Name: 应用 Fraumeni 综合征诱导多潜能干细胞建模骨肉瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 了解利用李-法美尼综合征患者成纤维细胞生成诱导多能干细胞并分化为成骨细胞的方法。该模型支持骨肉瘤发生机制研究、生物标志物鉴定和药物筛选，为癌症生物学和再生医学研究提供重要平台。

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R. Z. 由德克萨斯大学健康科学中心癌症预防研究培训项目博士前奖学金（德克萨斯州癌症预防与研究所资助项目 RP160015）提供支持。J.T. 由中山大学附属第一医院启林计划提供支持。D.-F.L. 是癌症研究CPRIT学者，获得美国国立卫生研究院独立研究职业发展奖 R00 CA181496 及 CPRIT 资助项目 RR160019 的支持。

本研究已获得休斯顿德克萨斯大学健康科学中心（UTHealth）动物福利委员会批准。实验严格遵循UTHealth实验动物医学中心制定的标准进行。 &amp;#38; 护理（CLAMC），该机构已获得美国实验动物护理协会（AAALAC International）认证。本研究中的人类受试者属于情景A（&#34;不涉及人类受试者研究&#34;根据NIH SF424文件的定义，因此无需获得德克萨斯大学健康科学中心（UTHealth）人类研究伦理委员会的批准。
1. LFS 诱导多能干细胞的生成（图1A）
<ol>
	<li>第 -2 天，将 2 × 104 个 LFS 患者成纤维细胞接种至 6 孔板的 1 个孔中，使用成纤维细胞培养基（表 1）在 37 °C、5% CO2 恒湿培养箱中培养。确保成纤维细胞在转导当天（第 0 天）达到 50–60% 的融合度。</li>
	<li>第 0 天进行仙台病毒转导。操作时，将旧培养基更换为预热的成纤维细胞培养基。将商用仙台病毒重编程试剂盒（见材料表）置于冰上解冻。根据生产商说明书，用混合的仙台病毒感染 LFS 成纤维细胞。</li>
	<li>转导细胞在成纤维细胞培养基中的维持（第 1–6 天）：
	<ol>
		<li>转导后第 1 天（即转导后 24 小时），移除含有残余仙台病毒的成纤维细胞培养基，并更换为 2 mL 新鲜的成纤维细胞培养基。将转导后的成纤维细胞在 37 °C、5% CO2 恒湿培养箱中继续培养。</li>
		<li>从第 2 天至第 6 天，每隔一天更换一次成纤维细胞培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转导细胞在饲养层培养条件下的维持（第 7–28 天）：
	<ol>
		<li>第 6 天准备经辐照处理的 CF1 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养皿。操作时，在室温下向 6 个 100 mm 组织培养皿中各加入 5 mL 0.1% 明胶，孵育 30 分钟。包被完成后吸除 0.1% 明胶。</li>
		<li>从液氮容器中取出 MEF 细胞，按照生产商说明书使用商用解冻系统解冻 MEF 细胞。将细胞以约 6.7 × 105 个细胞/100 mm 培养皿的接种密度接种至明胶包被的培养皿中，使用 MEF/MSC 培养基（表 1）进行培养。</li>
		<li>将转导细胞接种至 MEF 培养皿中（第 7 天）：使用每 100 mm 培养皿 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 在室温下消化 2–4 分钟。用 9 mL 成纤维细胞培养基中和胰蛋白酶。将细胞转移至锥形管中，在 37 °C 下以 230 × g 离心 4 分钟。将转导的成纤维细胞接种至第 6 天准备好的 6 个 MEF 培养皿中，每皿加入 8 mL 成纤维细胞培养基进行培养。 
		注：在接种转导细胞前，MEF 的融合度约为 20%。</li>
		<li>第 8 天，弃去成纤维细胞培养基，更换为 hESC 培养基（表 1）。</li>
		<li>第 9–28 天观察 iPS 克隆的出现（图 1C）。每隔一天更换一次用过的 hESC 培养基，并在显微镜下监测 iPS 克隆的形成。待 iPS 克隆生长至肉眼可见大小后，转入无饲养层培养条件下进行扩增。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>出现的 iPS 克隆在无饲养层培养条件下的扩增（第 29–79~99 天）：
	<ol>
		<li>准备基质包被板：向 48 孔板的每孔中加入 120 µL 基底膜基质包被液（表 1）。确保包被液覆盖孔底并均匀包被培养表面。室温孵育 1 小时。使用前立即吸除包被液，并向每孔中加入含 2 µM ROCK 抑制剂 Thiazovivin 的 250 µL hESC 培养基。</li>
		<li>第 28 天，吸除用过的 hESC 培养基，用 1× DPBS 清洗 iPS 克隆。用 1 mL 移液枪头挑取可见的 iPS 克隆，转移至已处理的 48 孔板的 1 个孔中（见步骤 1.4.1）。每孔接种一个克隆。</li>
		<li>以 230 × g 离心 4 分钟，以促进细胞贴壁。将 iPS 克隆在 37 °C、5% CO2 恒湿培养箱中继续培养。</li>
		<li>次日（第 29 天），移除用过的 hESC 培养基，向每孔中加入 250 µL 商用 iPSC 培养基。</li>
		<li>将 iPS 克隆在 37 °C、5% CO2 恒湿培养箱中维持培养，并每隔一天更换一次 iPSC 培养基。</li>
		<li>当 iPS 克隆达到 85% 融合度时，按 1:10 的面积比例进行传代。加入 60 µL 商用传代溶液使细胞脱落，37 °C 孵育 3 分钟。</li>
