打印型聚糖芯片：一种用于分析小型动物循环中抗碳水化合物抗体谱的灵敏技术
2019年2月14日
本研究展示了印刷糖阵列（PGA）技术在分析小型动物体内循环抗碳水化合物抗体方面的潜力。
本实验方案的总体目标是利用打印式糖阵列技术，研究小动物血清中循环抗糖抗体的分布特征。该方法在某些抗体对抗糖结构起关键作用的病理状况下，具有实现早期诊断和正确治疗的潜力。该技术的主要优势在于，可在同一实验条件下，使用极少量样本，高灵敏度地同时检测数百种糖类靶标。
制备微阵列时，使用非接触式机器人点样仪。将50毫摩尔的糖类、10微克/毫升的多糖以及300毫摩尔的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 8.5）点样至经N-羟基-6-肉桂酰基衍生物修饰的玻片上，每种样品重复六次。每张玻片包含四个不同的子阵列区块，每个区块重复六次。
每个亚阵列均由112个不同的糖链点样组成，包括对照。将玻片置于湿盒中，在室温下孵育1小时。为封闭微阵列，将玻片在室温下用封闭缓冲液孵育1.5小时。
然后用超纯水清洗糖芯片，并用空气吹干。按照文本方案中的说明配制缓冲液一至缓冲液四。在准备糖芯片和样品时，将装有载片的储存盒置于实验台上，直至其达到室温。
打开盒子，将乙二醇芯片转移至孵育室中，孵育室应预先放置湿润的滤纸以维持室内湿度恒定。同时，在1.5毫升离心管中用缓冲液按1:1比例稀释小鼠血清。使用涡旋混合器将血清溶液混匀5秒。
匀浆后，将稀释的血清置于37摄氏度水浴中孵育10分钟，以避免免疫球蛋白聚集。然后在25摄氏度下以10,000 × g离心3分钟。收集上清液，弃去任何沉淀物。
将糖芯片小心放入孵育室中。加入一毫升缓冲液三，以去除糖芯片表面的任何残留物质，在25摄氏度下孵育15分钟。
将糖芯片垂直放置，用塑料巴斯德吸管滴加数滴缓冲液3重新清洗。然后，用滤纸小心吸去糖芯片表面的缓冲液。将糖芯片放回孵育室中。
使用微量移液器将稀释后的血清样本均匀覆盖在糖芯片表面。用移液器吸头确保糖芯片表面所有干燥区域均被稀释血清样本覆盖。在37°C条件下以旋转振荡方式孵育1.5小时。
孵育后，去除多余的样品，将糖芯片置于25摄氏度的缓冲液三中浸泡五分钟。将糖芯片转移至含有缓冲液四的容器中，最后用超纯水清洗糖芯片。在25摄氏度、175 × g 条件下离心糖芯片一分钟，以去除液体。
将糖芯片重新放入孵育室后，在糖芯片表面铺加生物素标记的羊抗小鼠抗体溶液。在37摄氏度下以轨道振荡方式孵育一小时。去除未结合组分，并重复洗涤步骤。
离心后，将糖芯片置于避光条件下，在25摄氏度下用缓冲液二中含相应荧光染料标记的链霉亲和素溶液（浓度为2微克/毫升）孵育45分钟。随后在避光条件下去除未结合组分，并重复洗涤步骤，然后将糖芯片空气干燥。扫描芯片前，将糖芯片置于暗处桌面上，待其恢复至室温后再进行扫描。
同时，打开切片扫描仪和激光器。手持微阵列，将糖芯片插入插槽，直至其接触后壁。运行 EasyScan 扫描糖芯片，并将扫描结果保存为 tif 文件。
使用 ScanArray 分析系统对芯片进行定量分析。在主窗口的“配置和文件”组中，单击“文件”以打开先前扫描的图像。加载对应芯片文件模板（GAL 格式），该模板表示打印在玻片上的糖链排布情况。
通过仔细将阵列与图像中的点对齐来调整GAL模板，并启动定量分析。选择“按定量类型运行简易定量”和“定量方法为固定圆圈”。取消勾选自动寻找点的所有选项，并选择LOWESS作为标准化方法。
将定量数据保存为 csv 文件。使用 Microsoft Excel 或其他适当的应用程序将这些数据导入常见的电子表格文件中。基因相同的小鼠不应被视为免疫学上的等同个体，因为它们已形成了不同的天然抗碳水化合物抗体模式。
如图所示，仅有12种聚糖特异性得以保留。此处展示的是使用荧光扫描仪对微芯片扫描后获得图像的代表性示例。随后将网格与每个子阵列中的点样位置对齐。
检测每个位点的荧光信号，并将结果导入一个通用的电子表格文件。在与小鼠血清孵育后，使用扫描阵列读取仪对糖芯片进行扫描。数据采用微阵列分析系统进行分析，结果以中位数加减中位数绝对偏差的相对荧光单位（RFU）表示。
蓝色和白色代表低于 4000 RFU 的背景结合信号。红色代表大于或等于 4000 RFU 的阳性结合信号。糖芯片上暴露的大多数糖结构未被 BALB/c 小鼠循环抗糖抗体组所识别。
一旦掌握，若操作得当，该技术可在五小时四十五分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何利用打印机糖阵列技术来研究血清样本中循环抗碳水化合物抗体的种类及其水平。在进行该实验时，需牢记糖芯片必须通过玻片底部进行操作。
条形码所在的位置，以避免接触印制的聚糖。同时，使用移液管枪头末端确保聚糖芯片的所有干燥区域均被稀释的血清样本覆盖。
完全覆盖一张糖芯片单一面所需的体积约为一毫升。按照此方法，还可进行其他实验，例如微球悬浮阵列法，以进一步回答与抗糖类抗体谱的灵活多重检测相关的问题。该技术自问世以来，为生物大分子和免疫学领域的研究人员探索小型动物体内的非蛋白质糖相互作用开辟了道路。
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概述
