Name: 促纤维化信号增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞再编程诱导心肌细胞的抑制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 了解通过过表达转录因子和微RNA将小鼠胚胎成纤维细胞高效重编程为功能性心肌细胞的方法。该技术可在7天内产生跳动的心肌细胞，效率高达60%，为心脏修复和再生医学研究提供了重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究获得了博特彻基金会韦伯-沃林生物医学研究计划、美国心脏协会科学家发展基金（13SDG17400031）、科罗拉多大学医学院杰出早期职业学者计划、科罗拉多大学心脏病学部Barlow Nyle捐赠基金以及美国国立卫生研究院R01HL133230（资助对象：K.S.）的支持。A.S.R. 获得了美国国立卫生研究院/国家转化科学促进中心科罗拉多临床与转化科学奖（TL1TR001081）以及科罗拉多大学纤维化研究联盟博士前奖学金的资助。 &amp;#38; 翻译（CFReT）。本研究还得到了癌症中心支持基金（P30CA046934）、皮肤疾病研究核心基金（P30AR057212）以及科罗拉多大学安舒茨医学校区流式细胞术核心实验室的支持。

所有需要使用动物的实验均经科罗拉多大学丹佛分校安舒茨医学校区机构动物护理和使用委员会批准。
1. 胚胎成纤维细胞（MEFs）的分离
<ol>
	<li>购买E13天的C57BL/6妊娠小鼠，进行隔夜运输。</li>
	<li>根据批准的IACUC方案对母体实施安乐死（例如：约1.3 L/min CO₂）2 直到动物看似死亡后，再进行颈椎脱位</li>
	<li>用70%乙醇喷洒母鼠并打开腹腔。取出含有胚胎的子宫角，置于含无菌PBS的10 cm培养皿中。</li>
	<li>在胚囊上做切口以释放胚胎。将胚胎转移至含有无菌PBS的洁净10 cm培养皿中，充分冲洗。</li>
	<li>在肝脏下方切断躯体，弃去头部和上半身。取出内脏器官并弃去。将剩余组织转移至含无菌PBS的洁净10 cm培养皿中，并将培养皿移至生物安全等级1级或2级操作台。将所有胚胎的组织合并于一个洁净干燥的10 cm培养皿中，切碎成细小组织块。</li>
	<li>向切碎的胚胎中加入6 mL 0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA，用移液器反复吹打数次以分散组织。在37 ˚C、5% CO₂条件下孵育40分钟。2.</li>
	<li>在生长培养基中重悬细胞（表1根据收获的胚胎数量调整培养基体积。通常，每1.2个胚胎使用约25 mL培养基。</li>
	<li>在15 cm培养皿中接种25 mL重悬细胞。24小时后，吸除培养基，每皿加入25 mL新鲜生长培养基。</li>
	<li>72小时后，向每个15 cm培养皿中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA。待细胞从培养皿脱落时，用15 mL生长培养基终止胰蛋白酶作用，并将细胞收集至50 mL聚苯乙烯圆锥形管中。以160 × g离心3分钟。 g 在室温下将细胞沉淀重悬于生长培养基中，并通过70 µm孔径的细胞筛过滤。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）以每份200万个细胞的数量加入冻存液（10% DMSO，25% FBS溶于高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM））中，于-80 °C冻存。24小时后转移至液氮中保存，直至使用。 
	注意：采用本方案分离的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）通过RNA测序（RNA-seq）进行全基因表达谱分析，以确保细胞鉴定。来自ENCODE项目的MEF细胞RNA-seq数据从美国国立卫生研究院（NIH）基因表达综合数据库（GEO）下载，登录号为GSE93454。我们所用MEF细胞的RNA-seq基因表达数据已存入NIH GEO数据库，登录号为GSE71405。这两个数据集根据共同的基因符号进行合并。表达数据经对数转换后，绘制我们所用MEF细胞与ENCODE MEF细胞表达数据的散点图，并拟合线性回归直线。图1A采用本方案分离的MEFs在分子水平上与其他实验室分离的MEFs具有相似性。</li>
</ol>
2. 逆转录病毒的制备及小鼠胚胎成纤维细胞的转导
注意：本节所有步骤必须在生物安全二级柜中进行。由于本实验方案使用了逆转录病毒转导，因此需采取安全预防措施，包括用10%漂白剂处理所有含有病毒培养基的废弃物，作用时间至少20分钟。重编程的时间线请参见图1B。
<ol>
	<li>使用Platinum E（PE）细胞系生产逆转录病毒
	<ol>