		<li>将一半脱落的 iPSC 接种至基底膜基质包被的 12 孔板中，每孔加入含 2 µM ROCK 抑制剂 Thiazovivin 的 1 mL hESC 培养基。在 12 孔板中每孔加入 1 mL 商用 iPSC 培养基培养 iPS 克隆，并以 1:10 的比例传代，直至达到第 10 代。 
		注：iPSC 每 5–7 天以 1:10 的比例传代一次。iPS 克隆达到第 10 代最多需要 10 周时间。在确认 iPSC 中仙台病毒已清除后（通常在约第 10 代后可证实），可进行 iPSC 的表征分析，包括细胞形态、碱性磷酸酶（AP）活性以及多能性因子和 hESC 标志物的表达（图 1B-E）。iPSC 表征所用抗体和引物信息见 表 2 和 表 4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. LFS 诱导多能干细胞向间充质干细胞（MSCs）的分化（图 2A）
<ol>
	<li>将iPSC克隆在MEF培养板上培养至少2周（第~ -14至0天）：按照先前所述方法准备MEF培养皿（100 mm组织培养皿）（1.3.1 - 1.3.2）。使用hESC培养基维持iPSC，并每隔一天更换一次培养基。当iPSC达到90%融合度时，以1:10比例传代培养iPSC。</li>
	<li>从iPSC中去除MEF（第0天）：
	<ol>
		<li>在MEF上维持iPSC培养2周后，将iPSC继续培养于100 mm组织培养皿中，直至细胞达到80 - 90%融合度。吸除用过的hESC培养基，并用5 mL的1×DPBS洗涤iPSC。加入1 mL细胞解离溶液以解离细胞，在室温下孵育3分钟。</li>
		<li>向培养皿中加入9 mL MEF/MSC培养基以中和细胞解离溶液的活性，并将解离的细胞转移至一个新的未包被的100 mm组织培养皿中。</li>
		<li>在室温下孵育细胞30分钟，使MEF贴附于培养皿表面。</li>
		<li>小心收集含有未贴附iPSC的上清液，并在4 °C下以230 × g离心4分钟。 
		注意：粗暴冲洗培养皿底部会导致MEF脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>iPSC向MSC的分化（第0 - 28天）：
	<ol>
		<li>在室温下用每孔1 mL的0.1%明胶包被6孔板中的三个孔，孵育30分钟。</li>
		<li>去除步骤2.2.4中收集的iPSC的上清液。</li>
		<li>将iPSC重悬于6 mL MSC分化培养基（表1）中，并将细胞接种至三个已包被的孔中，每孔2 mL（第0天）。</li>
		<li>每隔两天更换一次MSC分化培养基，以去除未贴附和/或死亡的细胞（第1 - 28天）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>iPSC来源MSC的成熟（第28 - 45天）：
	<ol>
		<li>去除用过的MSC分化培养基，并用1 mL的1×DPBS洗涤细胞。</li>
		<li>每孔加入0.5 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，在室温下消化3分钟。</li>
		<li>用1.5 mL MEF/MSC培养基中和胰蛋白酶活性，将三个孔中的MSC收集至一个15 mL锥形管中，在4 °C下以230 × g离心4分钟。</li>
		<li>去除上清液，将MSC重悬于3 mL MEF/MSC培养基中，并接种至一个60 mm的0.1%明胶包被培养皿中（第28天）。</li>
		<li>在MEF/MSC培养基中培养MSC，每隔两天更换一次培养基。当细胞达到100%融合度时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA以1:3比例传代培养MSC。 
		注意：MSC呈现成纤维细胞样形态（图2B）。当MSC高密度生长时，拉长的MSC可形成漩涡状排列（图2B）。</li>
		<li>通过免疫荧光染色检测iPSC来源MSC的表面标志物CD44、CD73、CD105和CD166，以评估其特性（图2C）。 
		注意：抗体稀释比例见表2。活细胞免疫荧光染色操作按照试剂生产商说明书进行。</li>
		<li>确认后，将MSC以1:3比例扩增至100 mm组织培养皿中。使用含10% DMSO和90% FBS的冻存液冻存细胞（每100 mm组织培养皿冻存3管）。 
		注意：为富集MSC群体，可通过流式细胞术根据CD105+、CD24-标准对MSC进行分选9,17。采用基于PDGF-AB的方法分化的iPSC来源MSC通常可在培养中维持2 - 3&#160;个月而不丧失MSC特性9。应在确认MSC特性后，尽早冻存低代次的MSC。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. LFS间充质干细胞向成骨细胞的分化（图3A）
<ol>
	<li>成骨分化前间充质干细胞（MSCs）的准备（第 -1 天）
	<ol>
		<li>为确保有足够数量的细胞完成成骨分化实验，需从培养至95%融合度的100 mm组织培养皿中的MSCs开始。移除用过的培养基，并用5 mL的1×DPBS洗涤MSCs。</li>
		<li>在室温下，每100 mm培养皿使用1 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化3分钟。为避免过度消化，在显微镜下观察到约50%细胞脱落时即终止消化过程。</li>
