Name: 人子宫内膜基质细胞的体外分离蜕膜化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 学习人子宫内膜基质细胞体外分离与激素诱导蜕膜化的完整方案，掌握siRNA基因敲除技术，用于研究蜕膜化分子机制及生殖医学应用。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中收集的所有人子宫内膜活检样本均来自圣路易斯华盛顿大学妇产科系，采集过程使用了经机构审查委员会（IRB）批准的书面知情同意书。
1. 准备
<ol>
	<li>向培养基瓶中加入青霉素至终浓度为100 U/mL，链霉素至终浓度为100 µg/mL，配制500 mL 1× Hank's平衡盐溶液（HBSS），后续称为HBSS+培养基。</li>
	<li>配制500 mL含酚红、L-谷氨酰胺和15 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12），向培养基瓶中加入1%抗生素-抗真菌素溶液（终浓度为100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B），该培养基后续简称为HESC分离培养基。</li>
	<li>准备500 mL含酚红、L-谷氨酰胺和15 mM HEPES的DMEM/F12培养基，加入10%胎牛血清（FBS）、1x Na2HCO3，以及1%青霉素（10,000 U/mL）和链霉素（10,000 µg/mL）（Pen Strep）加入培养基瓶中（下文简称HESC培养基）。</li>
	<li>在含有培养基的瓶子中（下文简称脱膜化培养基），配制500 mL含L-谷氨酰胺、2.4 g/L碳酸氢钠和HEPES的低血清培养基，并添加2%活性炭处理胎牛血清（csFBS）和1%青霉素-链霉素（Pen Strep）。</li>
	<li>在培养基瓶中加入2% 炭吸附胎牛血清（csFBS），配制500 mL 酚红-free DMEM/F12（以下简称更换培养基）。</li>
	<li>在15 mL聚丙烯圆锥管中配制10 nM雌二醇（E2）、1 µM醋酸甲羟孕酮（MPA）和50 µM环磷酸腺苷（cAMP），并加入至预先配制好的蜕膜化培养基中，每孔2 mL 体外 蜕膜化检测（下文简称为EPC培养基）。</li>
	<li>在50 mL聚丙烯圆锥形离心管中配制50 mL冻存液，其中含90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）（后文简称冻存液）。</li>
	<li>预先称取25 mg胶原酶和5 mg DNase I，置于50 mL锥形聚丙烯管中，于-20°C保存。</li>
</ol>
2. 人类子宫内膜活检获取
<ol>
	<li>从经机构审查委员会（IRB）批准的诊所获取处于月经周期增殖期（第9天至第12天）的人子宫内膜活检样本，并置于HBSS中。</li>
	<li>用1 mL预热至37 °C的HBSS+培养基洗涤活检样本，并轻轻振荡以去除多余的血液和黏液。</li>
</ol>
3. 人子宫内膜基质细胞（HESC）的分离
注意：该分离步骤需在生物安全柜内的无菌环境中进行。
<ol>
	<li>用无菌镊子将活检组织转移至含有 10 mL 新鲜 HBSS 的 50 mL 圆锥形聚丙烯离心管中。</li>
	<li>在室温下以 500 × g 离心 90 秒。
	<ol>
		<li>若细胞沉淀破裂，以 2,000 × g 再次离心 90 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 1 mL 移液器吸除上清液，并加入 10 mL 预热至 37 °C 的 HESC 分离培养基进行洗涤，随后以 500 × g 离心 90 秒。</li>
	<li>使用 1 mL 移液器吸除上清液，剧烈加入 3 mL 新鲜 HESC 分离培养基以使活检组织脱落。</li>
	<li>将活检组织倾注至含有 5 mL HESC 分离培养基的培养皿中。</li>
	<li>使用 #5 镊子和精细直剪刀将活检组织尽可能剪碎，持续约 20 分钟。</li>
	<li>通过向预先称重的 DNase I（0.5 mg/mL）和胶原酶（2.5 mg/mL）中各加入 10 mL HESC 分离培养基来配制酶液，用移液器混匀。</li>
	<li>使用 1 mL 移液器将剪碎的组织样本转移至新的 50 mL 圆锥形聚丙烯离心管中，用 7 mL HESC 分离培养基洗涤，并将全部样本加入该聚丙烯管中。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 2 分钟，用移液器轻柔吸除上清液。</li>
	<li>将 DNase I 和胶原酶溶液通过连接在 10 mL 注射器上的 0.2 µm 滤器直接过滤至细胞沉淀上。</li>