		<li>将市售的PE细胞维持在PE培养基中（表1含有杀稻瘟菌素和嘌呤霉素筛选标记，以确保表达 gag-pol 和 环境 用于高效逆转录病毒颗粒产生的基因36每两天以1:4或1:5的比例传代细胞。注意避免细胞过度生长，因为这会降低逆转录病毒的产量。</li>
		<li>在第-1天，接种约5 x 106 每10 cm培养皿中的细胞数，在生长培养基中（表1) 转染前16-20小时（参见 表 2 （适用于其他标准细胞培养皿规格的接种密度）。轻轻前后摇晃培养皿数次，然后小心放入37 °C、5% CO₂的培养箱中2 孵育器以确保铺板均匀（参见 图1C 转染前的最佳铺板密度）。 
		注意：转染前，务必在不含筛选标记物的培养基中接种PE细胞，以确保含有生成的逆转录病毒颗粒的培养基不会杀死MEF细胞。</li>
		<li>第0天，准备用于转染的DNA。对于10 cm培养皿的转染，将2 µg每种重编程因子——GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1和miR-133（GHMT2m）——加入一个1.5 mL离心管中。 
		注意：请参阅 表 2 以确定转染其他标准细胞培养皿尺寸所需的DNA用量。</li>
		<li>在另一个1.5 mL离心管中，加入360 µL低血清培养基。然后将36 µL转染试剂直接加入低血清培养基中。轻轻弹动离心管，室温孵育5分钟。 
		注意：为避免转染效率降低，需将转染试剂直接小心地加入低血清培养基中。</li>
		<li>将低血清培养基/转染试剂混合物加入 GHMT2m DNA 混合液中。轻轻弹动离心管，室温孵育 15 分钟。禁止涡旋振荡。</li>
		<li>将反应混合物逐滴加入PE细胞中，轻轻摇动培养基10–15秒，然后置于37 °C、5% CO₂培养箱中2 培养箱 
		注意：根据制造商说明，PE细胞产生的平均滴度为106 至 107 感染单位/毫升。该方案可产生约 2 x 106 感染单位/mL，24小时达到6 × 106 48小时时感染单位为/mL，平均MOI为4。如需要，GFP/DsRed转染也可用作转染/转导效率的替代指标；预计48小时时转染效率将超过90%（图1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MEFs 的转导
	<ol>
		<li>第0天，用胶原蛋白包被培养皿，并置于37 °C、5% CO₂培养箱中2 孵育器中孵育至少 2 小时。</li>
		<li>从液氮中取出MEFs并解冻。接种0.2 x 106 每60 mm培养皿接种细胞，加入生长培养基。轻轻摇动培养板以确保细胞分布均匀，随后放入培养箱中（参见 图1C 最佳铺板密度 表2 （适用于其他标准细胞培养皿尺寸的接种密度）。 
		注意：这些铺板密度已在多批次分离的MEFs中进行过测试；除非MEFs的存活率出现明显下降，否则无需调整细胞接种密度。</li>
		<li>第1天，转染后24 h，使用30 mL注射器收集PE细胞产生的逆转录病毒培养基。将培养基经0.45 µm孔径滤器过滤至50 mL锥形管中。加入六甲基溴化铵转染试剂，终浓度为6 µg/mL。用移液器将10 mL新鲜生长培养基沿培养皿壁缓慢加入，以避免细胞移位。</li>
		<li>吸弃MEFs中的培养基，每皿加入4 mL新鲜收集的逆转录病毒培养基。将MEFs放回培养箱。所有接触过病毒培养基的材料均需用10%漂白液处理，以灭活逆转录病毒颗粒。</li>
		<li>第2天，转染后48 h，重复步骤2.2.2和2.2.3。PE细胞在第2次处理后弃去nd 收集逆转录病毒培养基。 
		注意：将10%漂白剂加入废弃的PE细胞中，作用至少20分钟，以灭活不需要的逆转录病毒。</li>
		<li>第3天，吸除MEFs的培养基，并加入4 mL iCM培养基（表1) 加入含有0.5 µM A-83-01（TGF-β I型受体抑制剂）的iCM培养基。每2天更换一次含A-83-01的iCM培养基。 
		注意：如果使用GFP作为转导对照，此时预期表达率应超过90%（图1C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 心脏标志物的流式细胞术
<ol>
	<li>吸除第9天重编程MEFs的培养基，并用1× PBS洗涤一次，以去除死细胞和碎片。</li>
	<li>加入1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA，37 ˚C孵育5分钟。在光学显微镜下观察细胞并轻轻摇晃培养皿；若细胞仍贴壁，于37 ˚C继续孵育5分钟，直至细胞脱落。</li>
	<li>用含5% FBS的1×PBS洗涤细胞，并通过70 µm孔径的细胞滤筛过滤。</li>
	<li>以 160 x g 离心 g 室温下孵育3分钟，然后从沉淀中吸去液体。 
	注意：为提高细胞得率，离心后在细胞沉淀上方保留约 50 µL 液体。</li>