		<li>加入9 mL MEF/MSC培养基以中和胰蛋白酶活性，并将3个培养皿中的MSCs收集至一个15 mL圆底离心管中。在4 °C下以230 × g离心4分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将MSCs重悬于5 mL MSC培养基中，并用血细胞计数板计数细胞数量。</li>
		<li>将适量数量的MSCs接种至培养板。 
		注：12孔板、6孔板和100 mm组织培养皿所需的细胞数量详见表3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用成骨细胞分化培养基（ODM）（表1）诱导成骨分化（第0–24天）：
	<ol>
		<li>吸除MEF/MSC培养基，更换为适量体积的ODM（12孔板每孔1 mL、6孔板每孔2 mL、100 mm培养皿每皿8 mL），以诱导MSCs向成骨细胞分化（第0天）。</li>
		<li>在成骨分化过程中，每隔两天吸除用过的ODM，并更换为新鲜的适量体积ODM。</li>
		<li>分别在第3、6、9、12、15、18、21和24天进行碱性磷酸酶（AP）染色和茜素红S（ARS）染色，以检测前成骨细胞产生的骨相关碱性磷酸酶和成熟成骨细胞产生的钙盐沉积（图3B）。 
		注：AP染色和ARS染色使用市售试剂盒，并按照制造商说明书操作。</li>
		<li>通过qRT-PCR检测前成骨细胞和成熟成骨细胞标志物的表达水平（前成骨细胞标志物为ALPL和COL1A1；成熟成骨细胞标志物为PTH1R和BGLAP）（图3C）。 
		注：成骨分化第9天后可预期出现阳性AP染色，第21天后可预期出现阳性ARS染色。在MEF/MSC培养基中培养的MSCs可作为AP染色和ARS染色的阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于研究的异种移植模型 体内 LFS间充质干细胞来源的成骨细胞的肿瘤发生（图 4A)
<ol>
	<li>LFS间充质干细胞向成骨细胞的分化：
	<ol>
		<li>种子 3 - 4.5 × 105 100 mm 组织培养皿中的 MSCs。每进行一次皮下注射需准备五个培养皿。</li>
		<li>在ODM中培养MSCs，使其向成骨细胞分化，具体步骤如3.2所述，持续至第14天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于皮下注射的分化成骨细胞：
	<ol>
		<li>制备成骨细胞脱离溶液（表1)，将1 g II型胶原酶溶解于1,000 mL αMEM培养基中，配制胶原酶II溶液（1 mg/mL）。将胶原酶II溶液保存于-20 °C。按1:1比例混合0.25%胰蛋白酶-EDTA与胶原酶II溶液，制备成成骨细胞消化液。</li>
		<li>吸除用过的成骨分化培养基，用 5 mL 1x DPBS 洗涤分化后的成骨细胞，每 100 mm 培养皿洗一次。</li>
		<li>每100 mm培养皿中加入1.5 mL成骨细胞解离液，于37 °C孵育30 min。在显微镜下观察并确认成骨细胞已解离。</li>
		<li>用ODM中和成骨细胞脱附液，收集脱附的成骨细胞至50 mL锥形管中。在4 °C条件下以230 × g离心5分钟。</li>
		<li>移除上清液，并将细胞重悬于25 mL ODM培养基中。使用70 µm细胞滤网过滤细胞，以去除聚集的细胞。使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。</li>
		<li>制备 1 × 107 每次皮下注射的成骨细胞数量，以及在 4 °C 下以 230 x g 离心 4 分钟。</li>
		<li>重悬细胞至 1 × 107 将成骨细胞置于50 µL冰上预冷的1×DPBS中。将已分化的成骨细胞与50 µL无酚红基底膜基质混合（成骨细胞悬液与基底膜基质按1:1比例混合），并在注射前保持成骨细胞处于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体内 LFS间充质干细胞来源的成骨细胞异种移植肿瘤模型
	<ol>
		<li>将8周龄雌性免疫缺陷NU/NU小鼠置于麻醉舱内，通过CLAMC提供的氧气（流速1 L/min）输送5%（v/v）吸入用异氟烷进行麻醉。当小鼠倒伏后，将麻醉系统切换至鼻罩，通过CLAMC提供的氧气（流速200 mL/min）输送2%（v/v）吸入用异氟烷。通过检测角膜反射和足底反射监测麻醉深度，确保小鼠已充分麻醉，并在操作过程中无不适反应。</li>
		<li>用氯己定和70%异丙醇交替擦拭注射部位进行消毒。使用26 G针头将基底膜基质混合的LFS成骨细胞皮下注射至8周龄免疫缺陷NU/NU小鼠后肢一侧图 4A).</li>
		<li>通过每周对注射部位进行触诊，监测小鼠皮下结节样密度物的生长情况。注射后约6-10周可观察到肿瘤形成。图4B).</li>
		<li>采用二氧化碳窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。解剖取出已形成的肿瘤。通过多种染色方法确定肿瘤分级、分化指数、前成骨细胞和成熟成骨细胞例如 苏木精和伊红（H&amp;#38;E) 染色、苦味酸天狼星红染色和冯科萨染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Yagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+familial+Alzheimer%27s+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells.</a> Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).</li>
