表现之一。建立合适的感染模型是研究病原体致病机制的重要工具。目前已建立多种小鼠感染途径用于研究 S. suis 的致病过程。然而，腹腔、鼻腔和静脉感染途径并不适用于直接研究 S. suis 表面组分（如生物膜中的细胞外基质）在脑组织中对脑膜炎发生的作用。尽管已有研究采用小脑延髓池接种 S. suis，但其精确的注射位点尚未明确描述。本文介绍了一种小鼠颅内蛛网膜下腔感染模型，用于研究生物膜在 S. suis 脑膜炎中的作用。将 S. suis 浮游状态细胞或生物膜状态细胞通过位于前囟前方 3.5 mm 的注射位点直接注入小鼠蛛网膜下腔。对注射生物膜状态细胞的小鼠脑组织进行组织病理学分析，并检测到 TLR2 及细胞因子 mRNA 表达水平显著升高，结果明确表明 S. suis 生物膜在 S. suis 脑膜炎中发挥着确定性作用。该感染途径相较于其他途径具有明显优势，可有效用于研究宿主与细菌之间的相互作用；此外，它还能直接评估细菌组分对脑内宿主免疫应答的影响，并模拟细菌侵入中枢神经系统的过程。该感染模型可进一步推广用于研究其他细菌引起脑膜炎的机制，也可用于评估抗细菌性脑膜炎药物的疗效。

采用扫描电镜分析在实验条件下生物膜的形成情况。如图1所示，浮游状态细胞（图1A）与生物膜状态细胞（图1B）在生物膜形成方面存在显著差异。扫描电镜分析显示，生物膜中的细菌以团块状和多层结构存在，并被包裹在胞外基质中；而浮游细菌密度较低，主要呈单个分散状态。
生物膜的细胞外基质组分（如DNA）能够引发宿主的炎症反应和细胞因子产生。根据先前的研究，TLR2以及细胞因子CCL2、IL-6和TNF-α参与了与脑膜炎相关的脑部炎症反应10,11,2...

本文描述了通过颅内蛛网膜下腔途径感染小鼠，以研究生物膜在猪链球菌（Streptococcus suis）性脑膜炎中的作用。该感染模型也适用于研究其他细菌性脑膜炎的发病机制以及新型药物对抗细菌性脑膜炎的疗效。

猪链球菌不仅是全球范围内猪的重要细菌性病原体，也是一种新发的人畜共患致病菌。在人类和猪中，脑膜炎是一种主要的...

该方法有助于解答关于猪链球菌组分在生物膜胞外基质等多个位点中所起作用的关键问题。该技术的主要优势在于，它能够研究影响脑内免疫反应的细菌组分，并模拟细菌进入中枢神经系统的途径。本次实验操作将由我实验室的研究生张守明先生进行演示。为收集P1/7菌株的浮游细胞，首先从对数中期培养物中收集5毫升细胞。在8000 × g条件下离心3分钟，随后用PBS洗涤细胞3次。用5毫升含25%甘油的THB重悬细胞，并分装至5个管中。或者，为收集P1/7菌株的生物膜状态细胞，取20毫升过夜培养物加入180毫升新鲜THB培养基中。将稀释后的培养物等量分装至10个圆形培养皿中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。培养结束后，轻轻振荡培养皿，使未黏附于皿壁的细菌重新悬浮，注意避免使已沉淀的细胞重新悬浮。然后，通过抽吸弃去上清液。加入 5 mL PBS 以收集生物膜状态的细胞。充分重悬沉淀，然后将样品转移至新管中。按照文本方案中列出的步骤对重新悬浮的生物膜状态细胞进行超声处理。随后，将超声处理后的细胞在8000 × g条件下离心3分钟，并将上清液置于-80 °C保存。上清液可能含有生物膜组分，可在感染前用于重新悬浮生物膜细菌。按照文本方案中所述，使用扫描电子显微镜观察样品前，用10毫升含25%甘油的THB重悬沉淀。使用浮游态细胞或生物膜状态细胞感染所有小鼠，并按照文本方案中所述实施安乐死。随后，使用RNA提取试剂盒从脑组织中提取总RNA。每只小鼠使用全脑组织提取 RNA。将全脑组织分成五份，分别放入五个管中。每管加入不超过 100 毫克的脑组织，并向每管中加入 1 毫升裂解液，同时加入试剂盒提供的裂解矩阵。按照文本方案中列出的步骤提取RNA。接下来，使用带有反转录试剂盒的PCR仪进行CDMA合成，并消除基因组DNA。将一微克RNA加入含有两微升5X基因组DNA去除缓冲液和一微升基因组DNA去除酶的离心管中。加入无RNase水，直至体积达到10 µL。在42 °C下孵育2分钟。向反应溶液中加入10 µL主混合液，然后轻轻混匀。立即进行逆转录反应，将离心管置于37摄氏度下15分钟，随后将反应体系转移至85摄氏度持续五秒。使用实时荧光定量PCR仪和Cyber定量实时PCR试剂盒进行定量实时PCR分析。根据试剂盒说明书，将酶、引物、50X ROX参比染料二和cDNA模板混合，然后加入无RNA酶的水，直至总体积达到20微升。使用文本方案中列出的热循环参数对每个样本进行三复孔检测，并基于2-ΔΔCT法计算相对表达倍数变化。同时按照文本方案中的详细步骤，对感染脑组织的组织学切片进行观察和评分。此处展示了生物膜对模拟脑组织炎症反应的影响。感染后12小时，与浮游状态细菌相比，感染小鼠脑组织中CCL2、IL6、TNF-α和TLR2的表达水平在生物膜状态细菌感染组显著升高。与浮游细菌感染小鼠相比，生物膜

