Name: 热 Nanoimprinting 技术制备梯度 Nanopattern 及其对人血管内皮细胞菌落形成的响应筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 了解热纳米压印技术制备梯度纳米图案的方法，用于筛选人血管内皮祖细胞对物理刺激的响应。该技术可高重复性地生产影响细胞行为的支架，为神经科学和再生医学研究提供重要工具。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过教育、科技与技术部（MEST）资助的基础科学研究中心项目 [NRF-2015R1D1A1A01060397] 以及 Bio &amp;#38; 国家研究基金会（NRF）由科学技术信息通信部资助的医疗技术开发项目 &amp;#38; 未来规划 [NRF-2017M3A9C6029563]

本研究经韩国大学安山医院机构审查委员会批准（IRB编号：ED170495）。所有操作均依照《赫尔辛基宣言》及其后续修订版本的规定进行。
1. 通过电化学抛光制备铝（Al）基底
注意：电解抛光液具有腐蚀性和毒性。操作时需佩戴个人防护装备，包括腈类手套、护目镜和实验服。此步骤须在通风橱中进行。
<ol>
	<li>在1 L双夹套烧杯中混合乙醇（C2H5OH，99.9%）和高氯酸（HClO4，60%），配制电解抛光液（C2H5OH:HClO4 = 4:1）。</li>
	<li>将双夹套烧杯连接至循环器，并将温度设定为7 °C。将双夹套烧杯置于磁力搅拌器上，持续搅拌至少30分钟，直至溶液温度降至7 °C。</li>
	<li>使用鳄鱼夹和铜线将高纯铝片（99.999%，20 × 50 × 1 mm3）和碳对电极浸入电解抛光液中。 
	注意：应小心安装鳄鱼夹，避免其接触溶液。若夹子与溶液接触，可能有杂质从夹子中析出，污染铝片。</li>
	<li>将铝片连接至直流（DC）电源的正极，碳对电极连接至负极。</li>
	<li>关闭磁力搅拌器，施加20 V电压，维持该状态4分钟。</li>
	<li>开启磁力搅拌器，继续通电6分钟。 
	注意：静态条件可去除铝片表面大部分杂质和粗糙结构，动态条件有助于提高最终的电解抛光质量。</li>
	<li>关闭电源，手动将铝片从夹子上取下。用去离子水彻底冲洗铝片，以去除残留的溶液。</li>
	<li>用氮气吹干铝片，并在惰性气体环境中保存。此干燥步骤应在完成第1和第2步中的所有实验后进行。 
	注意：若使用压缩空气吹扫，应使气流从抛光面流向未抛光面。反之，未抛光部分的杂质可能逸出并污染铝片。</li>
</ol>
2. 使用磷酸电解液制备梯度AAO模具
注意：甲醇及其蒸气具有眼毒性。持续接触铬可能导致严重的铬中毒。请在通风橱中进行此步骤。
<ol>
	<li>初次阳极氧化
	<ol>
		<li>配制1 L磷酸电解液时，将590 mL去离子水加入玻璃瓶中。</li>
		<li>向玻璃瓶中加入400 mL甲醇（CH3OH，99%）和10 mL磷酸（H3PO4，85%），通过手动摇晃或磁力搅拌充分混合溶液。</li>
		<li>将500 mL电解液倒入1 L双层夹套烧杯中。用鳄鱼夹和铜线将抛光的铝板和碳对电极浸入溶液中。</li>
		<li>添加额外的电解液，使电化学抛光的边界位于液面以上2–3 mm处。 
		注意：若阳极氧化过程中电化学抛光边界与液面接触，铝板在氧化过程中容易发生烧蚀。</li>
		<li>在U型底座上安装垂直轴，使用金属夹具固定顶置式搅拌器和搅拌桨。将搅拌桨的螺旋部分置于两个电极的下端附近，设置顶置式搅拌器的转速为200–300 rpm。</li>
		<li>将双层夹套烧杯连接至循环器，并将温度设定为-10 °C。在搅拌条件下使系统静置至少1 h，直至温度降至-10 °C。 
		注意：请勿使用水作为冷却剂，因为水在低温下会结冰，导致循环系统无法正常工作。建议使用体积比为1:1的水和乙醇混合液作为冷却剂。</li>
		<li>在持续搅拌条件下施加195 V电压，持续16 h。 
		注意：若施加电压后2–3 h内电流超过50 mA，则发生烧蚀的可能性极高。应立即停止实验，更换新的铝板。若该问题反复出现，请检查循环器的温度控制是否异常。若无异常，则更换电解液。</li>
		<li>关闭电源，手动将铝板从夹具上取下。用去离子水冲洗阳极氧化后的铝板，以去除残留的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氧化铝刻蚀
	<ol>
		<li>通过将9.0 g三氧化铬（CrO3）和20.3 mL磷酸（H3PO4，85%）溶解于500 mL去离子水中，配制铬酸刻蚀液。</li>
		<li>将刻蚀液倒入1 L双层夹套烧杯中，将温度设定为65 °C。</li>
		<li>在搅拌条件下，将阳极氧化后的铝板浸入刻蚀液中至少10 h。用铝箔密封烧杯顶部。</li>
		<li>用去离子水多次冲洗刻蚀后的铝板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二次阳极氧化
	<ol>
		<li>设置与步骤2.1.1至2.1.7相同的实验条件。</li>
		<li>将刻蚀后的铝板连接至系统的阳极，施加195 V电压，持续6 h。随后关闭电源，手动将铝板从夹具上取下。立即用去离子水冲洗阳极氧化后的铝板。 
		注意：若冲洗操作延迟，残留的磷酸会导致AAO孔径非预期地增大。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>梯度孔径扩大
	<ol>
		<li>通过将5.765 g磷酸溶解于500 mL去离子水中，配制孔径扩大溶液。将溶液倒入1 L双层夹套烧杯中。</li>
		<li>将双层夹套烧杯连接至循环器，并将温度设定为30 °C。在烧杯旁垂直放置一个线性移动平台。将支架固定在该平台的移动部件上。</li>
		<li>将线性平台的移动部件归位至初始位置。将夹具固定在支架上，并装入阳极氧化后的铝板。</li>
		<li>手动调节铝板的位置，使其恰好位于溶液表面正上方。 