	<li>用含有1% BSA的500 µL 1x PBS洗涤细胞。</li>
	<li>将细胞与0.2 mL/百万细胞的固定液在冰上孵育20分钟以固定细胞。</li>
	<li>加入1 mL预冷的1×破膜/洗涤缓冲液。 
	注意：厂家提供的溶液为10倍浓缩液。</li>
	<li>以 160 x g 离心细胞 g 4 °C下离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>重复步骤 3.7 和 3.8 一次。在第二次nd 洗涤后，直接进行下一步操作，或在4 °C下保存细胞过夜。</li>
	<li>用100 µL含5%山羊血清和驴血清的1×透化/洗涤缓冲液，室温封闭30分钟。</li>
	<li>加入100 µL稀释的一抗。 
	注意：本实验方案中，细胞使用小鼠抗肌钙蛋白T抗体（1:200）和小鼠抗α-肌动蛋白抗体（1:200）进行标记，以定量分析表达心肌肌节关键组分的细胞百分比。一抗在室温下孵育1小时。</li>
	<li>以 160 x g 离心细胞 g 4 °C 下孵育 5 分钟，吸除上清液，用预冷的破膜/洗涤缓冲液洗涤 2 次。</li>
	<li>加入100 µL稀释的二抗。 
	注意：本实验方案中，细胞使用抗小鼠647 nm二抗（1:200）进行标记。将二抗于室温下在翻转式管式旋转仪上孵育45分钟。用铝箔包裹管子以避光保护细胞。</li>
	<li>以 160 x g 离心细胞 g 4 °C下离心5分钟，吸除上清液，用预冷的破膜/洗涤缓冲液洗涤2次。</li>
	<li>加入1 mL含1% BSA的PBS，立即进行流式细胞术分析。 
	注意：进行流式细胞术分选（FACS）时，首先生成前向散射光与侧向散射光图以圈选活细胞。或者，在固定细胞前可使用 commercially available 的活/死细胞染料，以区分活细胞与死细胞群体。</li>
</ol>
4. 重编程MEF的免疫染色
<ol>
	<li>吸去第14天重编程MEF的培养基，用1 mL预冷的1×PBS洗涤一次。 
	注意：进行免疫染色时，重编程在12孔板中进行，以尽量减少抗体溶液用量。也可使用24孔板，只需将以下所有体积减半。</li>
	<li>吸去PBS，加入500 µL 2%多聚甲醛，室温固定10分钟。</li>
	<li>吸去固定液，用1 mL 1×PBS洗涤细胞3次（每次5分钟，室温）。</li>
	<li>加入500 µL含0.2%通透试剂的PBS，室温通透15分钟。</li>
	<li>吸去通透液，加入500 µL含10%马血清的PBS，室温封闭30分钟。</li>
	<li>吸去封闭液，加入500 µL稀释的一抗溶液，室温孵育1小时。 
	注意：本实验中，细胞使用小鼠来源的肌钙蛋白T或α-肌动蛋白（均为1:400稀释）进行标记，并与连接蛋白43（1:400）或肌钙蛋白I（1:400）共标记。</li>
	<li>吸去一抗溶液，用1 mL 1×PBS洗涤3次（每次5分钟，室温）。</li>
	<li>吸去PBS，加入500 µL稀释的二抗溶液，室温避光孵育1小时。 
	注意：本实验中，使用抗小鼠IgG 555 nm荧光二抗（1:800）识别肌钙蛋白T或α-肌动蛋白，使用抗兔IgG 488 nm荧光二抗（1:800）识别连接蛋白43或肌钙蛋白I。此外，使用Hoechst染色细胞核（1:10,000）。孵育过程中需避光处理。</li>
	<li>吸去二抗溶液，用1 mL 1×PBS洗涤3次（每次5分钟，室温）。用铝箔包裹培养板以避光，并于4 °C保存。</li>
	<li>使用三通道落射荧光显微镜成像。</li>
</ol>
5. 钙成像
注意：如果使用10倍放大倍数进行成像，标准的细胞培养皿和培养板适用于钙成像。高倍放大成像则需要将细胞接种在玻璃盖玻片或玻璃底培养皿上。
<ol>
	<li>吸弃培养基，向搏动的iCMs（D14至D20）中加入2 mL（6孔板用量）含5 µM Fura-2 AM和0.1% Pluronic F-127的改良Tyrode's溶液（140 mM NaCl、5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM葡萄糖、10 mM HEPES、0.1% BSA和1%丙酮酸，pH 7.4）。在37 °C下孵育30分钟。 
	注意：需避光操作，以防止荧光指示剂淬灭。</li>
	<li>在室温下用2 mL Tyrode's溶液洗涤细胞30分钟，以使Fura-2 AM完成去酯化。</li>
	<li>使用Slidebook 5.5 Ca2+成像软件，在340 nm和380 nm激发光下通过转盘共聚焦显微镜进行成像。成像过程在室温下进行。</li>
	<li>钙瞬变通过340 nm处的荧光强度与380 nm处的荧光强度的比值计算得出。</li>
	<li>如需干预，在记录基础钙瞬变后，可对iCMs加入1或2 µM异丙肾上腺素或10 µM硝苯地平以调节钙处理能力。将化合物局部添加至细胞并进行成像。</li>
</ol>

