Name: 肿瘤免疫和非免疫微环境在小鼠皮下肿瘤中的富集与鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学习使用密度梯度离心法分离小鼠皮下肿瘤中的免疫细胞和肿瘤细胞组分，实现肿瘤免疫微环境的全面分析。该方法可有效富集肿瘤免疫与非免疫成分，帮助研究人员深入理解肿瘤免疫状态及治疗诱导的变化。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JMN 承认获得美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所（T32GM088129）和国家牙科与颅面研究所（F31DE026682）的经费支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。本项目还得到了贝勒医学院细胞计量与细胞分选核心实验室的支持，该核心实验室的资金来自美国国立卫生研究院（P30 AI036211、P30 CA125123 和 S10 RR024574），并承蒙 Joel M. Sederstrom 提供的专业协助。

本文所述所有方法均已获得贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 肿瘤组织的收获与消化
注意：每例肿瘤的收获时间约为 3 - 5 分钟，处理时间约为 1 小时 + 每例肿瘤 2 - 3 分钟。
<ol>
	<li>通过吸入二氧化碳处死小鼠，并在取材前用70%乙醇喷洒每只小鼠，以防止毛发污染。手术切除小鼠皮下肿瘤，并确保肿瘤组织无任何污染组织即， 毛发、皮肤、腹膜 等等。)。将每个肿瘤置于含有1.8 mL不含胎牛血清（FBS）的基础RPMI-1640培养基的24孔板中。对于较大规模的收获，需将培养板置于冰上保持低温，以维持细胞活性。 
	注意：如果需要无菌操作，所有肿瘤解剖步骤都必须在生物安全柜中使用无菌外科器械进行（即， 剪刀，镊子 等等。），以及后续所有步骤。最长径介于 0.5 -&#160;1 cm 的肿瘤最为理想，过大或过小的肿瘤均需调整试剂用量。</li>
	<li>使用剪刀将肿瘤切成小于1 mm的组织块3 每个孔中的组织块。</li>
	<li>在基础RPMI-1640培养基（不含FBS）中溶解胶原酶I至10 mg/mL、胶原酶IV至2,500 U/mL以及DNase I至200 U/mL，配制10倍消化液。 
	注意：消化液混合物可提前一天配制，并在 -20 °C 保存；但不建议长期储存，因为酶在溶解后会随时间推移逐渐失去活性。</li>
	<li>加入200 µL含有胶原酶I、胶原酶IV和DNase I的10倍解离混合液至每孔，其中组织块直径为1 mm3 块</li>
	<li>在37 °C下孵育样品1小时，同时使用轨道摇床以60 - 100 rpm速度轻轻振荡。 
	注意：在酶消化过程中将温度升高至 37 °C 可能引起免疫细胞活化。</li>
	<li>孵育1小时后，向每孔加入1 mL含5% FBS和2 mM EDTA的RPMI-1640培养基以中和反应。</li>
	<li>将肿瘤消化液和剩余的肿瘤组织块用移液器转移至置于50 mL离心管上方的40 µm细胞滤筛中。 
	注意：剪掉1 mL枪头的尖端，以便更顺利地将肿瘤消化液转移至滤筛。</li>
	<li>使用10 mL注射器活塞通过滤网对肿瘤组织进行机械性解离。每隔一段时间用2 mL添加了5% FBS的RPMI-1640培养基冲洗滤网，并重复操作，直至滤网上无残留肿瘤组织。 
	注意：总共使用约 4 - 10 mL 培养基应足以充分冲洗滤网上的肿瘤组织。 
	注意：所有样本完成此步骤前，需将样本置于冰上，以保持细胞活性。</li>
	<li>使用添加了补充剂的RPMI-1640培养基将每个50 mL离心管调整至相同体积。 
	注意：调整体积对于离心机平衡至关重要。跳过此步骤可能导致离心机损坏或人身伤害。</li>
	<li>将细胞悬液离心（5 分钟，805 × g，4 °C），弃上清，加入 2 mL 添加物的 RPMI-1640 培养基重悬。 
	注意：离心后可能形成难以重悬的细胞团块。请使用5 mL刻度吸管快速吹打混匀以分散团块，再继续后续操作。</li>
</ol>
2. 免疫细胞与肿瘤细胞组分的分离