		注意：此步骤中铝板不应接触溶液。一旦铝板接触溶液，孔径扩大过程即刻开始。</li>
		<li>以4.86 µm/s的速度将铝板缓慢浸入溶液中，持续120 min，制备出长度为35 mm、孔径从120 nm到200 nm连续变化的AAO模板（GP 120/200）。当铝板接触溶液表面时，立即启动秒表计时。</li>
		<li>为制备GP 200/280和GP 280/360模板，分别将GP 120/200模板整体浸入孔径扩大溶液中2 h或4 h。</li>
		<li>用去离子水多次冲洗梯度铝板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在梯度AAO模具上通过自组装单分子层沉积防粘附层
注意：在手套箱内执行步骤 3.2.1 至 3.3.3。将真空泵和干燥氮气注入装置连接至手套箱。在除湿过程开始前，将所有样品、试剂和仪器放入手套箱中。重复抽真空和注入氮气的操作至少三次，以充分去除手套箱中的水分。使干燥氮气持续流经实验体系。
<ol>
	<li>使用Piranha溶液处理对AAO模具进行羟基化修饰
	<ol>
		<li>在聚四氟乙烯（PTFE）烧杯中加入140 mL硫酸（H2SO4，95%），逐滴加入60 mL过氧化氢（H2O2，30%）。静置30分钟，直至溶液冷却。 
		注意：配制Piranha溶液时需格外小心。自加入过氧化氢起，溶液会剧烈沸腾并产生高温。实验必须在通风橱中进行。</li>
		<li>使用非金属镊子将AAO模具浸入溶液中30秒。</li>
		<li>用去离子水多次冲洗AAO模具。将模具在去离子水中浸泡30分钟，再放入甲醇中浸泡30分钟。 
		注意：废弃使用过的Piranha溶液时，必须用大量自来水充分稀释。</li>
		<li>将AAO模具在真空条件下完全干燥3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>20× HDFS储备液的配制 
	注意：HDFS是（十七氟-1,1,2,2-四氢癸基）二甲基氯硅烷的缩写
	<ol>
		<li>取一个1 L的正己烷瓶，装入三分之一的分子筛。用石蜡膜密封后，在干燥氮气环境中存放24小时。</li>
		<li>使用玻璃注射器和0.2 µm PTFE针头滤器过滤200 mL正己烷。</li>
		<li>将80 mL过滤后的正己烷倒入100 mL玻璃瓶中，加入2 mL HDFS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自组装单分子层沉积
	<ol>
		<li>在100 mL烧杯中加入57 mL过滤后的正己烷，将AAO模具浸入溶剂中。</li>
		<li>向正己烷中加入3 mL HDFS储备液，配制成2.9 mM的HDFS溶液。反应静置10分钟。</li>
		<li>将AAO模具转移至新鲜的正己烷中。密封所有试剂瓶，关闭氮气阀，然后从手套箱中取出样品。 
		注意：HDFS对水分极为敏感。所有含HDFS的试剂均应存放于干燥器中。</li>
		<li>将AAO模具浸泡在60 mL甲氧基九氟丁烷（C10H6F18O2，99%）中。每次在烧杯中进行10秒超声清洗，以去除物理吸附的HDFS分子。重复清洗过程10次。 
		注意：长时间连续超声处理AAO模具而无间歇，会损坏氧化层。</li>
		<li>将AAO模具在真空条件下完全干燥24小时。 
		注意：成功沉积的防粘附层具有超强疏水性，并在干燥器中可保持数月稳定。此步骤可作为暂停点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过热压印技术制备梯度纳米图案平板
注意： 在洁净室中执行步骤 4.2 至 4.7。
<ol>
	<li>使用印刷电路板（PCB）切割器将1.1 mm厚的聚苯乙烯片切割成2.9 mm宽、3.7 mm长的尺寸。</li>
	<li>使用镊子从底部剪下35 mm的AAO模具。在背面标记样品名称和制造日期。</li>
	<li>用少量乙醇清洁8.0&#34;晶圆。将聚苯乙烯片放置在晶圆上，然后安装AAO模具。</li>
	<li>将底膜放入热压印机的抽屉中。将顶膜固定到垫圈上。</li>
	<li>将晶圆放在底膜上。将垫圈放置在晶圆上。确保晶圆表面无灰尘。</li>
	<li>关闭热压印机的抽屉。施加165 °C的温度和620.52&#8239;kPa的压力，持续100秒。</li>
	<li>将样品冷却至室温。轻轻扭转聚苯乙烯片以取下AAO模具。</li>
</ol>
5. 梯度纳米图案板的灭菌与亲水性修饰
<ol>
	<li>将纳米图案板放置于方形培养皿中，加入 100 mL 70% 乙醇，紫外照射 30 分钟。</li>
	<li>用氮气吹干纳米图案板，然后将其转移至氧气等离子体发生器中。</li>
	<li>抽真空至腔室压力达到 1.33 Pa，随后以 30 cm3/min 的速率通入氧气，施加 60 W 射频功率，维持氧气等离子体处理 90 秒。 
	注意：建议在等离子体处理后 14 天内使用纳米图案板。</li>
	<li>使用一滴甲苯将纳米图案板固定于细胞培养皿底部。</li>
	<li>将样品密封于袋中，采用低温等离子体灭菌器进行灭菌。</li>
</ol>
6. hECFCs 的培养
注意：除非另有说明，所有离心步骤均需在 4 °C 下进行。
<ol>
	<li>分离外周血单个核细胞（PBMCs）前，将经胶原蛋白包被的12孔培养板在37 °C下孵育1小时。</li>
	<li>使用1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗12孔培养板。</li>
	<li>使用肝素抗凝管采集50 mL人血。</li>
	<li>在15 mL离心管中加入6 mL亲水性多糖溶液，并将8 mL血液加入该亲水性多糖溶液中。 
	注意：应缓慢地将血液用移液器加入亲水性多糖溶液中。</li>
	<li>以1020 × g离心20分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>收集不透明的细胞层，并转移至新的15 mL离心管中。</li>