<ol><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 136 (20), (2017).</li>
<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16003373">Regenerating the heart.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).</li>
<li>Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+muscle+regeneration%3A+lessons+from+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Cardiac muscle regeneration: lessons from development.</a> Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).</li>
<li>Nabel, E. G., Braunwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+coronary+artery+disease+and+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A tale of coronary artery disease and myocardial infarction.</a> N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).</li>
<li>Packer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+carvedilol+on+the+morbidity+of+patients+with+severe+chronic+heart+failure%3A+results+of+the+carvedilol+prospective+randomized+cumulative+survival+%28COPERNICUS%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study.</a> Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).</li>
<li>The CAPRICORN Investigators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+carvedilol+on+outcome+after+myocardial+infarction+in+patients+with+left-ventricular+dysfunction%3A+the+CAPRICORN+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial.</a> The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).</li>
<li>Marangou, J., Paul, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+attitudes+on+cardiac+devices+in+heart+failure%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Ther%22%5BJournal%5D)">Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review.</a> Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).</li>
<li>Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mending+broken+hearts%3A+cardiac+development+as+a+basis+for+adult+heart+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).</li>
<li>Wollert, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15246726">Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial.</a> Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).</li>
<li>Schachinger, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16990384">Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction.</a> N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).</li>
<li>Huikuri, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracoronary+injection+of+mononuclear+bone+marrow+cells+on+left+ventricular+function%2C+arrhythmia+risk+profile%2C+and+restenosis+after+thrombolytic+therapy+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).</li>
<li>Janssens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+bone+marrow-derived+stem-cell+transfer+in+patients+with+ST-segment+elevation+myocardial+infarction%3A+double-blind%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial.</a> Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).</li>
<li>Lunde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+injection+of+mononuclear+bone+marrow+cells+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction.</a> N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).</li>
<li>Hirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+autologous+mononuclear+bone+marrow+cells+or+peripheral+mononuclear+blood+cells+after+primary+percutaneous+coronary+intervention%3A+rationale+and+design+of+the+HEBE+trial+-+a+prospective%2C+multicenter%2C+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial.</a> Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).</li>
<li>Hirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+mononuclear+cells+from+bone+marrow+or+peripheral+blood+compared+with+standard+therapy+in+patients+after+acute+myocardial+infarction+treated+by+primary+percutaneous+coronary+intervention%3A+results+of+the+randomized+controlled+HEBE+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial.</a> Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).</li>
<li>Karantalis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stem+cells+produce+concordant+improvements+in+regional+function%2C+tissue+perfusion%2C+and+fibrotic+burden+when+administered+to+patients+undergoing+coronary+artery+bypass+grafting%3A+The+Prospective+Randomized+Study+of+Mesenchymal+Stem+Cell+Therapy+in+Patients+Undergoing+Cardiac+Surgery+%28PROMETHEUS%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial.</a> Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone%2C+Heart%2C+and+Other+Mesoderm+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. 166 (2), 451-467 (2016).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+A+source+of+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">iPS cells: A source of cardiac regeneration.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538, 388-391 (2016).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 357-386 (2010).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li>
<li>Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+with+the+MyoD+transactivation+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).</li>
<li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).</li>
<li>Addis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+direct+fibroblast+reprogramming+to+cardiomyocytes+using+calcium+activity+as+a+functional+measure+of+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).</li>
<li>Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+TGF%CE%B2+signaling+increases+direct+conversion+of+fibroblasts+to+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes.</a> PLoS One. 9 (2), e89678(2014).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+Is+a+Key+Epigenetic+Barrier+to+Direct+Cardiac+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).</li>
<li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+MYOCD%2C+SRF%2C+Mesp1+and+SMARCD3+enhance+the+cardio-inducing+effect+of+GATA4%2C+TBX5%2C+and+MEF2C+during+direct+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming.</a> PLoS One. 8 (5), e63577(2013).</li>
<li>Jayawardena, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+induced+cardiac+reprogramming+in+vivo%3A+evidence+for+mature+cardiac+myocytes+and+improved+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function.</a> Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).</li>
<li>Jayawardena, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+in+vitro+and+in+vivo+direct+reprogramming+of+cardiac+fibroblasts+to+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes.</a> Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocytes+requires+suppression+of+pro-fibrotic+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling.</a> Nature Communications. 6, 1-15 (2015).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).</li>
<li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1%2Fprotein+kinase+B+enhances+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN281+enhances+cardiac+reprogramming+by+modulating+cardiac+and+inflammatory+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression.</a> Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).</li>
<li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Enhancement+of+In+Vitro+and+In+Vivo+Direct+Cardiac+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming.</a> Circulation. 135, 978-995 (2017).</li>
<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485, 593-598 (2012).</li>
<li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+reprogramming+to+transdifferentiate+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+adenoviral+vectors%3A+Implications+for+clinical+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究提出了一种高效策略，通过递送GHMT2m重编程因子并联合抑制促纤维化信号通路，直接将成纤维细胞重编程为功能性诱导心肌细胞（iCMs）。利用流式细胞术、免疫荧光成像、钙成像和搏动细胞计数，我们证明该方案中大多数细胞成功完成了重编程，并获得了心肌细胞谱系命运。我们先前已证实，加入抗纤维化化合物（包括TGF-β I型受体抑制剂A-83-01）后，相较于仅转导GHMT2m，搏动性iCMs的数量可提高约6倍，表明促纤维化信号是心脏重编程过程中一种强烈的内源性屏障。因此，该系统可用于药物筛选，以研究调控心肌发生的机制；在A-83-01基础上添加小分子化合物，可能揭示心肌发生的负调控因子；相反，在仅使用GHMT2m的基础上添加小分子化合物，则可能阐明心肌发生的正调控因子。解析这些正负调控因子调控心肌细胞分化的机制，将有助于更深入理解心肌发生过程，并推动更高效的心肌细胞重编程与成熟方案的建立。
许多变量会影响重编程效率。我们发现，细胞接种密度对PE细胞中逆转录病毒颗粒的产生以及MEF细胞对所有重编程因子的有效摄取均有显著影响。此外，传代次数也可能影响这些参数。为确保病毒颗粒的最佳产生，应在P...