<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Lee, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+familial+cancer+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 161 (2), 240-254 (2015).</li>
<li>Mulero-Navarro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Dysregulation+in+a+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Model+of+PTPN11-Associated+Juvenile+Myelomonocytic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia.</a> Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).</li>
<li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li>
<li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Map+the+Progression+of+Myeloid+Transformation+to+Transplantable+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).</li>
<li>Crespo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+colorectal+cancer+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.</a> Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).</li>
<li>Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Cancer+with+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells.</a> Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).</li>
<li>Lin, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+Molecular+Pathogenesis+and+iPSC+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling.</a> Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Li-Fraumeni+Syndrome+Disease+Model%3A+A+Platform+to+Develop+Precision+Cancer+Therapy+Targeting+Oncogenic+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).</li>
<li>Lian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+clinically+compliant+MSCs+from+CD105%2B%2C+CD24-+differentiated+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs.</a> Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homozygous+p53+R282W+mutant+human+embryonic+stem+cell+line+generated+using+TALEN-mediated+precise+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing.</a> Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了实现更高的间充质干细胞（MSC）分化效率，以下几个方面至关重要。其一是启动MSC分化前诱导多能干细胞（iPSCs）的培养条件。本文所述方案基于先前的研究9,17。iPSCs需要在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养至少2周。将iPSCs在MEFs上维持于良好状态，对于其在明胶包被培养板上的贴附以进行MSC分化至关重要。另一个重要方面是分化前iPSCs在MEFs上的密度。建议在iPSCs融合度达到80–90%时启动MSC分化。iPSCs过度生长会损害其在分化过程中的细胞存活率。最后一个关键点是启动MSC分化时的接种密度。根据我们的经验，较高的细胞密度有助于iPSCs在明胶包被培养板上的贴附。一个100 mm培养皿的iPSCs可接种至6孔板中的三个孔。若直接将iPSCs重悬并接种于MSC分化培养基中，会对iPSCs造成较大应激，因而偶尔会导致接种后严重的细胞死亡。较高的iPSCs密度可提高MSC分化的成功率。
与间充质干细胞的分化不同，成骨分化过程更为直接。为了获得...