	<li>加入含10%胎牛血清（FBS）的PBS，以1020 × g离心10分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，加入红细胞裂解缓冲液，冰上静置5分钟。</li>
	<li>加入含10% FBS的PBS，以1020 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，加入含10% FBS的PBS，以1020 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，加入1 mL含10% FBS的内皮细胞扩增培养基。每孔接种8.0 × 106个细胞至各胶原蛋白包被的培养板中。</li>
	<li>培养期间每周每天更换培养基，之后每2天更换一次。 
	注意：人内皮集落形成细胞（hECFCs）通常在培养第10至14天后出现。hECFCs呈现典型的鹅卵石样形态，并形成细胞集落，可在相差显微镜下观察到。进一步扩增细胞后，还可通过血管内皮钙黏蛋白（CD144）和血管性血友病因子（vWF）的免疫荧光染色对hECFCs进行表征。</li>
	<li>培养hECFCs时，使用含5% FBS及青霉素/链霉素的内皮细胞扩增培养基，在37 °C、含5% CO2的湿润气氛中进行培养。每天更换一次培养基。</li>
	<li>完成hECFC诱导后，将细胞扩增至第7代，用于后续实验。</li>
</ol>
7. 在梯度纳米图案化培养板上进行细胞接种与培养
注意： 步骤 7 描述了在梯度纳米图案化培养板上培养 hECFCs 的方法，但也可使用其他细胞来源。
<ol>
	<li>在室温下，用 1 mL 含 0.1% 蛋白包被液的 PBS 溶液孵育梯度纳米图案化培养板 10 分钟。 
	注意： 0.1% 的蛋白包被液不会覆盖纳米柱结构。</li>
	<li>使用胰蛋白酶通过标准的细胞传代方法从培养皿中制备 hECFCs 悬液。</li>
	<li>将细胞悬液稀释至所需密度，并将 hECFCs 接种到梯度纳米图案化培养板和平面对照板上（例如，1.0 × 104 个细胞/cm2）。 
	注意： 当 hECFCs 以 1.0 × 104 个细胞/cm2 的密度接种于梯度纳米图案化培养板时，通常在 2 天后细胞汇合度达到 70 - 80%。</li>
	<li>将细胞在培养箱中于平面或梯度纳米图案化培养板上培养 2 天。</li>
</ol>
8. 观察与分析
<ol>
	<li>扫描电子显微镜（SEM）成像
	<ol>
		<li>用 2.5% 戊二醛在 4 °C 下固定培养于平面或梯度纳米图案化培养板上的 hECFCs，过夜。</li>
		<li>在室温下用 1% 四氧化锇处理 1 小时，用 PBS 洗涤样品。</li>
		<li>用乙醇按浓度梯度（50%、70%、80%、90% 和 100%）依次脱水，每步 10 分钟。</li>
		<li>在室温下用六甲基二硅氮烷（HMDS）处理 15 分钟，随后用新鲜 HMDS 洗涤，并将样品置于通风橱中至少 1 天，直至残留的 HMDS 完全挥发。</li>
		<li>使用铂溅射镀膜仪对样品镀膜 5 分钟，并用扫描电子显微镜观察样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜（TEM）成像
	<ol>
		<li>用含 2% 多聚甲醛和 2.5% 戊二醛的 PBS 混合液在 4 °C 下固定培养于平面或梯度纳米图案化培养板上的 hECFCs，过夜。</li>
		<li>使用 1% 四氧化锇进行后固定，并按照步骤 8.1.3 的方法进行脱水。</li>
		<li>将样品包埋于环氧树脂中，从包埋块切出厚度为 60 nm 的超薄切片，并将切片置于透射电镜载网上。</li>
		<li>用含 10 mg 醋酸铀（溶于 100 mL 甲醇）和 0.1 mg 柠檬酸铅（溶于 100 mL 蒸馏水）的混合液对切片进行染色，使用透射电子显微镜获取图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光染色
	<ol>
		<li>用 4% 多聚甲醛在室温下固定培养于平面或梯度纳米图案化培养板上的 hECFCs，持续 15 分钟。</li>
		<li>在室温下用含 5% 山羊血清和 0.1% 辛基酚聚氧乙烯醚的 PBS（PBST）对样品进行通透和封闭，持续 30 分钟。</li>
		<li>在室温下用抗人维甲蛋白（vinculin）一抗（1:500，溶于 PBST）孵育样品 2 小时，用 PBST 洗涤三次。</li>
		<li>在室温下用荧光标记的鬼笔环肽（1:1,000，溶于 PBST）和荧光标记的二抗（1:1,000，溶于 PBST）孵育样品 2 小时，用 PBST 洗涤三次。</li>
		<li>在室温下用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:1,000，溶于 PBST）孵育样品 5 分钟。</li>
		<li>在梯度纳米图案化表面滴加 10 µL 封片剂，将盖玻片覆盖于封片剂上。</li>
		<li>将样品倒置放置于载物台上，使用共聚焦荧光显微镜采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>将 hECFCs 的图像导入图像分析系统。</li>
		<li>随机选取鬼笔环肽染色图像的视野，调整阈值，生成细胞与背景清晰区分的二值化图像。</li>
		<li>在细胞周围绘制轮廓，测量细胞面积和周长，并手动统计每个细胞的丝状伪足数量。</li>
		<li>随机选取维甲蛋白染色图像的视野，调整阈值，生成黏着斑区域的二值化图像。 
		注意：应适当调整图像阈值，避免黏着斑区域出现人为的过度填充或填充不足。</li>
		<li>统计每个细胞的黏着斑数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