缺血性心脏病是美国的主要死亡原因1。每年约有80万美国人经历首次或复发性心肌梗死（MI）1。心肌梗死后，心肌细胞（CMs）死亡以及由活化的心脏成纤维细胞沉积的心脏纤维化会损害心脏功能2,3。由于成年心肌细胞再生能力较差，心肌梗死后心力衰竭的进展在很大程度上是不可逆的4,5。尽管目前的临床治疗可延缓疾病进展并降低未来心脏事件的风险6,7,8,9，但由于无法在梗死后再生心肌细胞，尚无任何疗法能够逆转疾病的进展10。新型细胞疗法正在兴起，用于心肌梗死后患者的治疗。然而令人失望的是，迄今为止在心肌梗死后向心脏输送干细胞的临床试验均未显示出明确的再生潜力11,12,13,14,15,16,17,18。
通过过表达四种转录因子将成纤维细胞重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSCs），最初由Takahashi &amp;#38; Yamanaka 实现，这一成果为细胞治疗领域的新突破打开了大门19。这些细胞能够分化为所有三个胚层19，并且已有多种高效方法被用于大量生成心肌细胞（CMs）20,21。由hiPSCs衍生的心肌细胞（hiPS-CMs）为研究心肌发生提供了强有力的平台，并可能在心脏损伤后的修复中发挥重要作用。然而，目前hiPS-CMs在转化应用方面仍面临挑战，包括存在畸胎瘤形成的风险22，以及其未成熟特性可能导致心律失常23。将成纤维细胞重编程为hiPSCs的研究激发了人们将成纤维细胞直接转化为其他细胞类型的兴趣。Ieda et al. 证明，在成纤维细胞中过表达GATA4、Mef2c和Tbx5（GMT）可实现向心肌谱系的直接重编程，尽管效率较低24。通过加入Hand2（GHMT）可提高重编程效率25。自这些早期研究以来，大量文献表明，通过调整重编程因子组合，如添加其他转录因子26,27,28,29、染色质修饰因子30,31、microRNA32,33或小分子化合物34，均可提高重编程效率和/或促进诱导性心肌样细胞（iCMs）的成熟。
本文提供了一种高效地从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）诱导生成诱导性心肌细胞（iCMs）的详细实验方案。我们先前的研究表明，通过添加miR-1和miR-133，GHMT转录因子组合（GHMT2m）的重编程效率显著提高；当进一步抑制促纤维化信号通路（如转化生长因子β（TGF-β）信号通路或Rho相关蛋白激酶（ROCK）信号通路）时，效率可进一步提升35。采用本方案，我们发现转导重编程因子并使用TGF-β I型受体抑制剂A-83-01处理后，最早在第11天即可观察到大量搏动细胞，其中约60%的细胞表达心肌肌钙蛋白T（cTnT），约50%表达α-辅肌动蛋白。此外，这些iCMs表达包括连接蛋白43（connexin 43）在内的缝隙连接蛋白，并表现出自发性收缩和钙瞬变现象。与早期研究相比，该方法显著提高了重编程效率，显示出从心肌梗死后心脏内残留的内源性细胞群体再生心肌细胞的巨大潜力。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Charles River's Laboratory</td><td>027</td><td>用于 MEF 分离</td></tr><tr><td>Platinum E (PE) 细胞</td><td>Cell Biolabs, INC</td><td>RV-101</td><td>用于逆转录病毒生产</td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Gibco</td><td>SH30022.FS</td><td>iCM、PE 和生长培养基的组分</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>iCM 培养基的组分</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td>iCM、PE 和生长培养基的组分</td></tr><tr><td>供体马血清</td><td>Gemini</td><td>100508 500</td><td>iCM 培养基的组分</td></tr><tr><td>MEM 必需氨基酸，50X</td><td>Life Technologies</td><td>11130051</td><td>iCM 培养基的组分</td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液，100X</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td>iCM 培养基组分及用于钙成像</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸，100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>iCM 培养基的组分</td></tr><tr><td>MEM 维生素溶液，100X</td><td>Life Technologies</td><td>11120-052</td><td>iCM 培养基的组分</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>iCM 培养基的组分</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>iCM 培养基的组分</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>iCM、PE 和生长培养基的组分</td></tr><tr><td>GlutaMAX（L-谷氨酰胺补充剂）</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>iCM、PE 和生长培养基的组分</td></tr><tr><td>Blasticidin-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td>PE 培养基的组分</td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>PE 培养基的组分</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>用于从培养皿中解离细胞</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R&amp;D Systems - Tocris</td><td>2939/10</td><td>处理细胞以抑制 TGF-&amp;beta; 信号通路——促进高效重编程。使用浓度为 0.5 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>85190</td><td>用于 A-83-01 的稀释和储存，以及冻存培养基的组分</td></tr><tr><td>SureCoat</td><td>Cellutron</td><td>SC-9035</td><td>用于包被培养皿以接种 MEF</td></tr><tr><td>FuGENE 6 转染试剂</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Opti-MEM 减血清培养基</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-GATA4</td><td></td><td></td><td>含有重编程因子的质粒</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Hand2</td><td></td><td></td><td>含有重编程因子的质粒</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Mef2c</td><td></td><td></td><td>含有重编程因子的质粒</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Tbx5</td><td></td><td></td><td>含有重编程因子的质粒</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-1</td><td></td><td></td><td>含有重编程因子的质粒</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-133</td><td></td><td></td><td>含有重编程因子的质粒</td></tr><tr><td>pBabe-X GFP</td><td></td><td></td><td>含有重编程因子的质粒</td></tr><tr><td>Polybrene（六亚甲基双胍溴化物）</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td>用于病毒感染诱导。