人子宫内膜基质细胞的分离 体外 蜕膜化

该方法可用于解答生殖医学领域中的关键问题，例如蜕膜化的潜在分子机制，以及特定基因在子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中的作用。本研究提供了分离人子宫内膜基质细胞并随后通过在培养基中添加激素诱导人工蜕膜化的详细实验方案。可通过检测激素相关分子的表达变化，如催乳素和胰岛素样生长因子结合蛋白1的表达水平，来确认并量化蜕膜化的程度。

重要的是，本方案还可用于实现基因特异性的敲低，其可行性也得到了验证。用灭菌镊子将活检组织转移至含有 10 毫升新鲜 HBSF 的 50 毫升离心管中，随后在 500×g 条件下离心 90 秒。使用 1 mL 移液器吸除上清液，并加入 3 mL 预热的 hES 分离培养基。

将活检组织倒入含有5 mL hES分离培养基的10厘米培养皿中，使用Dumont 5号镊子和精细直剪刀切碎约20分钟。用1 mL移液器将切碎的组织转移至新的50 mL离心管中，并向培养皿中额外加入7 mL hES分离培养基，以将剩余组织碎片转移至该50 mL离心管中。随后以800×g离心2分钟，并用1 mL移液器吸除上清液。

接下来，将DNase-1和胶原酶消化混合液通过连接在10毫升注射器上的0.2微米滤器，直接过滤到沉淀上。然后涡旋振荡管子10秒以重悬沉淀，并在水浴中孵育90分钟。每隔10分钟，涡旋振荡管子10秒，以确保组织充分消化。

孵育后，将悬液通过置于新50毫升离心管上的40微米细胞筛过滤，以收集基质细胞，随后以800×g离心2.5分钟。离心后，用1毫升移液器小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。然后将细胞沉淀重悬于10毫升新鲜hES分离培养基中，再以800×g离心2.5分钟。

离心后，小心吸除上清液，并将细胞重悬于6 mL新鲜hES培养基中。接着，为去除血细胞，将重悬的细胞缓慢铺加到3 mL密度梯度培养基上，然后以400×g离心30分钟。离心后，收集上清液，注意不要扰动密度梯度培养基。

然后加入hES培养基，使总体积达到10毫升，并在800×g下再次离心2.5分钟。离心后，弃去上清液，将细胞重悬于6毫升hES培养基中。接下来，将6毫升细胞悬液和10毫升hES培养基加入一个75平方厘米的培养瓶中进行接种，随后通过轻轻摇动培养瓶使液体混合均匀。

接种后，在显微镜下检查细胞密度，然后将细胞置于含5%二氧化碳的培养箱中培养三至五天，每两天更换一次hES培养基。48小时后，细胞应以单层形式生长。通常在五天后，细胞在75平方厘米的培养瓶中达到80%至90%的融合度。

进行siRNA转染时，首先将每种条件下的细胞以每孔800,000个细胞接种于六孔板中，每组设三个复孔，并将细胞置于含5%二氧化碳的培养箱中孵育两天，以准备转染。两天后，在一个5 mL离心管中加入150 µL Opti-MEM无血清培养基，随后加入5 µL转染试剂。通过轻柔颠倒充分混匀，室温孵育5分钟。

接下来，在一个新的 5 mL 离心管中加入 100 微升 Opti-MEM 无血清培养基，随后加入 16 纳摩尔的 SRC-2 siRNA。然后，在另一个 5 mL 离心管中加入 100 微升 Opti-MEM 无血清培养基，随后加入 16 纳摩尔的对照 siRNA。孵育后，将稀释的转染试剂与 SRC-2 siRNA 混合，通过移液器反复吹打充分混匀。

然后将稀释的转染试剂与对照siRNA混合，并通过移液器反复吹打充分混匀。随后将复合物孵育5分钟。在此孵育期间，吸出hES培养基，并向每孔加入1毫升更换培养基。

孵育5分钟后，以500×g离心2分钟，收集溶液。然后向每孔含有细胞和培养基的孔中加入250微升siRNA转染试剂复合物，轻轻摇晃混匀，随后在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育5小时。5小时后，吸除培养基，更换为hES培养基，继续孵育两天，为体外蜕膜化实验做准备。

转染48小时后，在开始体外蜕膜化实验之前，收集第0天对照siRNA和SRC-2 siRNA转染的细胞。首先吸除培养基，每孔用1 mL PBS洗涤一次。然后去除PBS，每孔加入300微升RNA裂解缓冲液，孵育3分钟。

孵育3分钟后，将细胞收集到RNA裂解缓冲液中，转入1.5 ml离心管，用于后续分析。然后通过分装适量体积的蜕膜化培养基，在50 ml离心管中制备EPC培养基，并加入10纳米摩尔的雌二醇、1微摩尔的醋酸甲羟孕酮和50微摩尔的环磷酸腺苷。对于其余第6天的孔，每孔加入2毫升EPC培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中继续孵育6天，每48小时更换一次EPC培养基。

在第六天后，使用RNA裂解缓冲液收集第六天的对照siRNA和第六天SRC-2 siRNA转染的细胞沉淀，用于后续实时PCR分析。雌激素、醋酸甲羟孕酮和环磷酸腺苷诱导的蜕膜化可导致间质细胞的细胞骨架重排，表现为从细长的成纤维细胞形态转变为圆形的上皮样细胞形态。对子宫内膜间质细胞进行鬼笔环肽染色可进一步揭示人子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中活跃的纤维状细胞骨架重组特征。

在载体处理的hES细胞中，细胞仍保持成纤维细胞样的形态，而在EPC处理的细胞中，hES细胞则呈现上皮样形态。为验证体外蜕膜化实验的有效性，检测了蜕膜化标志物催乳素和胰岛素样生长因子结合蛋白-1的mRNA转录水平，持续观察6天。人子宫内膜基质细胞发生蜕膜化后，催乳素和IGFBP1的表达水平随时间呈依赖性升高。

通过ELISA方法检测hES组织培养基，证实了分泌型催乳素水平随时间呈上升趋势。在转染对照siRNA或类固醇受体共激活因子2 siRNA 48小时后，于培养第六天评估基因特异性敲低对人子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中细胞和分子变化的影响。转染对照siRNA的hES细胞表现出与正常蜕膜化一致的细胞和分子变化，包括呈现铺路石样形态改变以及蜕膜化标志物PRL和IGFBP1的转录水平升高。

在SRC-2 siRNA敲低实验中，与转染对照siRNA的hES细胞相比，hES细胞仍保持成纤维细胞样形态，并且PRL和IGFBP1的转录水平显著降低。转染SRC-2 siRNA的hES细胞中SRC-2的转录水平相较于对照siRNA组显著下降，表明该方法适用于基因沉默。观看本视频后，您应能够充分理解如何从子宫内膜活检组织中分离原代基质细胞，以用于体外蜕膜化实验，并通过siRNA转染技术敲低特定目的基因。