阳极氧化铝（AAO）的制备常存在裂纹、孔洞形状不规则以及烧蚀等缺陷。产生这些缺陷的主要原因被称为电解击穿，其受被阳极氧化的金属基底性质及电解液电阻率的显著影响21。由于电解液的电阻率随温度变化，因此在高电压阳极氧化条件下，持续从电极处移除热量，以维持电解液局部温度的稳定，是关键所在。在本实验方案中，我们通过改进Masuda的两步阳极氧化法22,23来制备AAO模板。将约一半的电解液替换为甲醇，不仅可防止电解液在低温下冻结，还可通过孔底部的蒸发作用带走电极的热量24。使用顶置式搅拌器和搅拌桨而非磁力搅拌器，同样是为了确保温度控制。典型的磁力搅拌器在长时间运行过程中，由于磁子意外错位，极易发生空转。这一问题会导致电解液循环不充分，使其温度升高，进而引发烧蚀。
为了在AAO模板上形成尺寸梯度，我们逐步将AAO浸入磷酸蚀刻液中。AAO在蚀刻液中停留的时间越长，孔径扩大程度越大，如...

近年来，细胞对外部表面形貌物理刺激的响应在细胞工程领域受到广泛关注1,2,3,4。因此，人们对细胞附着表面的三维纳米结构给予了更多关注5。已有研究报道，作为细胞表面识别装置的整合素可通过机械传导将细胞外基质（ECM）微纳米结构所产生的物理刺激传递至细胞内部6。这种机械刺激通过接触引导调节细胞行为7，并诱导细胞骨架重排以改变细胞形态，同时影响细胞的局部黏附和刚度8。
人体内的内皮祖细胞（hEPCs）与周围细胞外基质（ECM）的微环境密切相关9这表明，细胞外基质的物理状态与血流产生的剪切应力一样，是特定细胞-基质黏附复合物形成的重要参数。10据报道，表面纳米形貌可增强 体外 hEPCs 形成广泛的毛细血管管状网络11 且ECM/生物可溶性因子复合系统能够使hEPCs识别功能失调的基底并促进伤口愈合12,13然而，细胞外基质与人内皮祖细胞之间的关系尚不明确。
尽管许多研究人员试图阐明细胞反应与不同基底提供的物理信号之间的关系14,15,16，但这些研究仅使用了固定尺寸的纳米结构或排列不规则的纳米图案，难以明确揭示纳米结构尺寸与细胞行为之间的关系。问题在于缺乏合适的工具来筛选细胞反应，以替代现有繁琐且反复的实验方法，从而确定纳米结构的最佳尺寸。因此，亟需一种直接有效的技术，用于在无需重复实验的情况下筛选细胞对物理刺激的反应。
本文描述了我们在先前报告中使用的一种方法17,18,19，用于制备一种纳米柱排列直径逐渐增大的梯度纳米图案。此外，我们还介绍了如何在梯度纳米图案培养板上培养并分析人脐带血来源内皮集落形成细胞（hECFCs）的行为，以确定物理刺激对细胞的影响。采用温和阳极氧化、梯度刻蚀及防粘连涂层方法制备梯度多孔氧化铝（AAO）模板。通过热压印光刻技术，以低成本且简便的方式复制出相同的聚苯乙烯梯度纳米图案。利用梯度纳米图案，可在一次实验中确定何种尺寸的纳米结构对细胞行为具有显著影响。我们预期该梯度纳米图案将有助于理解血液来源的hECFC或其他细胞与不同尺寸纳米结构之间的相互作用机制。