intracranial-subarachnoidal-route-infection-for-investigating-roles

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

颅内 Subarachnoidal 感染对猪链球菌生物膜在小鼠感染模型中作用的研究

来源： 张，S. 等颅内蛛网膜下腔感染途径用于研究作用 猪链球菌 小鼠感染模型中脑膜炎的生物膜研究 视频实验杂志...

检测细菌感染小鼠脑组织中靶基因的表达

来源： Lenhard, A. 等 一种小鼠模型用于研究转变过程 肺炎链球菌 从定植者到病原体：病毒共感染重现年龄加剧的疾病进程 视频实验杂志 (2022)本视频展示了一种小鼠共感染模型，其中流感病毒引发向 肺炎链球菌...

一种用于研究致病性转变的小鼠模型 肺炎链球菌 继发性病毒感染

在本视频中，我们演示了将脑膜炎奈瑟菌（Neisseria...

通过脑池内递送脑膜炎奈瑟菌至小鼠模型以诱导脑膜炎奈瑟菌性脑膜炎

用于研究靶向微血管系统的细菌感染的人源化小鼠模型

动物模型在阐明宿主和病原体特异性机制以促进慢性炎症发展方面已被证明是不可或缺的工具。本文描述了一种利用人类病原体牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas...

一种用于研究病原体诱导局部及全身慢性炎症的小鼠模型

本文描述了一种利用大肠埃希菌 K1（Escherichia coli...

新生大鼠中神经致病性Escherichia coli感染的非侵入性模型

可视化 肺炎链球菌 心脏微损伤及其后续心脏重塑

本文介绍了一种通过成年小鼠小脑延髓池途径感染以诱导脑膜炎奈瑟菌性脑膜炎的方法。我们提供了一个从接种物制备到小脑延髓池感染的脑膜炎奈瑟菌感染逐步实验方案；随后记录动物存活情况，并评估小鼠组织中的细菌载量。...

通过小脑池注射诱导小鼠C群脑膜炎球菌性脑膜炎

本文描述了一种新型小鼠模型，用于研究肺炎链球菌在病毒感染期间从无症状定植者转变为致病性病原体的过程。该模型可轻松适用于研究疾病进展不同阶段以及多种宿主中多微生物与宿主-病原体之间的相互作用。...

小鼠模型在转变过程中的应用 肺炎链球菌 从定植者到病原体：病毒共感染重现年龄加剧的疾病进程

本实验方案描述了一种采用皮下背部植入法的小鼠模型，用于研究植入物相关感染，可对病理生理机制进行系统性分析，并有助于建立诊断标准及开发靶向治疗策略。...

小鼠植入物相关感染的动物模型

在此，我们介绍一种通过鼻内滴注建立小鼠脓毒症免疫抑制模型的实验方案 肺炎克雷伯菌...

通过鼻内滴注细菌建立小鼠脓毒症诱导的免疫抑制模型

了解小鼠颅内蛛网膜下腔感染模型研究猪链球菌生物膜在细菌性脑膜炎中的作用。该方法可直接研究细菌成分对中枢神经系统免疫反应的影响，为评估新药物疗效提供平台。

颅内蛛网膜下腔感染途径用于研究功能猪链球菌小鼠感染模型中脑膜炎的生物膜研究

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