注意：此步骤所需时间约为 1 h。
<ol>
	<li>在15 mL离心管底部加入3 mL密度梯度介质。为每个肿瘤准备并标记足够的离心管。</li>
	<li>用移液器沿离心管壁缓慢将2 mL肿瘤细胞悬液加至密度梯度介质上方，避免两层液体混合。</li>
	<li>小心将分层后的离心管放入离心机，于805 × g、20 °C条件下离心20分钟，不使用刹车。 
	注意：必须确保离心管正确配平，并确认离心过程中未使用刹车。任何操作不当均可能导致各层混合，从而难以完全回收样本。</li>
	<li>使用转移移液器小心将肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）层及上层培养基转移至新的15 mL离心管中。弃去剩余的密度梯度介质，并将离心管底部的肿瘤细胞沉淀用2 mL含补充物的RPMI-1640培养基重悬。 
	注意：离心后自上而下可观察到四个明显分层，依次为：培养基层、TIL层、密度梯度介质层和肿瘤细胞沉淀层。参见图2A以了解各层示例。</li>
	<li>将TIL样本和肿瘤样本分别在不同离心管中离心（5分钟，805 × g，4 °C），弃去上清液。</li>
	<li>将TIL样本用200 µL含补充物的RPMI-1640培养基重悬，肿瘤沉淀则用2 mL相同培养基重悬。置于冰上以维持细胞活性。</li>
</ol>
3. 涂布与染色
注意：铺板所需时间为每肿瘤30秒；表面染色所需时间为1小时；胞内染色所需时间为40分钟；流式细胞术分析所需时间为每肿瘤1至4分钟。
<ol>
	<li>为每种免疫染色面板和一个额外的细胞计数板准备并标记一个96孔U型底板。 
	注意：通常总共准备三个板：一个以淋巴细胞为重点的面板板，一个以髓系细胞为重点的面板板，以及一个细胞计数板。</li>
	<li>将单细胞悬液分装至各染色面板板中，并将固定体积的细胞悬液加入计数板。 
	注意：计数板用于计算加入每个染色面板的总细胞数，从而实现准确的细胞亚群计数。使用具备96孔板上样和体积分析功能的流式细胞仪，可提供每个样本中每微升（µL）的细胞数量，进而计算出加入各染色面板的细胞总数。计数板可在4 °C下固定过夜后，用FACs缓冲液（含2% FBS的磷酸盐缓冲液PBS）洗涤并重悬于固定体积的FACs缓冲液中，次日进行检测。</li>
	<li>每份样本用200 µL杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤两次，每次通过离心（5分钟，805 × g，4 °C）后弃去上清液，以去除任何游离的FBS。</li>
	<li>每孔加入50 µL Fc阻断剂，使用多通道移液器混匀样本，并在4 °C下孵育20分钟。</li>
	<li>加入50 µL 2倍浓缩的细胞外靶向抗体与可固定活力染料混合液，使用多通道移液器混匀，并在室温或4 °C下避光孵育30分钟。 
	注意：抗体的具体染色条件取决于制造商的说明。所有染色稀释液必须使用DPBS配制，不得添加FBS，以防止可固定活力染料饱和。请参见本文所用染色面板的材料/设备表中推荐的最佳稀释比例。抗体与可固定活力染料溶液应配制成2倍浓度，以便在加入Fc阻断剂后，总体积为100 µL时达到最终1倍的染色浓度。</li>
	<li>用FACs缓冲液洗涤样本两次，每次离心（5分钟，805 × g，4 °C）后弃去上清液。</li>
	<li>用200 µL 1倍固定/通透溶液重悬细胞，避光条件下在4 °C下孵育过夜。 
	注意：实验可在该步骤暂停过夜：将样本置于4 °C避光保存。</li>
	<li>次日，对板进行离心（5分钟，805 × g，4 °C），弃去上清液。</li>
	<li>用200 µL 1倍通透缓冲液洗涤一次，离心（5分钟，805 × g，4 °C），弃去上清液。</li>
	<li>加入100 µL以1倍通透缓冲液配制的1倍浓度细胞内抗体染色面板，避光条件下在室温或4 °C下孵育30分钟（具体条件依制造商建议而定）。</li>
	<li>先用1倍通透缓冲液洗涤一次（5分钟，805 × g，4 °C），弃去上清液，再用FACs缓冲液（含2% FBS的PBS）洗涤一次。</li>
	<li>用300 µL FACs缓冲液（含2% FBS的PBS）重悬样本，转移至流式细胞管中，进行流式细胞分析。</li>
</ol>