2006年至2007年间，山中伸弥（Shinya Yamanaka）博士和詹姆斯·A·汤姆森（James A. Thomson）博士的实验室取得了一系列突破性发现，从而推动了诱导性多能干细胞（iPSCs）的诞生1,2,3。通过使用特定的转录因子对体细胞进行重编程以生成iPSCs，研究人员成功获得了具有关键特性的细胞，即多能性和自我更新能力——这些特性此前被认为仅存在于人胚胎干细胞（hESCs）中。iPSCs可来源于任何个体或患者，且无需从胚胎中获取，极大地拓展了可用于研究的疾病种类和遗传背景。自那时起，源自患者的iPSCs已被用于重现多种人类疾病的表型，包括阿尔茨海默病4、肌萎缩侧索硬化症5以及长QT综合征6,7,8。
iPSC 研究的这些进展也为癌症研究开辟了新的途径。最近，多个研究团队已利用患者的 iPSC 构建了在易感遗传背景下癌症发展的模型9,10,11，迄今已在骨肉瘤9、白血病10,11,12 和结直肠癌13 中成功应用。尽管 iPSC 衍生的癌症模型仍处于初级阶段，但已显示出在模拟疾病相关恶性肿瘤、阐明病理机制以及鉴定治疗化合物方面具有巨大潜力14。
Li-Fraumeni综合征（LFS）是一种由TP53生殖系突变引起的常染色体显性遗传性癌症疾病15。LFS患者易患多种恶性肿瘤，包括骨肉瘤，这使得LFS诱导多能干细胞（iPSCs）及其分化细胞特别适用于研究此类恶性肿瘤16。2015年，研究人员首次利用LFS患者来源的iPSCs建立了基于iPSC的骨肉瘤模型9，这些iPSCs被逐步分化为间充质干细胞（MSCs），进而分化为成骨细胞——即骨肉瘤的起源细胞。这些LFS来源的成骨细胞重现了与骨肉瘤相关的成骨分化缺陷和致癌特性，表明该模型具有作为“培养皿中的骨肿瘤”研究平台的潜力&#34;&#34;。有趣的是，全基因组转录组分析揭示了LFS成骨细胞中存在骨肉瘤基因特征的部分表现，且该LFS基因表达谱的特征与骨肉瘤患者的不良预后相关9，提示LFS iPSC疾病模型在揭示具有临床相关性特征方面的潜力。
本论文详细描述了如何利用LFS患者来源的iPSCs建立骨肉瘤模型。内容包括LFS iPSCs的建立、iPSCs向MSCs的分化以及进一步向成骨细胞的分化，以及使用该体系进行的相关研究。 体内 使用LFS成骨细胞的异种移植模型。该LFS疾病模型具有多项优势，最显著的是能够在骨肉瘤发育的各个阶段产生无限量的细胞，用于机制研究、生物标志物鉴定和药物筛选9,14,16.
综上所述，基于LFS诱导多能干细胞的骨肉瘤模型为推进骨肉瘤研究提供了一个有吸引力的补充体系。该平台还为利用患者来源的诱导多能干细胞进行癌症建模提供了概念验证。下文所述策略可轻松扩展应用于其他具有癌症易感性的遗传性疾病相关恶性肿瘤的建模。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;塑料器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430107</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管，聚丙烯材质</td><td>SARSTEDT</td><td>62.547.100</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管，聚丙烯材质</td><td>SARSTEDT</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养材料与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoTune- iPS 2.0 Sendai 重编程试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>商用 Sendai 病毒重编程试剂盒</td></tr><tr><td>Corning hESC-合格基质</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>CF1 MEFs，经辐照处理</td><td>ThermoFisher</td><td>A34180</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Corning</td><td>10-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS iPS-Brew XF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-368</td><td>商用诱导多能干细胞培养基</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>12660012</td><td></td></tr><tr><td>FBS Opti-Gold</td><td>GenDEPOT</td><td>F0900-050</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>ThermoFisher</td><td>A3181502</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>重组人血小板源性生长因子-AB</td><td>PEPROTECH</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4902</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液，1×（DPBS）</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS 传代溶液 XF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-688</td><td>商用传代溶液</td></tr><tr><td>Accutase 细胞解离溶液</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>噻唑紫精（ROCK 抑制剂）</td><td>Calbiochem</td><td>420220</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>人 NANOG 抗体</td><td>R&amp;D System</td><td>AF1997</td><td></td></tr><tr><td>OCT4 抗体（H-134）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9081</td><td></td></tr><tr><td>人/小鼠 SSEA-4 PE 标记抗体</td><td>R&amp;D System</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 小鼠抗人 TRA-1-81 抗原抗体</td><td>DB Biosciences</td><td>560123</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-545-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记小鼠抗人 CD105 抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-1057-42</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记小鼠抗人 CD44 抗体</td><td>DB Biosciences</td><td>555478</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记小鼠抗人 CD73 抗体</td><td>DB Biosciences</td><td>550257</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记小鼠抗人 CD166 抗体</td><td>DB Biosciences</td><td>560903</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记小鼠抗人 CD24 抗体</td><td>DB Biosciences</td><td>555427</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶染色试剂盒 II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>茜素红 S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>ThermoFisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>ThermoFisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，无水，分子生物学级</td><td>ThermoFisher</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>DNase I，无 RNase（1 U/&amp;micro;L）</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>BioRad</td><td>1708891BUN</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708884</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质高浓度（HC），无酚红</td><td>Corning</td><td>354262</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 滑动接头注射器，26 号针头 × 5/8 英寸</td><td>DB Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr></tbody></table>