使用浓度为 6 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>真空滤器 + 瓶子（0.22 &amp;micro;m 孔径）</td><td>Nalgene</td><td>&amp;nbsp;569-0020&amp;nbsp;</td><td>用于过滤培养基</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Bd Vacutainer Labware&amp;nbsp;</td><td>309654</td><td>用于病毒过滤</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Celltreat</td><td>229749</td><td>用于病毒过滤</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td>用于 MEF 分离和流式细胞术</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 溶液</td><td>BD</td><td>554722</td><td>用于流式细胞术前细胞的固定和通透</td></tr><tr><td>perm/wash 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>554723</td><td>用于流式细胞术中细胞的洗涤</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td>用于细胞洗涤</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>VWR</td><td>0332-100g</td><td>用于流式细胞术和钙成像</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G9023</td><td>用于流式细胞术前细胞的封闭</td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma</td><td>D9663-10mg</td><td>用于流式细胞术前细胞的封闭</td></tr><tr><td>小鼠肌钙蛋白 T</td><td>Thermo Scientific</td><td>ms-295-p</td><td>免疫荧光 1:400，流式细胞术 1:200</td></tr><tr><td>小鼠 &amp;alpha;-辅肌动蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7811L</td><td>免疫荧光 1:400，流式细胞术 1:200</td></tr><tr><td>兔 Connexin 43</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C6219</td><td>免疫荧光 1:400</td></tr><tr><td>兔肌钙蛋白 I</td><td>PhosphoSolutions</td><td>2010-TNI</td><td>免疫荧光 1:400</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td>免疫荧光 1:10000</td></tr><tr><td>Alexa 488，兔二抗</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td>免疫荧光 1:800</td></tr><tr><td>Alexa 555，小鼠二抗</td><td>Life Technologies</td><td>A-21422</td><td>免疫荧光 1:800</td></tr><tr><td>Alexa 647，小鼠二抗</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td>流式细胞术 1:200</td></tr><tr><td>27 色 ZE5 流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>用于 FACS</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>sigma</td><td>P6148-500mg</td><td>用于免疫荧光前细胞固定</td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td>用于免疫荧光前细胞通透</td></tr><tr><td>EVOS&amp;trade; FL 彩色成像系统</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEFC4300</td><td>用于免疫荧光</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020-5000</td><td>用于钙成像</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>395</td><td>用于钙成像</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td>用于钙成像</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>97061-352</td><td>用于钙成像</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>sigma</td><td>G7528-250g</td><td>用于钙成像</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>sigma</td><td>H4034-500g</td><td>用于钙成像</td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>用于钙成像</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250g</td><td>用于钙成像</td></tr><tr><td>硝苯地平</td><td>Sigma</td><td>N7634-1G</td><td>用于干扰 iCM 中的钙瞬变——使用浓度为 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>异丙肾上腺素</td><td>sigma</td><td>I6504-1g</td><td>用于增加 iCM 中钙瞬变的数量——使用浓度为 1-2 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Marianas 旋转盘共聚焦显微镜</td><td>3i</td><td></td><td>用于钙成像</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 细胞培养皿</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 细胞培养皿</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>12 孔细胞培养板</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>665180&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>662160&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