<ol><li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446472/">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li>
<li>Chiou, V. L., Burotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudoprogression+and+Immune-Related+Response+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).</li>
<li>Menon, S., Shin, S., Dy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Cancer+Immunotherapy+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors.</a> Cancers. 8 (12), 106(2016).</li>
<li>Denkert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Lymphocytes+As+an+Independent+Predictor+of+Response+to+Neoadjuvant+Chemotherapy+in+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+ablative+radiation+on+local+tumor+require+CD8%2B+T+cells%3A+changing+strategies+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment.</a> Blood. 114 (3), 589-595 (2009).</li>
<li>Stakheyeva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+component+of+tumor+microenvironment+in+the+efficiency+of+cancer+treatment%3A+perspectives+for+the+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-Cytometry%3A+A+Method+for+Highly+Multiplex+Quantitative+Tissue+Imaging+Analysis+Applied+to+Dendritic+Cell+Subset+Microanatomy+in+Lymph+Nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li>
<li>Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cell+Subsets+in+Tumor-Bearing+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Casadevall, A., Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigorous+Science%3A+A+How-To+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rigorous Science: A How-To Guide.</a> mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyTOF+supports+efficient+detection+of+immune+cell+subsets+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples.</a> Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).</li>
<li>Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Mass+Cytometry+%28CyTOF%29+for+Functional+and+Phenotypic+Analysis+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells.</a> Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).</li>
<li>Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Tumor-infiltrating+Leukocyte+Subsets+in+a+Subcutaneous+Tumor+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肿瘤微环境（TIME）由多种复杂的细胞成分和分子构成。最近的研究证据表明，准确表征这一环境有助于更好地理解治疗成功或失败的原因，甚至可能帮助识别治疗耐药的机制。例如，肿瘤内多种免疫抑制细胞水平的升高（即， 髓源性抑制细胞，调节性T细胞， 等等。）可减轻效应免疫反应，并消除免疫治疗效果。另一方面，肿瘤内效应免疫细胞群的增多（例如， 肿瘤特异性的CD8+ T细胞、自然杀伤细胞、辅助性T细胞）可作为治疗效果的有力预测指标。另一种能够持续准确反映肿瘤免疫状态的特征是肿瘤细胞自身的表型特征，包括表达多种旨在抑制效应性免疫应答的免疫抑制性配体、酶或分子。即， PD-L1、PD-L2、吲哚胺2,3-双加氧酶、一氧化氮 等等。综上所述，这表明有必要对实体瘤的免疫和肿瘤细胞特征进行准确而全面的表征。
本文所述技术可实现对小鼠实体皮下肿瘤中免疫细胞与肿瘤细胞组分的分离与富集，进而可独立进行流式细胞术分析，全面评估肿瘤免疫微环境（TIME）以及肿瘤细胞与TIME之间的相互作用。经过富集后，可优化设计广泛的免疫细胞流...