<table><tbody><tr><td>高氯酸 60%</td><td>Daejung Chemicals &amp; Metals</td><td>6512-4100</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，无水 99.9%</td><td>Daejung Chemicals &amp; Metals</td><td>4118-4100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸 85%</td><td>Daejung Chemicals &amp; Metals</td><td>6532-4400</td><td></td></tr><tr><td>甲醇 99.5%</td><td>Daejung Chemicals &amp; Metals</td><td>5558-4400</td><td></td></tr><tr><td>六价铬氧化物</td><td>Daejung Chemicals &amp; Metals</td><td>2558-4400</td><td></td></tr><tr><td>硫酸 95%</td><td>Daejung Chemicals &amp; Metals</td><td>7781-4100</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢 30%</td><td>Daejung Chemicals &amp; Metals</td><td>4104-4400</td><td></td></tr><tr><td>正己烷 95%</td><td>Daejung Chemicals &amp; Metals</td><td>4081-4400</td><td></td></tr><tr><td>甲苯 99.5%</td><td>Daejung Chemicals &amp; Metals</td><td>8541-4400</td><td></td></tr><tr><td>(庚基十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)二甲基氯硅烷</td><td>Gelest</td><td>SIH5840.4</td><td>对湿气敏感</td></tr><tr><td>甲氧基九氟丁烷 99%</td><td>Sigma aldrich</td><td>464309</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白溶液</td><td>Stemcell</td><td>#4902</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1890</td><td>蛋白包被溶液</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Heathcare</td><td>17-1440-03</td><td>亲水性多糖溶液</td></tr><tr><td>EGM-2MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>内皮细胞扩增培养基</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma aldrich</td><td>G5882-100ML</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Sigma aldrich</td><td>201030-1G</td><td></td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>辛基酚聚氧乙烯醚&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>抗人连环蛋白（vinculin）一抗&amp;nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>F-肌动蛋白探针</td><td>Molecular Probes</td><td>A12379</td><td>荧光标记鬼笔环肽</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记抗小鼠&amp;nbsp;IgG 抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>荧光标记二抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚&amp;nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>抗人血管性血友病因子（vWF）一抗&amp;nbsp;</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td></td></tr><tr><td>抗人&amp;nbsp;CD144 一抗&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>#555661</td><td></td></tr><tr><td>Eponate 12&amp;trade; 包埋试剂盒（含 BDMA）</td><td>Ted Pella</td><td>18012</td><td>环氧树脂</td></tr><tr><td>醋酸铀酰，25 g</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铅三水合物，10 g</td><td>Ted Pella</td><td>19312</td><td></td></tr><tr><td>超纯铝板</td><td>Goodfellow</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯片</td><td>Goodfellow</td><td>ST313120</td><td></td></tr><tr><td>8.0&quot; 硅晶圆</td><td>Siltron</td><td>29-01024-03</td><td>单面抛光，725 &amp;micro;m 厚</td></tr><tr><td>真空干燥器，4.4 L</td><td>Kartell</td><td>KA.230</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Vacuumer</td><td>V3.VOP100</td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>Unicorntech</td><td>UDP-3003</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Daihan scientific</td><td>SL.SMS03022</td><td></td></tr><tr><td>顶置式搅拌器</td><td>Daihan scientific</td><td>HT120DX</td><td></td></tr><tr><td>循环冷却器</td><td>Daihan scientific</td><td>WCR-P12</td><td></td></tr><tr><td>线性移动平台</td><td>Zaber</td><td>A-LSQ300A-E01-KT07</td><td></td></tr><tr><td>直角支架，90 度</td><td>Zaber</td><td>AB90M</td><td>线性移动平台配件</td></tr><tr><td>PMP 镊子，145 mm</td><td>Vitlab</td><td>67995</td><td>非金属镊子</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯烧杯，250 mL</td><td>Cowie</td><td>CW007.25</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr><tr><td>PCB 切割机</td><td>Hozan Tool Industrial</td><td>K-110</td><td></td></tr><tr><td>纳米压印设备</td><td>Nanonex</td><td>NX-2000</td><td></td></tr><tr><td>氧气等离子体发生器</td><td>Femto Science</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>低温灭菌器</td><td>Lowtem</td><td>Crystal 50</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JSM6701</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Hitachi</td><td>H-7500</td><td></td></tr></tbody></table>