	<li>涡旋振荡 10 秒以重悬沉淀。</li>
	<li>在 37 °C 水浴中消化 1.5 小时，每隔 10 分钟涡旋振荡 10 秒，直至组织完全消化。</li>
	<li>将样本通过置于 50 mL 圆锥形聚丙烯离心管上的 40 µm 细胞筛过滤，以去除上皮细胞和组织碎片。 
	注：基质细胞保留在 50 mL 圆锥形聚丙烯离心管中。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 将 50 mL 圆锥形聚丙烯离心管离心 2.5 分钟，用 1 mL 移液器轻柔吸除上清液。</li>
	<li>用 10 mL HESC 分离培养基重悬沉淀。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 2.5 分钟，吸除上清液后，将细胞重悬于 6 mL HESC 培养基中，并通过正向和反向吹打混匀。</li>
	<li>缓慢将 3 mL 密度梯度介质加至重悬的细胞上层，以分离残留的血细胞与基质细胞，注意避免混合各层。</li>
	<li>在室温下以 400 × g 将 15 mL 聚丙烯离心管离心 30 分钟。</li>
	<li>将 5 mL 上清液收集至新的 50 mL 聚丙烯离心管中，并额外加入 5 mL HESC 培养基以重悬细胞。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 2.5 分钟，随后吸除上清液并加入 6 mL HESC 培养基。涡旋振荡 10 秒，并通过移液器正向和反向吹打 5 次混匀。</li>
	<li>取 10 µL 重悬细胞加入 1.5 mL 微量离心管中用于细胞计数。</li>
	<li>向细胞分样中加入 10 µL 0.4% 台盼蓝染液，用移液器混匀。取 10 µL 分样加载至血细胞计数板并进行细胞计数。</li>
	<li>根据总细胞数，将细胞接种至适当规格的培养瓶中，加入 15 mL HESC 培养基。
	<ol>
		<li>若总细胞数少于 100 万，则将所有细胞接种至 25 cm² 培养瓶中，加入 6 mL HESC 培养基；若总细胞数超过 100 万，则将所有细胞接种至 75 cm² 培养瓶中，加入 15 mL HESC 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养至少 6 小时，以确保细胞充分贴壁，随后更换为 HESC 培养基。</li>
	<li>将分离得到的 HESC 在 37 °C、5% CO2 培养箱中继续培养 3–5 天，直至细胞在培养瓶中形成单层，达到 80–90% 汇合度。</li>
	<li>每两天更换一次 HESC 培养基。
	<ol>
		<li>将 HESC 培养基在 37 °C 水浴中预热 15–20 分钟。</li>
		<li>吸除培养瓶中的旧培养基，并加入新鲜 HESC 培养基（工作体积：25 cm² 培养瓶为 8 mL，75 cm² 培养瓶为 16 mL）。</li>
		<li>将培养瓶放回 37 °C、5% CO2 培养箱中继续培养，直至细胞达到 80–90% 汇合度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当 HESC 达到 80–90% 汇合度时，将细胞从 25 cm² 培养瓶转移至 75 cm² 培养瓶，或从一个 75 cm² 培养瓶传代至三个 75 cm² 培养瓶。 
	注：此时可将 HESC 冻存，以供后续实验使用。</li>
</ol>
4. HESC 的冻存与复苏
<ol>
	<li>从75 cm²培养瓶中吸除培养基，加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2培养箱中孵育2–3分钟，直至细胞从培养瓶表面脱落。</li>
	<li>加入7 mL hESC培养基，通过反复吹打充分混匀。</li>
	<li>以800 × g离心2.5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>在冻存管上标记细胞系名称、日期和传代次数。</li>
	<li>用5 mL冻存液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将重悬的hESC细胞悬液每管分装1 mL至冻存管中，立即转移至-80 °C超低温冰箱。</li>
	<li>在24小时内将冻存管转移至液氮罐中储存。 
	注意：若计划在近期复苏细胞，可将冻存细胞在-80 °C保存一个月。</li>
	<li>复苏hESC前，将hESC培养基预热20分钟。</li>
	<li>向25 cm²培养瓶中加入8 mL预热的hESC培养基&#160;。</li>