抑制促纤维化信号通路增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞向诱导型心肌细胞的重编程

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

一种体细胞类型转分化为另一种体细胞类型在人类疾病建模与治疗方面具有巨大潜力。先前研究表明，通过过表达包括GATA4、Hand2、Mef2c和Tbx5在内的心脏发生相关转录因子，小鼠胚胎、皮肤及心脏成纤维细胞均可被重编程为具有功能的诱导性心肌样细胞（iCMs） 体外 和 体内然而，以往的研究显示效率相对较低。为了在损伤后恢复心脏功能，必须阐明调控心脏重编程的机制，以提高诱导心肌细胞（iCMs）的重编程效率和成熟度。
我们先前已证明，抑制促纤维化信号通路可显著提高重编程效率。本文中，我们详细阐述了实现高达60%重编程效率的方法。此外，我们还描述了多种用于定量评估重编程效率及重编程后成纤维细胞成熟度的方法，包括流式细胞术、免疫荧光成像和钙成像。通过采用本文详述的实验方案，可开展机制性研究，以确定心脏重编程的正向与负向调控因子。此类研究有望鉴定出可靶向干预的信号通路，从而提升重编程效率与细胞成熟度，最终为治疗人类心脏病提供新型细胞疗法。

采用上述重编程策略及图1B所示方法，我们在GHMT2m转导后第9天通过流式细胞术定量发现，约70%的细胞表达心肌肌钙蛋白T，约55%的细胞表达心肌α-肌动蛋白（图2A和B）。此外，在转导后第14天，大多数细胞表达心肌肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、心肌α-肌动蛋白以及缝隙连接标志物Connexin 43（图2C和D）。高倍成像显示，细胞形成了清晰的肌节结构，并在相邻细胞之间形成缝隙连接（白色箭头，图2D）。此外，iCMs表现出自发性收缩及钙瞬变，表明其具有功能性（图3A–C和视频1）。
<p class="jove_content" fo:ke...

本文介绍一种通过过表达GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1和miR-133（GHMT2m）并同时抑制TGF-β信号通路，将原代胚胎成纤维细胞重编程为功能性心肌细胞的稳健方法。本方案在转导后最早7天即可生成搏动的心肌细胞，重编程效率高达60%。