利用热纳米压印技术制备梯度纳米图案及人内皮集落形成细胞响应的筛选

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

纳米形貌在体内各种细胞外基质（ECM）中普遍存在，并已知对细胞反应具有重要的调控作用。然而，由于缺乏合适的筛选工具，难以确定纳米结构尺寸与细胞响应之间的关系。本文展示了可重复且成本效益高的梯度纳米图案化培养板的开发，用于调控细胞反应。以阳极氧化铝（AAO）作为主模板，通过热压印技术制备了具有直径递增纳米柱的梯度纳米图案化培养板，其直径范围分别为[120–200&#8239;nm（GP 120/200）、200–280&#8239;nm（GP 200/280）和280–360&#8239;nm（GP 280/360）]。这些梯度纳米图案化培养板旨在模拟细胞外基质中不同尺度的纳米形貌，并用于筛选人内皮集落形成细胞（hECFCs）的响应。在本实验方案中，我们详细描述了用于细胞工程的梯度纳米图案化培养板的逐步制备流程、从人外周血中培养hECFCs的技术，以及在纳米图案化培养板上培养hECFCs的方法。

图1 显示了根据类型和位置制备的梯度AAO模具的扫描电镜（SEM）图像。图2 显示了具有规则圆顶纳米柱的梯度纳米图案化平板的扫描电镜图像，图3 为纳米柱直径的定量数据。表1 列出了所制备纳米柱的特征参数。
图 4A 显示了血液来源的人内皮集落形成细胞（hECFCs）的培养方案。 图4B 显示 培养的hECFCs的相差图像。 图 4C 显示用CD144（绿色）、vWF（红色）和细胞核（蓝色）...

本文介绍了一种通过热纳米压印技术制备梯度纳米图案化培养板，并筛选人内皮祖细胞对这些纳米结构响应的方法。利用所述技术，可制备出能够通过物理刺激调控细胞行为的支架材料。