	<li>从液氮罐或-80 °C冰箱中取出冻存管，迅速将其浸入37 °C水浴中1–2分钟，直至细胞完全解冻。</li>
	<li>将解冻后的hESC细胞转移至含hESC培养基的25 cm²培养瓶中，于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。</li>
	<li>次日更换hESC培养基，继续培养2–3天，待hESC细胞生长至融合度达到要求后，按以下“方案5”步骤转移至75 cm²培养瓶。
	<ol>
		<li>将hESC培养基在37 °C水浴中预热15–20分钟。</li>
		<li>吸除培养瓶中的旧培养基，加入新鲜hESC培养基（工作体积：25 cm²培养瓶为8 mL，75 cm²培养瓶为16 mL）。</li>
		<li>将培养瓶放回37 °C、5% CO2培养箱中，继续培养至细胞融合度达到80–90%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 人子宫内膜基质细胞（HESC）培养
注意：本培养操作需在生物安全柜内的无菌环境中进行。
<ol>
	<li>将HESC培养基在37°C水浴中预热20-30分钟。</li>
	<li>吸除培养瓶中的培养基，加入0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（25 cm²培养瓶加1 mL，75 cm²培养瓶加2 mL）。</li>
	<li>在37°C、5% CO2培养箱中孵育2-3分钟，直至细胞脱落。</li>
	<li>轻轻敲击培养瓶壁以使残留细胞脱落，加入7 mL HESC培养基，通过反复吹打混匀。</li>
	<li>将细胞悬液转移至50 mL锥形聚丙烯管中，在室温下以800 × g离心2.5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用HESC培养基重悬细胞沉淀。
	<ol>
		<li>25 cm²培养瓶加入15 mL，75 cm²培养瓶每次加入15 mL，共加45 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别向每个25 cm²或75 cm²培养瓶中加入5 mL或15 mL细胞悬液。</li>
	<li>将分离的HESC在37°C、5% CO2培养箱中培养3-5天，直至细胞在培养瓶中形成单层，达到80–90%融合度。</li>
	<li>每两天更换一次HESC培养基。
	<ol>
		<li>将HESC培养基在37°C水浴中预热15-20分钟。</li>
		<li>吸除培养瓶中的培养基，加入新鲜HESC培养基（工作体积：25 cm²培养瓶为8 mL，75 cm²培养瓶为16 mL）。</li>
		<li>将培养瓶放回37°C、5% CO2培养箱中继续培养，直至细胞达到80–90%融合度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 人子宫内膜基质细胞（HESC）铺板与siRNA转染
注意：该转染操作需在生物安全柜内的无菌环境中进行。
<ol>
	<li>从75 cm²培养瓶中吸除hESC培养基，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>在5% CO₂中孵育2 在37 °C培养箱中孵育2-3分钟，直至细胞脱落。</li>
	<li>细胞从培养瓶中脱落后，加入7 mL hESC培养基，通过前后吹打5次轻轻混匀。</li>
	<li>将细胞混合物移入50 mL圆锥形聚丙烯管中，在室温下以800 × g离心2.5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL hESC培养基中。 
	注意：若从多个培养瓶中接种细胞，只需增加hESC培养基的体积。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。
	<ol>
		<li>将10 µL重悬的细胞分装至1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>加入10 µL 0.4% 台盼蓝染液至细胞等分试样中，通过移液器吹打混匀（先移入再移出）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种 0.8 x 105 每孔6孔板接种细胞。两天后，细胞融合度应达到60–70%，以获得最佳转染效果。</li>
	<li>为每份siRNA转染样品，使用siRNA（60 纳摩尔）与转染试剂制备复合物。</li>
	<li>将5 µL转染试剂加入150 µL无血清培养基中稀释，孵育5分钟。</li>
	<li>将60纳摩尔的siRNA溶于100 µL无血清培养基中，孵育5分钟。</li>