本研究展示了印刷糖阵列（PGA）技术在分析小型动物体内循环抗碳水化合物抗体方面的潜力。该方法能够利用极小的样本体积，对多种糖类靶标进行高灵敏度检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 生物技术
背景
- 循环抗糖抗体在多种病理状况中发挥重要作用。
- 了解这些抗体有助于实现早期诊断和适当治疗。
- 印刷糖阵列技术可同时分析大量糖结构。
- 该方法在小型动物模型中尤为适用。
研究目的
- 分析小型动物体内循环抗糖抗体的谱型。
- 探索PGA技术在诊断与糖抗体相关疾病中的潜力。
- 展示该方法在科研环境中的灵敏度与效率。
使用的方法
- 使用非接触式机器人点样仪制备微阵列。
- 将糖类和多糖以六个重复点样于玻片上。
- 在实验过程中使用 PBS 缓冲液以获得最佳条件。
- 利用打印的糖微阵列分析抗体应答。
主要结果
- 在检测糖链靶向抗体方面表现出高灵敏度。
- 能够同时分析数百种糖链靶标。
- 提供了对小型动物血清中抗体谱的深入见解。
- 突出了PGA技术在免疫学研究中的优势。
结论
- PGA 技术是研究抗糖类抗体的一种有前景的工具。
- 该方法有助于与糖类结构相关疾病的早期诊断。
- 进一步的研究可能会拓展其在多种生物医学领域的应用。
常见问题
行业重要性概述
印刷式聚糖芯片（PGA）技术能够利用极小体积的血清对循环中的抗碳水化合物抗体进行高灵敏度分析，解决了小动物模型研究中的一个关键限制。该技术通过将聚糖特异性的抗体库与病理状态相关联，支持免疫学和传染病研究中的早期生物标志物发现及机制层面的风险评估。该方法通过提供针对多种聚糖结构的体液免疫应答的定量、可重复的检测结果，增强了靶点验证中的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在基因相同模型中绘制天然抗聚糖抗体库，揭示个体免疫学差异，从而实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：利用极少样本输入，高灵敏度检测数百种聚糖靶标，支持生物学风险降低，保护珍贵的临床前样本。
- 预测价值：通过识别可能与疾病易感性或抗性相关的保守性和可变性聚糖特异性，促进候选药物组合的筛选。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：通过Lowess方法标准化并产生可重复的荧光信号（RFU），实现不同样本及实验条件间的可靠比较。
- 可扩展性：每张芯片包含四个含有六个重复的子阵列区块，可用于高通量筛选特异性识别糖链的抗体结合模式。
- 工作流程整合：以兼容电子表格分析的CSV格式输出定量数据，简化发现流程中的下游数据处理。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：将循环抗糖抗体谱与免疫状态关联，为小型动物模型中病理状况的早期检测提供潜在的生物标志物途径。
- 转化连续性：通过将糖抗体库与疾病发生及进展相关联，支持基于风险评估的推进决策，如本研究在人类疾病建模中的意义所述。
- 机制去风险化：通过提供直接的、特异于糖的抗体结合数据，而非从以蛋白质为中心的检测中推断功能，降低免疫机制研究中的不确定性。
流程与工作流整合
PGA 技术适用于早期发现阶段，可在免疫学领域先导化合物确定之前支持假设的生成，并通过与生物标志物匹配的免疫谱型分析结果为临床前验证提供依据。
- 发现生物学：通过揭示同基因型模型中个体特异性的抗糖类抗体模式，支持假设验证与通路阐明，凸显了假设免疫等效性的局限性。
- 筛选：通过标准化的芯片制备、封闭和孵育步骤实现检测就绪，确保糖类分子呈现的一致性及抗体检测的可重复性。
- 分析：生成带有中位绝对偏差的定量相对荧光单位（RFU）测量值，支持在不同糖类靶标和样本间进行抗体结合的统计学比较。
- 转化研究：通过识别可能反映疾病状态的糖类生物标志物，连接临床前研究的连续性，支持向人类免疫学研究的外推。
- 企业级复用：建立可重复使用的免疫谱型分析平台，使经过验证的糖类检测面板可应用于多种疾病模型和治疗领域。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低针对碳水化合物的体液免疫应答中的机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过重复打印、标准化定量和明确定义的信号阈值（例如，4000 RFU 作为阳性结合信号），确保实验的标准化与可重复性。
- 战略价值：通过实现对免疫生物标志物的早期检测，减少因未预期的免疫机制导致的后期失败风险，从而优化“推进/终止”决策。
- 组合影响：通过识别可能提示疾病进展差异或治疗反应差异的糖链特异性抗体特征，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备微阵列操作、荧光检测以及使用 ScanArray 和 EasyQuant 等工具进行数据归一化的专业技术。
- 依赖非接触式机器人点样仪、荧光扫描仪以及用于糖链打印和检测实施的缓冲液制备基础设施。
- 需要跨团队对样本稀释、孵育条件和洗涤步骤进行标准化，以尽量减少抗体结合读数中的变异。
- 在扩展至不同物种或样本类型时，需考虑适应性因素，特别是血清稀释倍数和封闭效率的优化。
- 存在若干实际限制，例如操作过程中需避免接触打印的糖链点样区域，以及孵育时需确保样本完全覆盖整个表面。