纳米拓扑结构存在于体内多种细胞外基质（ECMs）中，已知其对细胞具有重要的调控作用……

该技术的主要优势在于能够以高重复性生成梯度图案，并可用于筛选细胞对寄生虫观察结构的响应。目前，细胞对物理刺激的响应尚未被完全揭示。我们相信，该方法将成为揭示这些未知机制的重要工具。首先，将装有电解抛光液的双层夹套烧杯连接至循环器，并将温度设定为7°C。持续搅拌溶液至少30分钟，直至温度降至7°C。使用鳄鱼夹和铜线将高纯铝片和碳对电极浸入电解抛光液中。调整铝板与碳对电极的相对位置，使其彼此正对。将铝板连接至直流电源的正极，将碳对电极连接至负极。施加20伏电压后，铝板表面由粗糙无光泽变为银色镜面状。进行初次阳极氧化时，将一升电解液倒入一个两升的双层夹套烧杯中。用铜线鳄鱼夹将抛光的铝板和碳对电极浸入溶液中。在U形底座上安装一根垂直轴。使用金属夹具安装顶置式搅拌器和叶轮。将叶轮的螺旋桨置于两个电极的下端附近。在搅拌条件下，将顶置式搅拌器的转速设定为200至300 rpm，并施加195伏电压，持续16小时。一次阳极氧化后，铝板的颜色由银色变为灰色。进行氧化铝蚀刻时，将阳极氧化后的铝板浸入蚀刻液中。用铝箔密封烧杯顶部，并持续搅拌至少10小时。在蚀刻步骤中，铝板的颜色从灰色变为白色。对于二次阳极氧化，设置与初次阳极氧化相同的实验条件，并再次施加195伏电压，持续六小时。二次阳极氧化完成后，铝板的颜色从白色恢复为灰色。为了进行梯度孔径扩大，首先将装有磷酸溶液的双层夹套烧杯连接至循环器，并将温度设定为30摄氏度。将线性移动平台垂直放置在烧杯旁，并将支架固定在直线平台的移动部分上。将线性平台的移动部分设置到原点位置。安装支架的夹子并装入阳极氧化铝板。手动调节铝板的位置，使其恰好位于溶液表面的正上方。以每秒4.86微米的速度将铝板缓慢浸入溶液中，持续120分钟，制备出尺寸梯度为120纳米至200纳米、长度为35毫米的AAO模板。当铝板接触溶液表面时，立即启动秒表。100分钟后，应有一半的AAO模具浸入溶液中。要制备GP 200至280和GP 280至360模具，需将GP 120至200模具的整个区域分别浸入扩孔溶液中2至4小时。使用非金属镊子将AAO模具浸入piranha溶液中30秒。用去离子水多次冲洗AAO模具。将模具在去离子水中浸泡30分钟，然后放入甲醇中浸泡另外30分钟。将AAO模具在真空条件下完全干燥三小时。进行自组装单分子层沉积时，将AAO模具浸入装有57毫升过滤己烷的100毫升烧杯中。然后向该己烷中加入3毫升HDFS储备液，配制成2.9毫摩尔的HDFS溶液，并静置10分钟以使反应进行。将AAO模具转移至新鲜的己烷中，然后将其浸泡在60毫升甲氧基九氟丁烷中。在烧杯中对AAO模具进行超声清洗，每次10秒，以去除物理吸附的HDFS分子。在真空条件下干燥AAO模具前，重复清洗步骤10次。使用印刷电路板切割器将一块1.1毫米厚的聚苯乙烯片切割成2.9毫米宽、3.7毫米长的尺寸。在洁净室中操作，用镊子从底部剪下35毫米的AAO模具。在背面标记样品名称和数据制造商。用少量乙醇清洁8.0英寸的晶圆，然后将聚苯乙烯片放置在晶圆上，并安装AAO模具。接着，将底膜放入热压印机的抽屉中，并将顶膜固定到垫圈上，然后将晶圆放在底膜上，再将垫圈放置在晶圆上。确保晶圆表面无灰尘。关闭热压机抽屉后，施加 165 摄氏度的温度和 620.5/2 千帕的压力，持续 100 秒。然后将样品冷却至室温。冷却后，释放腔室压力，压力将降至 0 千帕。轻轻扭转聚苯乙烯片以释放AAO模具。使用肝素抑制剂管采集50毫升人血。取6毫升亲水性多糖溶液置于15毫升离心管中，然后向该亲水性多糖溶液中加入8毫升血液。血液需要立即采集，并缓慢加至亲水性多糖溶液的上层。将试管在1020 ×g 条件下离心20分钟以沉淀细胞，收集不透明的细胞层，并转移至一个新的15毫升离心管中。加入含有10% FBS的10毫升PBS，于1020 ×g 离心10分钟以沉淀细胞。弃去上清液，加入红细胞裂解缓冲液。冰上孵育5分钟后，加入含10%胎牛血清（FBS）的PBS，于1020 × g离心5分钟以沉淀细胞。弃去上清液，加入1毫升内皮细胞扩增培养基，其中添加10% FBS。每孔接种八百万个细胞至各编码胶原的培养皿中。按照文本方案所述诱导人源及类胚胎集落形成细胞，并将细胞培养至第七代以用于后续实验。接着，用一毫升含百分之零点一蛋白包被液的 PBS 溶液在室温下对梯度纳米图案板进行包被，孵育十分钟。采用胰蛋白酶消化法，通过标准的细胞传代方法从培养皿中制备人ECFCs细胞悬液。将细胞悬液稀释至所需浓度后，将人ECFCs接种于梯度纳米图案化培养板及平整对照板中。将细胞置于培养箱中，在平整表面或梯度纳米图案化培养板上培养两天。这些图像显示了在三种不同扩孔条件下制备的 AAO 模具。在磷酸蚀刻液中浸渍时间最短的一侧，孔径最小；而在蚀刻液中处理时间最长的一侧，孔径最大。由于纳米图案通过热压印方法转移至聚苯乙烯表面，因此在聚苯乙烯表面形成了纳米柱结构，且 AAO 模具的尺寸梯度在纳米图案化板材中得以保留。汇合的人类ECFCs呈现出典型的铺路石样形态，形成易于在相差显微镜下辨别的细胞集落。将人类ECFCs在具有梯度纳米图案的平板上培养两天后，发现在GP 120至200的表面上培养的细胞出现明显的丝状伪足生长。相反，与平整对照组相比，在GP 200至280或GP 280至360的表面上培养的细胞未观察到显著变化。这一结果表明，细胞的反应会因表面纳米结构尺寸的不同而有所差异。制备纳米图案芯片包含多个步骤，因此起初可能较为复杂，但一旦掌握，您将能够轻松制备出具有理想尺寸梯度的图案。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备梯度纳米图案化培养板，并在纳米图案化培养板上培养人源及其他单细胞克隆形成细胞系。此外，该方法适用于多种类型的细胞系。该技术可在材料工程与生物技术之间架起桥梁，有助于理解细胞行为与表面纳米形貌之间的相互作用。