	<li>5分钟后，将稀释的siRNA与稀释的转染试剂溶液混合，通过移液器前后吹打5次轻轻混匀。 
	注意：若在多个孔中转染一种或多种siRNA，应在10 mL聚苯乙烯管中配制总混合液。</li>
	<li>将siRNA-转染试剂复合物在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>孵育期间，向每个孔中加入1 mL更换培养基。</li>
	<li>孵育5分钟后，于500 × g离心2分钟以收集溶液，并将250 µL siRNA-转染试剂复合物加入含细胞和培养基的每孔中。</li>
	<li>轻轻摇动混匀，并在37°C、5% CO₂条件下孵育细胞2 孵育5小时。</li>
	<li>5小时后，将培养基更换为HESC培养基。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 孵育箱中孵育2天，以备进行后续实验 体外 蜕膜化检测</li>
</ol>
7.&#160;体外 蜕膜化实验
注意：本实验需在生物安全柜内的无菌环境中进行。
<ol>
	<li>在开始之前准备好EPC培养基 体外 如 Camden 中所述的蜕膜化处理 等3 （参见1.6）。</li>
	<li>吸弃在第6.16步开始孵育的转染48小时后的HESC培养液。</li>
	<li>每孔加入 2 mL EPC 培养基。 
	注意：作为对照，留一组细胞不添加EPC培养基，而在对照孔中加入2 mL hESC培养基。</li>
	<li>在5% CO₂条件下孵育细胞2 37 °C 培养箱中培养 6 天。
	<ol>
		<li>每48小时更换一次EPC培养基。
		<ol>
			<li>在37 °C水浴中预热并准备EPC培养基15-20分钟。</li>
			<li>吸出孔中的培养基，加入新鲜的EPC培养基。</li>
			<li>将培养板放回5% CO₂培养箱中2 37 °C 培养箱中孵育。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第六天后，通过ELISA和qRT-PCR分析间质细胞蜕膜化的程度（如下所述）。</li>
</ol>
8. 验证 体外 利用定量实时 PCR（qRT-PCR）进行蜕膜化分析
注意：qRT-PCR 操作步骤如 Kommagani et al10 中先前所述。
<ol>
	<li>利用市售RNA提取试剂盒的方案从HESC中分离总RNA。
	<ol>
		<li>使用NanoDrop或类似方法分析RNA的浓度和纯度（A260/A280），具体方法见Garcia-Elias et al15。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据市售逆转录试剂盒的方案，使用1 µg总RNA合成cDNA。</li>
	<li>按照市售qRT-PCR试剂盒的说明进行qRT-PCR反应。
	<ol>
		<li>使用市售的实时PCR预混液，结合基因特异性探针及内参系统对照（18s、PRL和IGFBP1）进行反应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 验证 体外 利用ELISA进行蜕膜化检测
<ol>
	<li>使用市售的催乳素ELISA试剂盒，定量检测组织培养基中分泌的催乳素水平。</li>
</ol>
10. 验证 体外 利用鬼笔环肽染色进行蜕膜化检测。
<ol>
	<li>将无菌盖玻片放入12孔板的每个孔中。</li>
	<li>重复步骤6.1 - 6.5。</li>
	<li>每孔接种0.8 × 105个细胞至12孔板中。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2培养箱中孵育2天。</li>
	<li>吸除培养基。</li>
	<li>重复步骤7.3 - 7.4。</li>
	<li>用含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下固定细胞30分钟。</li>
	<li>吸除固定液，用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>向固定后的细胞中加入含0.1%非离子表面活性剂聚乙二醇叔辛基苯基醚的PBS溶液，处理5分钟，以增强通透性。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>每张盖玻片加入100 µL鬼笔环肽（phalloidin）溶液，在室温下孵育90分钟。
	<ol>
		<li>使用浓度为每5 µL含1单位的鬼笔环肽储存液，用PBS稀释100倍制备工作液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜观察细胞。</li>
</ol>