免疫抑制性肿瘤微环境（TIME）近年来被确认为癌症的一个重要特征，已知在实体瘤的发生、发展、保护过程中发挥关键作用，并可降低其对免疫治疗的敏感性。1肿瘤免疫微环境（TIME）由多种细胞亚群和表型组成，这些细胞亚群和表型为揭示肿瘤的免疫状态提供了关键信息。这些免疫细胞亚群可进一步分为起源于淋巴细胞或髓系细胞的群体，二者共同构成了先天性和适应性免疫反应的主体。2,3近年来，癌症免疫治疗领域的进展表明，免疫治疗策略（即， 免疫检查点抑制剂，嵌合抗原受体T细胞 等等。) 有可能诱导持久的癌症缓解；然而，它们在实体瘤癌症中仍然相对无效4,5许多研究团队已证实，肿瘤免疫微环境（TIME）对治疗成功与否具有关键性阻碍作用6,7，因此，仍需在临床前阶段准确评估新的免疫疗法，特别是关注其调节或克服肿瘤免疫微环境（TIME）的能力8.
目前对肿瘤免疫微环境（TIME）进行表征的研究通常采用显微镜技术或流式细胞术，并结合抗体标记策略，以鉴定免疫细胞亚群及其特征9,10这两种策略提供的信息具有独特差异：显微镜技术能够实现对细胞亚群的空间分布进行观察，而流式细胞术则可实现高通量、更广泛的细胞变化定量分析。尽管近年来荧光多重免疫组化技术结合光谱成像系统的优化取得了进展，目前已可支持多达7个参数，但受限于较小的检测面板规模，难以实现全面的免疫谱型分析，因此该技术通常用于更为集中的特定分析。正因如此，流式细胞术仍是目前应用最广泛的免疫谱型分析技术之一。尽管其在肿瘤免疫微环境（TIME）表征中被广泛使用，但样本处理与染色方法却存在较大差异。大多数方案通常采用肿瘤解离酶（即， 胶原酶，DNase 等等。）以及手动解离方法制备单细胞悬液，随后进行抗体染色与分析7尽管每种方法都有其优势，但许多研究团队已证实，这些技术可能引发显著的变异性。11这使得不同研究之间对肿瘤微环境的分析结果极难进行比较，即使是在评估相同的鼠源肿瘤模型时也是如此。此外，由于消化后肿瘤细胞与肿瘤浸润免疫细胞相互混杂，这些方法难以独立评估这两类成分。样本量的限制进一步制约了多色抗体组合染色及分析的可行性，这在试图表征稀有免疫细胞亚群时成为一个主要问题。即， 肿瘤特异性T细胞12较新的技术，如质谱流式细胞术（或称飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF），可实现对细胞亚群的高维表型分析，部分系统支持超过42个独立参数的检测 panel 设计。13尽管CyTOF技术在免疫谱型分析中具有强大功能，但其应用仍受到设备成本高昂、分析所需专业知识以及设备可及性等因素的限制。此外，许多CyTOF实验方案建议对免疫细胞亚群进行纯化，以提高信噪比14因此，我们建议将本富集方法用于CyTOF分析的上游步骤，以提高数据质量。
本文描述了一种整合了肿瘤免疫浸润细胞分离的肿瘤微环境消化与分析方法。该方法的目的是实现对肿瘤免疫浸润细胞和肿瘤细胞组分的独立高通量分析，从而更全面地表征肿瘤微环境。利用该方法，我们进一步证明了进行全肿瘤分析的重要性，因为皮下实体瘤模型显示出显著的空间免疫异质性。总体而言，该方法能够更准确且一致地进行样本间的比较，因为它富集了肿瘤内的免疫细胞亚群，并允许对肿瘤的肿瘤细胞组分和免疫组分进行独立分析。

<table><tbody><tr><td>6至12周龄雄性C57BL/6小鼠</td><td>Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>本研究中用于肿瘤实验的小鼠</td></tr><tr><td>MEER小鼠同源性癌细胞系</td><td>来自合作方&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>表达E6/E7 HPV抗原的小鼠扁桃体上皮癌细胞系&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>70%异丙醇&amp;nbsp;</td><td>EMD Milipore&amp;nbsp;</td><td>PX1840</td><td></td></tr><tr><td>小鼠外科手术工具包</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td>主要仅需剪刀、镊子和手术刀。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24孔板&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>T1024</td><td>或任何24孔平底板。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI-1640培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶I&amp;nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>234153</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>低速轨道摇床</td><td>BioExpress (供应商：Genemate)&amp;nbsp;</td><td>S-3200-LS</td><td>或任何其他轨道摇床。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>温控培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-255-27</td><td>或任何其他温控培养箱</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>1 mL移液器及吸头</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-032</td><td>或任何其他移液器及吸头</td></tr><tr><td>40 µm细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50 mL离心管</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>15 mL锥形管</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>10 mL无针鲁尔锁注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep密度梯度介质</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P7212</td><td></td></tr><tr><td>96孔U型底板</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D8573</td><td></td></tr><tr><td>FoxP3转录因子染色缓冲液套装&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td>固定/透化缓冲液和透化缓冲液</td></tr><tr><td>温控离心机</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT流式细胞仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>用于96孔板细胞体积定量计数&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠CD16/CD32（小鼠BD Fc阻断剂）&amp;nbsp;克隆2.4G2&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>553141</td><td>Fc阻断剂</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染色试剂盒，适用于紫外激发</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34962</td><td>可固定活力染色剂</td></tr><tr><td>CD45单克隆抗体（30-F11），APC-eFluor 780</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>47-0451-80</td><td></td></tr><tr><td>TCR β单克隆抗体（H57-597），APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8-&amp;alpha; 抗体（KT15），PE</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53473&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD4单克隆抗体（GK1.5），PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>MHC II类（I-A/I-E）单克隆抗体（M5/114.15.2），Alexa Fluor 700</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>56-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11c单克隆抗体（N418），PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>F4/80单克隆抗体（BM8），eFluor 450</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48-4801-80</td><td></td></tr><tr><td>CD11b单克隆抗体（M1/70），APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G（Gr-1）单克隆抗体（RB6-8C5），PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>CD274（PD-L1，B7-H1）单克隆抗体（MIH5），PE-Cyanine7</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25-5982-80</td><td></td></tr><tr><td>CD273（B7-DC）单克隆抗体（122），PerCP-eFluor 710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9972-82</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67单克隆抗体（B56），BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563755</td><td></td></tr></tbody></table>