利用li-fraumeni综合征患者来源的诱导性多能干细胞建立骨肉瘤模型

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni综合征（LFS）是一种常染色体显性遗传性肿瘤综合征。LFS患者易患多种类型的肿瘤，包括骨肉瘤——儿童和青少年中最常见的原发性非血液系统恶性肿瘤之一。因此，LFS为研究该恶性肿瘤提供了理想的模型。利用诱导性多能干细胞（iPSC）技术，可通过将LFS患者的iPSC分化为间充质干细胞（MSCs），再进一步分化为成骨细胞——即骨肉瘤的起源细胞，从而成功构建与LFS相关的骨肉瘤疾病模型。这些来自LFS的成骨细胞重现了骨肉瘤的致瘤特性，为解析骨肉瘤的发病机制提供了一个极具吸引力的模型系统。本文展示了一种从LFS患者成纤维细胞生成iPSC、将iPSC分化为MSC、MSC分化为成骨细胞的实验方案，以及 体内 利用LFS成骨细胞研究肿瘤发生。该iPSC疾病模型可进一步用于鉴定LFS相关骨肉瘤的潜在生物标志物或治疗靶点。

本方案包含LFS iPSC的生成、MSC分化、成骨细胞分化等步骤 体内 使用LFS间充质干细胞来源的成骨细胞进行肿瘤发生检测。
使用市售仙台病毒重编程试剂盒将成纤维细胞重编程为LFS诱导性多能干细胞（iPSCs）的流程示意图见图1A。基于仙台病毒递送山中四因子的方法是一种非整合型重编程技术。因此，稳定的LFS iPSC克隆应不含有仙台病毒基因组，并且外源性OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转基因应已丢失，可通过使用特异性引物进行RT-PCR检测来验证（图1B）。根据生产商说明书建议，获得无仙台病毒的iPSC依赖于培养条件和传代次数。在本实验方案所述的培养条件下，通常在传代10次后即可检测到iPSC中仙台病毒的清除（图1B）。所建立的LFS iPSC克隆...

本文介绍了一种从李-佛美尼综合征（Li-Fraumeni Syndrome, LFS）患者来源的成纤维细胞诱导生成诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），通过间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）将iPSCs分化为成骨细胞，并建立疾病模型的方法 体内 使用LFS患者来源的成骨细胞研究肿瘤发生。