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</ol>

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）/国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）资助项目（R00 HD080742）以及华盛顿大学医学院启动资金支持，资助对象为R.K.。我们感谢华盛顿大学生育诊所提供了子宫内膜活检样本。

女性生殖月经周期的特征是黄体期中孕酮水平升高，从而诱导子宫内膜基质细胞（ESC）分化为圆形的、类似上皮的分泌细胞3,8。蜕膜化的启动具有物种依赖性。在人类中，蜕膜化在孕酮浓度升高时自发发生，而小鼠则需要胚泡的存在10,11。这种蜕膜化机制的差异凸显了在人类细胞系中研究细胞分化的可转化优势。通过原代细胞培养进行的体外实验常被用于探究激素对蜕膜化的调控作用4,6,10。然而，该方法的局限性在于难以获得大量周期阶段一致且妊娠史无显著差异的人体组织样本。尽管如此，可通过提前充分规划研究方案以确保获得充足的样本，并将子宫内膜活检安排在月经周期的增殖期（第9天至第12天），从而最大限度地减少这些局限性。
<p class="...

在初潮至绝经期之间的阶段，育龄期女性会经历以激素调控的子宫内膜增殖、分化及随后脱落的月度周期，为妊娠做准备，这一过程称为月经1,2。人类子宫内膜的这些生理变化对于胚胎正确植入子宫壁至关重要1。子宫内膜的改变，包括形态学和生物化学方面的适应性变化，均由卵巢类固醇激素雌激素和孕酮（P4）在整个月经周期中进行调控3,4,5。在增殖期（又称卵泡期），排卵前雌激素水平上升，启动子宫内膜增厚。排卵后进入分泌期（又称黄体期），P4浓度显著升高，诱导子宫内膜基质细胞（ESC）从成纤维细胞样形态转变为圆形、上皮样蜕膜细胞，这一过程称为蜕膜化4,6。已有研究证实，蜕膜化异常是导致胚胎植入失败及随后早期流产的根本原因之一4,7,8。因此，阐明蜕膜化的分子机制，有助于早期妊娠丢失的诊断与治疗。
目前，已有多种方法用于研究蜕膜化对子宫内膜基质细胞的潜在影响。在体内，可通过机械刺激（即，划伤）或在激素预处理的子宫内注射油剂，人工诱导小鼠子宫发生蜕膜化9。与人类不同，这种人工刺激可通过模拟胚泡存在的迹象，促进子宫腔上皮的分化，而该步骤是啮齿类动物蜕膜化启动所必需的10,11。因此，由于动物模型在转化研究中的局限性，以及人体在体内研究面临的伦理困境，蜕膜化相关模型在体外研究中最为成功。
本研究通过在当地英文和西班牙文报纸上刊登广告招募受试者。确定为合适候选人的受试者将被邀请与研究协调员会面，期间将全面告知其可能面临的风险。在确认受试者充分理解所涉及的潜在风险后，获取其书面和口头形式的知情同意。受试者的知情同意包括授权：（1）接受静脉采血；（2）其组织长期储存以用于未来研究；以及（3）同意利用所采集的组织样本建立原代培养。在获得知情同意后，受试者将填写一份表格，允许其自主申报种族/族裔信息，或选择不予披露。随后将根据受试者的月经周期安排下一次就诊，以获取子宫内膜活检样本。本研究招募的志愿者在种族和族裔构成上反映了2012年人口普查所记录的圣路易斯大都会地区的人口特征，且未纳入任何脆弱人群，包括孕妇、胎儿、胚胎、18岁以下儿童或其他脆弱群体。参与活检样本采集的入选标准包括：（1）年龄在18至45岁之间；（2）具有规律的月经周期（25至32天）；（3）在入组前30天内未怀孕，且未使用激素类或宫内节育器类避孕措施；（4）目前无阴道感染或性传播疾病；（5）目前未接受抗生素治疗；以及（6）目前无异常宫颈细胞学检查结果（Pap涂片异常）。
在本研究中，人子宫内膜基质细胞（HESC）被培养并人工诱导其发生 体外 通过在培养基中添加激素（雌二醇（E2）、醋酸甲羟孕酮（MPA）和环磷酸腺苷（cAMP））诱导蜕膜化。在此方法中，蜕膜化的程度随激素处理的总天数而变化。结合细胞骨架的重排，激素补充可诱导生化适应性改变，使蜕膜细胞呈现类似分泌期的特性2,4。标志基因的表达，例如催乳素（prolactin,PRL）和胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP1），可用于确认和量化人胚胎干细胞蜕膜化的程度5,12,13,14重要的是，本方案在实现基因特异性敲低方面的可行性也得到了验证。