在已建立的小鼠皮下肿瘤中富集与表征肿瘤免疫及非免疫微环境

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

肿瘤免疫微环境（TIME）近年来被认识到在实体瘤治疗反应中起关键作用，尤其是对免疫治疗而言。免疫治疗领域的最新临床进展凸显了建立可重复方法以准确、全面表征肿瘤及其相关免疫浸润的迫切需求。通过肿瘤酶解和流式细胞术分析，可对多种免疫细胞亚群及表型进行广泛表征；然而，分析深度常受限于荧光染料在抗体组合设计中的限制，以及为检测稀有免疫细胞群体而需获取较大肿瘤样本的要求。因此，我们开发了一种高效且高通量的方法，用于将肿瘤免疫浸润成分从非免疫性肿瘤组分中分离并富集。所述的肿瘤消化结合基于离心密度的分离技术，可分别对肿瘤组分与肿瘤免疫浸润组分进行表征，同时保持细胞活性，从而实现对肿瘤免疫状态的全面分析。该方法已被用于表征实体瘤中广泛存在的空间免疫异质性，进一步说明了建立一致性的全肿瘤免疫谱型分析技术的重要性。总体而言，该方法为皮下移植的实体小鼠肿瘤免疫学特征的表征提供了一种高效且可灵活调整的技术手段；因此，该工具可用于更精确地刻画肿瘤免疫学特征，并用于新型免疫治疗策略的临床前评估。

我们的结果表明，如本方案所述，将肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）从非免疫性肿瘤组分中分离具有显著优势。此外，通过所描述的方法，我们展示了已建立的实体瘤在免疫学上存在显著的异质性。
许多肿瘤解离技术存在一个显著问题，即样本活力下降，这通常是由于消化条件过于剧烈所致即， 高温，营养供应不足 等等。）。采用所述消化方法，无论是否结合密度梯度介质富集，经流式细胞术评估，可获得约70–90%的总细胞活力图1A）。在TIL富集组分和肿瘤富集组分中观察到相似的存活率，表明该方法总体毒性极低（图1A, 图2C）。此外，与未富集的肿瘤消化物相比，在分析的活细胞总数...