fabrication-gradient-nanopattern-thermal-nanoimprinting-technique

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

热 Nanoimprinting 技术制备梯度 Nanopattern 及其对人血管内皮细胞菌落形成的响应筛选

我们描述了一种用于微加工梯度生成微流控装置的方案，该装置可在定义明确的微环境中产生成分的空间和时间梯度。通过该方法，梯度生成微流控装置可用于研究细胞定向迁移、胚胎发育、伤口愈合以及癌症转移。...

一种用于细胞生物学的梯度生成微流控装置

本文首先描述了一种从人脐静脉中分离内皮细胞的实验步骤，然后展示了如何利用这些细胞在流动条件下研究中性粒细胞的跨内皮迁移。通过使用由具有玻璃光学特性的聚合物制成的低体积流动腔室，还可实现对稀有细胞群体的活细胞荧光成像。...

人脐静脉内皮细胞的分离及其在流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移研究中的应用

在本实验方案中，我们展示了利用毛细力光刻技术，采用两种不同的高分子材料制备仿生心脏细胞培养基质的方法。in vitro 和 in vivo...

毛细力光刻技术在心肌组织工程中的应用

本文描述了一种在显微镜腔室中构建黏附性梯度和可溶性梯度的方法，用于活细胞迁移研究。该人工构建的环境结合了抗污表面与黏附轨迹以及溶液梯度，从而可确定不同导向信号之间的相对重要性。...

创建黏附性与可溶性梯度以荧光显微镜成像细胞迁移

我们报道了通过掩模版印刷和光刻技术对纳米多孔金薄膜进行微图形化的方法，以及在微加工图案上培养细胞的技术。此外，我们还描述了利用扫描电子显微镜和荧光显微镜技术对材料及培养细胞的形态进行表征的图像分析方法。...

用于细胞-材料相互作用研究的纳米多孔金图案微加工

我们描述了一种在水相环境中改性支架表面细胞亲和力的方案。该方法利用二氧化钛的光催化作用，分解光照区域的有机薄膜。我们证明，该方法可用于在体外（ex situ）和原位（in...

使用 TiO2 光催化在水相环境中对蛋白质和细胞进行光图案化

本文介绍了一种简单的方法，可在含细胞的同心水凝胶上施加非连续梯度静态应变，以调控组织工程中的细胞取向。...

用于刺激载细胞水凝胶中细胞行为的梯度应变芯片

本文介绍了一种利用小型纳米图案化模具制备大面积纳米图案化基底的方案，用于研究纳米形貌对细胞行为的调控作用。...

利用拼接技术扩展纳米图案化基底以调控细胞行为的纳米形貌

化学梯度和氧气梯度的控制对于细胞培养至关重要。本文报道了一种聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯（PDMS-PC）微流控装置，能够稳定地生成用于细胞迁移研究的化学梯度与氧气梯度组合，且可在无需复杂仪器的生物实验室中实际应用。...

用于在垂直化学和氧气梯度下研究细胞迁移的聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯微流控装置

本文描述了制备用于高通量操控模拟物理与化学信号的多重人工细胞微环境（MACME）阵列的详细方法 体内...

构建多重人工细胞微环境阵列

我们介绍一种利用3D生物打印技术在标准六孔板上高通量制备具有可调尺寸和特定图案血管通道的实验方案，该技术被称为“孔板上的血管”（vessels-on-a-plate,...

高通量生物打印方法用于在标准六孔板中灵活构建具有可调尺寸与图案的血管通透性模型

了解热纳米压印技术制备梯度纳米图案的方法，用于筛选人血管内皮祖细胞对物理刺激的响应。该技术可高重复性地生产影响细胞行为的支架，为神经科学和再生医学研究提供重要工具。

利用热纳米压印技术制备梯度纳米图案及人内皮集落形成细胞响应的筛选

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