<table><tbody><tr><td>Opti-MEM I (1X) 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>用于蜕膜化培养基</td></tr><tr><td>DMEM / F12 (1:1) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液 (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183018A</td><td>用于RNA提取/纯化</td></tr><tr><td>TaqMan 2X Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4374967</td><td></td></tr><tr><td>Eukaryotic 18S rRNA 内源性对照</td><td>Life Technologies</td><td>4319413E</td><td>用于qPCR内参对照</td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测 泌乳素探针</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>用于qPCR内参对照</td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测 IGFBP1 探针</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>用于qPCR内参对照</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488 试剂 - CytoPainter</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>人泌乳素ELISA试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>EHIAPRL</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>用于封片</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>活性炭处理胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 (7.5%)</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS 试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>45001749</td><td></td></tr><tr><td>溶组织梭菌胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>醋酸甲羟孕酮</td><td>Sigma</td><td>M1629-1G</td><td>用于EPC培养基</td></tr><tr><td>雌二醇</td><td>Sigma</td><td>E1024-1G</td><td>用于EPC培养基</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885-100MG</td><td>用于EPC培养基</td></tr><tr><td>精细直剪手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测 NCOA2 探针</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351372</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，热灭活</td><td>Gibco</td><td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-021-cv</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形聚丙烯Falcon管</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm 玻璃培养皿</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>40 微米细胞筛</td><td>Midsci</td><td>229481</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS-215</td><td></td></tr><tr><td>LSE 离心机&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>人NCOA2 siRNA&amp;nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>L-020159-00</td><td>基因特异性qPCR探针</td></tr><tr><td>Steri-cycle i160 CO2 培养箱&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030301</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>用于RNA定量</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50146771</td><td></td></tr><tr><td>75 cm 倾斜颈细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>6 孔无热原细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Controller Ultra</td><td>Corning</td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>19.0.1.334</td><td></td></tr><tr><td>25 cm 倾斜颈细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>7200876</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形聚丙烯Falcon管</td><td>Corning</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>1300 系列 A2 生物安全柜</td><td>Thermo Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>accuspin Micro17 离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>13100675</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast 实时荧光定量PCR系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>3052632</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL 免疫荧光显微镜</td><td>Life Technologies</td><td>01414-155G-291</td><td></td></tr><tr><td>Leica 倒置光学显微镜</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td>22.0.1.253</td><td></td></tr><tr><td>Excel 电子表格</td><td>Microsoft</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser 18 mm 盖玻片</td><td>NeuVitro</td><td>GG-18</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line 血细胞计数板</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP176-100</td><td>用于RNA裂解缓冲液</td></tr><tr><td>1.2 mL 外螺纹聚丙烯冷冻管</td><td>Corning</td><td>430658</td><td>用于冷冻HESC细胞&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650-100mL</td><td>用于冷冻培养基</td></tr></tbody></table>

人子宫内膜基质细胞的分离 体外 蜕膜化

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

人类子宫内膜基质细胞（HESC）从成纤维细胞样形态分化为分泌性蜕膜的过程，是胚胎植入母体子宫内膜所必需的转变。蜕膜化异常已被证实是导致胚胎植入失败及随后早期流产的根本原因。因此，阐明蜕膜化的分子机制有助于提高成功妊娠的几率。体内人工蜕膜化研究常因涉及人类研究的伦理困境以及动物模型中的转化复杂性而受到限制。因此，通常采用原代细胞培养的体外实验方法，通过激素调控来研究蜕膜化过程。本研究提供了一种详细的HESC分离方法，以及通过在培养基中添加激素实现人工蜕膜化的操作流程。此外，本研究还提供了一种利用脂质体介导的siRNA转染技术，对任意目的基因进行敲低的优化方法。该实验方案可有效提高细胞培养的纯度和产物得率，从而最大限度地将该模型作为可靠手段，用于解析蜕膜化背后的分子机制，并对蜕膜化后的子宫内膜基质细胞所分泌的因子进行定量分析。

人子宫内膜基质细胞培养中的蜕膜化
分离后，将人子宫内膜基质细胞培养至形成单层，汇合度达到80-90%，并进行诱导 体外 通过用10 nM E2处理诱导蜕膜化， 1 µM MPA，以及 50 µM cAMP（EPC）。与形态学变化相关的 体外 蜕膜化在 图1A蜕膜化过程中，人子宫内膜基质细胞（HESCs）的细胞骨架发生重构，由细长的成纤维细胞样形态转变为圆形的上皮样细胞。因此，通过鬼笔环肽染色以确认HESC蜕膜化过程中的细胞骨架重排。鬼笔环肽是一种高度特异性的双环肽，可用于标记肌动蛋白纤维，从而可视化与细胞骨架重构一致的形态变化。 体外 蜕膜化图1B).
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

本研究提供了一种经过验证和优化的人子宫内膜基质细胞分离与培养的实验方案，可用于 体外 蜕膜化检测。此外，本研究提供了一种利用siRNA在人子宫内膜基质细胞中高效敲低特定基因的详细方法。