利用Li-Fraumeni综合征患者来源的诱导性多能干细胞建立骨肉瘤模型

Li-Fraumeni综合征（LFS）是一种常染色体显性遗传性癌症疾病。LFS患者易患多种类型的肿瘤，包括……

这种基于Li-Fraumeni综合征诱导性多能干细胞（iPSC）的骨肉瘤模型有助于回答骨肉瘤研究领域中关于利用患者来源的iP细胞进行癌症建模的关键问题。该模型的主要优势在于，它能够无限量地生成骨肉瘤发育各个阶段的细胞，用于机制研究、生物标志物鉴定以及药物筛选。Ruoji将演示细胞培养步骤，而我将演示动物实验操作。经过两周的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）共培养后，用5毫升DPBS洗涤80%至90%融合的iPS细胞培养物，随后向细胞中加入1毫升细胞解离溶液，在室温下孵育3分钟。为使iPS细胞能够贴附于明胶包被的培养板并分化为间充质干细胞，至关重要的是需在MEF上维持iPS细胞良好生长状态至少14天。当细胞从培养板底部脱落时，向其中加入9毫升MEF/MSC培养基以中和细胞解离溶液，并将细胞悬液转移至未包被的100毫米组织培养皿中。将细胞在室温下孵育30分钟，使MEF细胞贴壁，然后小心收集含有未贴壁iPS细胞的上清液。离心iPS细胞悬液，并将沉淀重悬于6 mL MSE分化培养基中。随后，将2 mL细胞悬液分别接种至六孔培养板中三个经0.1%明胶包被的孔中，将培养板放入细胞培养箱中培养28天，每隔两天更换新鲜培养基，以去除未贴壁或死亡的细胞。第28天可见大量已分化细胞团块，细胞簇边缘可观察到成纤维细胞样间充质干细胞。每孔使用1毫升DPBS洗涤细胞培养物，随后在室温下每孔加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化。3分钟后，每孔加入1.5毫升MEF/MSE培养基以中和胰蛋白酶，并将消化下来的MSE细胞收集至一个15毫升锥形管中，进行离心。将沉淀重悬于3 mL MEF/MSE培养基中，接种至经0.1%明胶包被的60 mm培养皿中，每两天更换一次培养基，直至细胞达到100%汇合度。以1:3比例传代100%汇合的细胞后，间充质干细胞（MSCs）将快速增殖，呈现成纤维细胞样形态，并在高密度培养时形成漩涡状的细胞排列模式。在分化过程中的任意时间点，均可通过免疫荧光染色检测诱导多能干细胞（iPS细胞）来源的MSCs中是否存在间充质干细胞标志物。将95%融合的细胞培养物中适量数量的MSE接种至细胞培养板中，加入适量体积的MEF/MSC培养基，培养24小时，以诱导MSE向成骨细胞分化。从次日开始，每隔两天用适量体积的成骨分化培养基替换上清液，直至培养期结束。为检测前成骨细胞产生的骨相关性碱性磷酸酶以及成熟成骨细胞产生的矿化沉积，应在适当的实验时间点分别按照试剂盒说明书进行碱性磷酸酶染色和茜素红S染色。为了建立体内肿瘤发生模型，将适量的间充质干细胞接种到五个100毫米培养皿中，以启动成骨细胞分化。在成骨细胞分化的第14天，用5毫升DPBS洗涤五块培养板上的成骨细胞，并每皿加入1.5毫升成骨细胞解离液处理细胞。在37摄氏度孵育30分钟后，通过光学显微镜确认细胞是否解离，并用新鲜的成骨细胞分化培养基中和解离液。将细胞收集至一个50毫升的锥形管中进行离心，并将沉淀重悬于25毫升新鲜的成骨细胞分化培养基中。使用70微米细胞筛过滤细胞悬液，以去除任何聚集的细胞，然后在计数前预留每剂皮下注射所需的1 × 10⁷个细胞。通过离心收集细胞沉淀，并将细胞重悬于50微升冰冻的DPBS中，调整浓度为每50微升含1 × 10⁷个成骨细胞。将成骨细胞与等体积的酚红-free基底膜基质混合，并将细胞置于冰上直至注射。在确认一只八周龄雌性免疫缺陷裸鼠对脚趾夹捏无反应后，将细胞吸入一支配有27号针头的1毫升注射器中，并将100微升细胞悬液皮下注射至动物已消毒的侧腹部。随后每周在注射部位通过触诊监测小鼠，观察皮下结节样密度物的生长情况。注射后应在六到十周内观察到肿瘤形成。已建立的LFS诱导多能干细胞克隆应呈现典型的人胚胎干细胞形态，并表现出碱性磷酸酶活性阳性。LFS诱导多能干细胞还高水平表达多能性因子mRNA，其表达水平与人胚胎干细胞系相当，远高于亲代成纤维细胞中的水平。通过免疫荧光染色检测，成功分化的LFS间充质干细胞也表达典型的间充质干细胞标志物，包括CD44、CD73、CD105和CD166。当间充质干细胞接受成骨分化信号后，分化细胞在第9天开始表现出碱性磷酸酶活性阳性，并在第21天出现矿物质沉积。在分化过程中，成骨细胞还显示出前成骨细胞和成熟成骨细胞基因的表达上调。成骨细胞注射后6至10周，LFS成骨细胞来源的肿瘤表现出未成熟成骨细胞的特征，包括碱性磷酸酶活性阳性、胶原基质沉积阳性以及矿化阴性。观看本视频后，您应能够充分理解如何将Li-Fraumeni综合征诱导性多能干细胞（iPS细胞）分化为成骨细胞，并利用患者来源的成骨细胞构建体内骨肉瘤模型。除骨肉瘤外，该基于Li-Fraumeni综合征iPS细胞的疾病模型还可应用于其他与Li-Fraumeni综合征相关的恶性肿瘤，如软组织肉瘤、乳腺癌和脑肿瘤。