一种体细胞类型向另一种体细胞类型的转分化在建模和治疗人类疾病方面具有巨大潜力。先前的研究表明……

该方法有助于回答心脏重编程领域中的关键问题，例如识别促进或修复心肌发生的通路。该技术的主要优势在于，我们能够以比以往发表的方法更高的效率生成具有功能的诱导性心肌细胞。化学性心脏疾病会导致心肌细胞丢失以及心脏功能受损。因此，该技术可能通过将成纤维细胞转化为功能性诱导心肌细胞，促进高效修复。开始生产逆转录病毒时，需在生物安全二级柜中，于10 cm培养皿内使用PE培养基培养Platinum E（PE）细胞，并加入筛选标记物。每两天传代一次细胞，传代比例为一比四或一比五。在计划转染的前一天，将PE细胞以10 mL生长培养基接种于10 cm培养皿中，然后轻轻前后摇动培养皿。将培养皿小心放入培养箱中，以使细胞均匀分布，并培养24小时。转染当天，将GHMT2M混合物加入一个1.5 mL离心管中。另取一个1.5 mL离心管，加入360 µL低血清培养基。随后，向低血清培养基中加入36 µL转染试剂，轻轻弹动离心管以混匀。室温孵育5分钟。此步骤中使用的转染试剂可与塑料结合。为避免影响转染效率，操作时需将转染试剂直接加入低血清培养基中，并注意不要让移液枪头接触离心管管壁。然后将减血清培养基与转染试剂的混合物加入含有 GHMT2M DNA 混合物的离心管中。轻轻弹动离心管以混匀，并在室温下孵育 15 分钟。最后将转染反应混合物逐滴加入 PE 细胞中。轻轻晃动培养皿10至15秒。将转染后的细胞在37摄氏度下孵育16至20小时。现在用胶原蛋白包被60 mm培养皿，并在37摄氏度下孵育，时间不少于2小时。然后将 freshly thawed 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种到包被有胶原的培养皿中，并加入生长培养基，使每 60 mm 培养皿的终体积为 4 mL。轻轻摇动培养皿，随后将其放入培养箱中。接种MEFs时，确保细胞均匀分布非常重要。避免旋转培养皿，以免造成细胞分布不均。应轻轻前后摇动培养皿，然后小心地将其放入培养箱中。转染PE细胞24小时后，使用30 mL注射器收集细胞产生的逆转录病毒培养基。将首次收集的逆转录病毒培养基通过孔径为45微米的滤器，滤入50 mL锥形管中。然后沿培养皿壁加入10 mL新鲜生长培养基，注意不要扰动PE细胞。将细胞在37摄氏度下继续孵育24小时。随后，向含有病毒上清液的50 mL锥形管中加入7.2 µL浓度为10 mg/mL的六亚甲基双溴乙锭（hexidine methrine bromide）转导试剂。现在吸除MEFs的培养基，并向培养皿中加入4 mL freshly harvested的逆转录病毒培养基。将细胞在37摄氏度下孵育24小时。PE细胞转染后48小时，收集逆转录病毒培养基，并以与第一次收集完全相同的方式进行转导。在第二次收集逆转录病毒培养基后弃去PE细胞，并向所有接触过逆转录病毒培养基的材料中加入10%漂白液。孵育后，从MEFs中吸除逆转

suppression-pro-fibrotic-signaling-potentiates-factor-mediated

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

促纤维化信号增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞再编程诱导心肌细胞的抑制

我们描述了一种基于小鼠胚胎干细胞的检测方法，用于确定在心源性诱导过程中Wnt/β-catenin和BMP信号激活的关键时间窗口。该方法提供了一个标准化平台，可可靠地量化心源性效率，并适用于其他细胞谱系的研究。...

改良的小鼠胚胎干细胞检测法用于量化心脏诱导效率

本文介绍了一种利用逆转录病毒介导的多顺反子载体递送Gata4、Tbx5和Mef2c来生成诱导心肌样细胞（iCMs）的实验方案。该方案可获得相对均一的重编程细胞群体，且重编程效率和细胞质量得到提升，对今后iCM重编程的研究具有重要价值。...

利用表达最佳比例Gata4、Mef2c和Tbx5的多顺反子载体改进诱导心肌细胞的生成

此处展示了一种用于可视化脱细胞心脏组织中细胞外基质超微结构的方法。...

利用扫描电子显微镜观察离解组织以可视化细胞外基质

本方案描述了一种可重复地分离成年小鼠心肌细胞并进行长期培养的逐步操作方法，具有较高的得率、纯度和细胞活性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与转导

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。...

利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

我们提出了三种新颖且更高效的方案，用于将人诱导性多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并提供了一种递送方法，通过结合细胞注射与补片介导的细胞因子递送，提高移植细胞的定植效率。...

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

本论文描述了一种利用逆转录病毒介导的Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5递送方法，逐步生成并定量多种重编程心脏亚型的实验方案。...

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

在本方案中，我们演示并详细阐述了如何利用人诱导性多能干细胞进行心肌细胞分化与纯化，以及如何通过Rho相关蛋白激酶抑制剂预处理，在小鼠心肌梗死模型中进一步提高其移植效率。...

通过瞬时抑制Rho激酶活性增强人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的移植存活

本方案通过强制表达转录因子GATA2、GFI1B和FOS，诱导人皮肤成纤维细胞启动造血程序，从而生成造血干细胞和祖细胞。...

通过强制表达转录因子实现人成纤维细胞的造血重编程

本文描述了一种Tg(Myh6-cre)1Jmk/J...

利用GCaMP3报告系统体外评估心脏重编程过程中的心肌特异性钙流

了解通过过表达转录因子和微RNA将小鼠胚胎成纤维细胞高效重编程为功能性心肌细胞的方法。该技术可在7天内产生跳动的心肌细胞，效率高达60%，为心脏修复和再生医学研究提供了重要工具。

抑制促纤维化信号通路增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞向诱导型心肌细胞的重编程

探索更多视频