人源子宫内膜基质细胞（HESC）从成纤维细胞样形态向分泌型蜕膜的分化是实现……所必需的转变

该方法可用于解答生殖医学领域中的关键问题，例如蜕膜化的潜在分子机制，以及特定基因在子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中的作用。本研究提供了分离人子宫内膜基质细胞并随后通过在培养基中添加激素诱导人工蜕膜化的详细实验方案。可通过检测激素相关分子的表达变化，如催乳素和胰岛素样生长因子结合蛋白1的表达水平，来确认并量化蜕膜化的程度。重要的是，本方案还可用于实现基因特异性的敲低，其可行性也得到了验证。用灭菌镊子将活检组织转移至含有 10 毫升新鲜 HBSF 的 50 毫升离心管中，随后在 500×g 条件下离心 90 秒。使用 1 mL 移液器吸除上清液，并加入 3 mL 预热的 hES 分离培养基。将活检组织倒入含有5 mL hES分离培养基的10厘米培养皿中，使用Dumont 5号镊子和精细直剪刀切碎约20分钟。用1 mL移液器将切碎的组织转移至新的50 mL离心管中，并向培养皿中额外加入7 mL hES分离培养基，以将剩余组织碎片转移至该50 mL离心管中。随后以800×g离心2分钟，并用1 mL移液器吸除上清液。接下来，将DNase-1和胶原酶消化混合液通过连接在10毫升注射器上的0.2微米滤器，直接过滤到沉淀上。然后涡旋振荡管子10秒以重悬沉淀，并在水浴中孵育90分钟。每隔10分钟，涡旋振荡管子10秒，以确保组织充分消化。孵育后，将悬液通过置于新50毫升离心管上的40微米细胞筛过滤，以收集基质细胞，随后以800×g离心2.5分钟。离心后，用1毫升移液器小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。然后将细胞沉淀重悬于10毫升新鲜hES分离培养基中，再以800×g离心2.5分钟。离心后，小心吸除上清液，并将细胞重悬于6 mL新鲜hES培养基中。接着，为去除血细胞，将重悬的细胞缓慢铺加到3 mL密度梯度培养基上，然后以400×g离心30分钟。离心后，收集上清液，注意不要扰动密度梯度培养基。然后加入hES培养基，使总体积达到10毫升，并在800×g下再次离心2.5分钟。离心后，弃去上清液，将细胞重悬于6毫升hES培养基中。接下来，将6毫升细胞悬液和10毫升hES培养基加入一个75平方厘米的培养瓶中进行接种，随后通过轻轻摇动培养瓶使液体混合均匀。接种后，在显微镜下检查细胞密度，然后将细胞置于含5%二氧化碳的培养箱中培养三至五天，每两天更换一次hES培养基。48小时后，细胞应以单层形式生长。通常在五天后，细胞在75平方厘米的培养瓶中达到80%至90%的融合度。进行siRNA转染时，首先将每种条件下的细胞以每孔800,000个细胞接种于六孔板中，每组设三个复孔，并将细胞置于含5%二氧化碳的培养箱中孵育两天，以准备转染。两天后，在一个5 mL离心管中加入150 µL Opti-MEM无血清培养基，随后加入5 µL转染试剂。通过轻柔颠倒充分混匀，室温孵育5分钟。接下来，在一个新的 5 mL

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人子宫内膜基质细胞的体外分离蜕膜化

从子宫切除标本中建立原代子宫内膜基质细胞培养体系是一种有价值的生物学技术，也是开展多种研究目标之前的关键步骤。本文中，我们描述了两种用于从人患者手术切除的子宫内膜组织中建立基质细胞培养的方法。...

从子宫切除标本中建立原代人子宫内膜基质细胞的两种方法

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人脂肪来源基质细胞的分离与富集以增强成骨作用

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快速分离BMPR-IB+脂肪源性基质细胞用于颅骨缺损修复模型

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人脐带和胎儿胎盘间充质基质细胞的分离与鉴定

本文介绍一种利用骨形态发生蛋白4（bone morphogenic protein...

体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

学习人子宫内膜基质细胞体外分离与激素诱导蜕膜化的完整方案，掌握siRNA基因敲除技术，用于研究蜕膜化分子机制及生殖医学应用。

人子宫内膜基质细胞的分离体外蜕膜化

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