modeling-osteosarcoma-using-li-fraumeni-syndrome-patient-derived

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

应用 Fraumeni 综合征诱导多潜能干细胞建模骨肉瘤

最近研究发现，骨肉瘤中的肿瘤干细胞（CSCs）与其发病机制相关。本文介绍了从常规骨肉瘤（OS）患者活检组织获得的原代细胞培养物中分离CSCs的方法，该方法基于CSCs在非黏附条件下生长的能力。...

建立人传统型骨肉瘤的肿瘤干细胞培养

直接注射癌源性细胞外囊泡（EVs）可导致骨髓重编程，从而促进肿瘤进展；然而，介导这一效应的具体细胞类型尚不明确。本文中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，用于研究EV介导的肿瘤-间充质干细胞（MSC）相互作用。...

一种用于定义肿瘤细胞与间充质干细胞间由细胞外囊泡介导通讯的骨肉瘤小鼠临床前模型

我们描述了一种通过荧光激活细胞分选法从人源异种移植性肉瘤组织中分离肿瘤起始细胞的详细方案，该方法以人白细胞抗原-1（HLA-1）作为阴性标记物，并进一步对这些HLA-1阴性的肿瘤起始细胞进行验证和表征。...

从肉瘤患者来源的异种移植瘤中分离与表征肿瘤起始细胞

骨细胞外基质（BEM）骨肉瘤（OS）模型已得到充分建立，如图所示。该模型可作为模拟原发性肿瘤生长的合适支架 体外...

三维骨细胞外基质骨肉瘤模型

本方案描述了一种可重复的小鼠横纹肌肉瘤原代细胞分离、肿瘤球形成与处理以及异体移植的方法，起始于肿瘤球培养物。...

从小鼠横纹肌肉瘤原代肿瘤细胞中分离肿瘤球并进行处理

骨转移模型的转移发生并不均匀，且发生率并非100%。直接骨内注射肿瘤细胞可能导致肺栓塞。我们提出一种通过将实体瘤移植物植入骨骼来模拟原发性骨肿瘤和骨转移的技术，该方法可实现可重复的移植物植入与肿瘤生长。...

利用实体瘤移植物骨内植入建立原发性骨肿瘤与骨转移模型

本文描述了一种同基因型原位移植后行截肢手术的小鼠骨肉瘤伴自发性肺转移模型，可用于转移生物学的临床前研究及新型治疗药物的开发。...

一种用于控制转移率的同系正位骨肉瘤Sprague Dawley大鼠截肢模型

本实验方案描述了通过胫骨内注射骨肉瘤细胞，建立携带原位骨肉瘤及肺转移病灶的小鼠模型。...

胫骨内骨肉瘤细胞注射法建立原位骨肉瘤及肺转移小鼠模型

本方案描述了利用人骨肉瘤组织建立患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型的方法。...

建立人骨肉瘤组织来源的患者异种移植小鼠模型

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。...

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

了解利用李-法美尼综合征患者成纤维细胞生成诱导多能干细胞并分化为成骨细胞的方法。该模型支持骨肉瘤发生机制研究、生物标志物鉴定和药物筛选，为癌症生物学和再生医学研究提供重要平台。

利用Li-Fraumeni综合征患者来源的诱导性多能干细胞建立骨肉瘤模型

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