本文介绍一种分离和富集已建立的皮下肿瘤中肿瘤免疫及非免疫微环境组分的方法。该技术可分别分析肿瘤免疫浸润细胞和非免疫肿瘤组分，从而实现对肿瘤免疫微环境的全面表征。

肿瘤免疫微环境（TIME）近年来被公认为是实体瘤治疗反应的关键调节因素，尤其是对于……

该技术的总体目标是提供一种方法，用于同时分析对实体瘤免疫微环境有贡献的免疫细胞和肿瘤细胞组分。该方法有助于回答肿瘤免疫学领域中的关键问题，例如在特定治疗后肿瘤内发生的免疫及非免疫序列性变化。该技术的主要优势在于能够有效富集肿瘤中的免疫和非免疫组分，从而全面表征肿瘤的免疫状态。本方法的总体目标是高效地分析肿瘤免疫微环境，并识别治疗引起的改变。用70%乙醇喷洒小鼠以防止毛发污染后，手术切除皮下肿瘤，注意确保肿瘤不含有任何污染组织。然后，将每个肿瘤置于冰上的24孔板的独立孔中，每孔含有1.8毫升不含胎牛血清的基础RPMI 1640培养基。当所有肿瘤样本收集完毕后，使用剪刀将样本切成小于1立方毫米的组织块，并向每孔加入200微升新配制的10倍解离混合液，其中包含胶原酶-1、胶原酶-4和DNase I。在37摄氏度、60至100转/分钟的轨道摇床上孵育1小时后，加入1毫升添加了5%胎牛血清（FBS）和2毫摩尔EDTA的RPMI 1640培养基以中和反应，并使用经改造的1毫升移液枪头将每份肿瘤悬液转移至分别装有40微米细胞滤网的50毫升锥形管中。使用10毫升注射器活塞通过滤网对肿瘤组织进行机械解离，期间定期用2毫升含5%FBS的RPMI 1640培养基冲洗每个滤网，直至滤网上无残留肿瘤组织。当所有肿瘤组织均完成解离后，根据需要向各离心管中添加培养基，使所有样品的体积相同，随后通过离心沉淀细胞。然后，使用5毫升血清移液管，按照每管2毫升的量，将沉淀重悬于含胎牛血清（FBS）的培养基中。为分离免疫细胞与肿瘤细胞组分，按每份样品取1个15毫升锥形管，在每管底部加入3毫升密度梯度介质，再沿管壁缓慢将2毫升肿瘤细胞悬液轻轻铺于密度梯度介质之上。在分层前，务必确保肿瘤细胞悬液充分混匀；将细胞悬液沿管壁缓慢加入，避免扰动分层；操作过程中应小心处理离心管，防止各层混合。通过密度梯度离心法分离细胞，并小心收集上层培养基和肿瘤浸润白细胞层，每份样本分别收集至新的15毫升离心管中。弃去剩余的密度梯度介质，每管中加入含FBS的2毫升培养基重悬肿瘤细胞沉淀。然后，将所有样品离心，并将肿瘤浸润白细胞重悬于每管200 µL、肿瘤细胞重悬于每管2 mL含FBS的培养基中，置于冰上。为进行细胞铺板，为每种免疫染色面板标记一块96孔U型底板，并额外准备一块用于细胞计数的板，将单细胞悬液分装至各染色面板板孔及计数板中。每份样品用200 µL Dulbecco's PBS洗涤细胞两次，并在每孔中加入50 µL FC阻断剂，在4°C下封闭20分钟。封闭孵育结束后，向每孔加入50微升2倍浓缩的细胞外标记抗体与可固定活力染料的混合液，在避光条件下孵育30分钟。染色孵育结束后，用FACS缓冲液将样品洗涤两次，并将细胞沉淀重悬于200微升固定和透化溶液中，于4摄氏度避光过夜。次日，通过离心收集细胞，随后每孔用200微升透化缓冲液洗涤一次。在避光条件下，用含有100微升胞内抗体染色组合的破膜缓冲液对细胞进行标记，孵育30分钟，随后再用破膜缓冲液洗涤一次。接着，用FACS缓冲液再次洗涤细胞，并将样本重悬于300微升新鲜FACS缓冲液中，用于流式细胞术分析。如所示，肿瘤组织消化（无论是否使用密度梯度介质富集）后，通过流式细胞术评估，可获得约70%至90%活力的完整肿瘤细胞群体。与未经富集的肿瘤消化物相比，密度梯度介质富集可使CD45阳性肿瘤浸润白细胞组分增加两倍以上，并能富集在免疫微环境研究中常见的多种免疫细胞亚群。CD45阴性肿瘤细胞组分也可用于分析多种肿瘤特征，例如总体肿瘤活力或凋亡情况、增殖能力，以及多种免疫抑制标志物的表达水平。为确定髓系和淋巴细胞免疫亚群在单个实体瘤内的分布差异，可将肿瘤均分为四个部分，使每个部分包含大致相等的瘤内区域，以及相等的真皮侧和腹膜侧组织部分。随后可分别消化并分析每一块组织，以检测不同免疫细胞群体的存在情况，如文中所示。掌握该技术后，根据样本数量的多少，可在4至8小时内完成操作。在进行该操作时，为保持细胞活性，需注意快速而高效地操作。该方法的可视化演示至关重要，因为解离和分离步骤涉及仅靠文字描述难以掌握的技术。按照本实验流程，可进一步通过流式细胞术分析肿瘤内细胞群体的变化情况，包括其丰度和表型特征。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用所示的消化及密度梯度分离技术，分离并分析已建立的皮下小鼠肿瘤中的免疫组分与非免疫组分。

enrichment-characterization-tumor-immune-non-immune-microenvironments

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

肿瘤免疫和非免疫微环境在小鼠皮下肿瘤中的富集与鉴定

本报告中，我们描述了一种用于分离高度纯化的肿瘤浸润白细胞群体的实验方案。该方案改编自 Miltenyi Biotech...

从原发性肿瘤中分离免疫细胞

本视频展示了在皮下肿瘤未完全切除的小鼠模型中，测试辅助治疗或附加疗法的效果。对部分肿瘤切除的小鼠给予靶向调节性T细胞抗细胞毒性蛋白的抗体治疗，可能减少肿瘤再生长，提示该疗法具有有效的辅助治疗潜力。...

小鼠皮下不完全切除肿瘤模型中的辅助治疗方案

本方案描述了一种在小鼠肿瘤模型中对肿瘤微环境内白细胞亚群进行详细评估的方法。将表达chemerin的B16黑色素瘤细胞皮下植入同源小鼠体内。随后对来自肿瘤微环境的细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析，从而实现对白细胞亚群的详细分析。...

皮下肿瘤模型中肿瘤浸润白细胞亚群的评估

我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来模拟肿瘤微环境（TME）。该模型包含混合细胞培养体系，可在无需荧光标记或细胞分选的情况下，简便地获得高度富集的单一细胞群体，并允许在正常或应激条件下研究肿瘤微环境中细胞间的相互通讯。...

肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

本文介绍了一种可重复建立头颈部鳞状细胞癌小鼠原位模型的方法。所形成的肿瘤表现出与临床疾病相关的组织病理学特征，包括坏死、分化不良、淋巴结转移以及免疫细胞浸润。荷瘤小鼠出现与临床相关的症状，如吞咽困难、下颌移位和体重减轻。...

小鼠鳞状细胞癌细胞黏膜内接种用于肿瘤免疫谱分析及治疗反应评估

本方案描述了原位胰腺肿瘤的手术建立方法以及新鲜分离的小鼠胰腺肿瘤的快速消化过程。消化后，可获取具有活性的免疫细胞群体，用于后续分析，包括 离体...

原位胰腺肿瘤的构建与 离体 肿瘤浸润性T细胞毒性的表征

本文介绍了一种用于在小鼠肿瘤模型中表征肿瘤固有及外周来源的肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤移植方案。通过流式细胞术特异性追踪受体来源免疫细胞的浸润，可揭示这些细胞在抗肿瘤免疫应答过程中表型与功能变化的动力学特征。...

小鼠肿瘤浸润性CD8+ T细胞动态评估的肿瘤移植方法

本文描述了一种标准方案，用于在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）同源小鼠模型中研究IL-1α的抗肿瘤活性及其相关毒性。...

评估 体内 聚酸酐IL-1α纳米颗粒的抗肿瘤活性

本方案介绍了一种利用表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤细胞进行细胞型肿瘤疫苗接种的癌症免疫治疗模型。该方案演示了包括培养肿瘤细胞的制备、肿瘤植入、细胞辐照、肿瘤生长测量、瘤内免疫细胞的分离以及流式细胞术分析在内的各项操作步骤。...

利用造血细胞因子进行肿瘤疫苗接种的实验性黑色素瘤免疫治疗模型

本方案概述了用于免疫肿瘤学研究的人源化免疫系统（HIS）小鼠的构建方法。本文介绍了在此模型中移植人源肿瘤并用于测试人源免疫治疗药物的操作步骤和注意事项，重点在于表征人源免疫系统对肿瘤的应答反应。...

在携带人源肿瘤的人源化小鼠模型中测试癌症免疫治疗药物

随着人们对肿瘤内免疫治疗的兴趣日益增加，选择易于操作且实用的肿瘤模型至关重要。皮下肿瘤虽然易于建立，但难以观察和操作。在本方案中，我们描述了建立皮内肿瘤的方法，该方法可提供更佳的可见性和可及性。...

皮内肿瘤移植作为小鼠肿瘤内免疫治疗研究的稳健模型

学习使用密度梯度离心法分离小鼠皮下肿瘤中的免疫细胞和肿瘤细胞组分，实现肿瘤免疫微环境的全面分析。该方法可有效富集肿瘤免疫与非免疫成分，帮助研究人员深入理解肿瘤免疫状态及治疗诱导的变化。

在已建立的小鼠皮下肿瘤中富集与表征肿瘤免疫及非免疫微环境

探索更多视频