Name: 人多潜能干细胞第一心场样心脏祖细胞和心室样细胞的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习利用Activin A和Id1过表达技术从人多潜能干细胞生成第一心场样心脏祖细胞和心室样细胞的方法。该技术可规模化制备特定心脏谱系细胞，适用于发育生物学研究、细胞治疗概念验证及心脏疾病模型构建。

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我们感谢 Colas 实验室的成员提供的有益讨论以及对本文手稿的审阅。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家环境卫生科学研究所（NIH/NIEHS）R44ES023521-02 项目和加州再生医学研究所（CIRM）DISC2-10110 项目对 Colas 博士的资助。

1. Id1 病毒的制备与感染
<ol>
	<li>通过将 pCMVDR8.74、pMD2.G 和 pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR（Addgene：质粒 #107735）共转染至 HEK293T 细胞中，生成 Id1 过表达的慢病毒。收集病毒颗粒，从上清液中过滤并纯化，然后于 -80 °C 保存，方法同 Kitamura 等 (2003)19或者，可将 pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR 载体送至慢病毒生产服务商，通过商业途径制备 Id1 慢病毒。 
	注意：请遵循慢病毒安全规范和标准操作规程。 
	注意：重要提示：最佳病毒滴度应至少达到 108 至 109 转导单位/毫升（TU/mL）</li>
	<li>感染前，将50 µl包被试剂加入96孔板的一个孔中进行包被，该试剂通常为Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的明胶状蛋白质混合物（参见 材料表).</li>
	<li>在6孔板中培养的一孔多能干细胞，通过加入1 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS进行解离2+ 和 Mg2+ 含0.5 mM EDTA。 
	注意：消化时间因情况而异，通常为 3–10 分钟。当超过 80% 的细胞从培养板底部脱落时，进行下一步操作。</li>
	<li>用无菌移液管将细胞悬液收集至15 mL塑料离心管中。</li>
	<li>用 5 mL 含钙 PBS 中和解离试剂2+ 和 Mg2+.</li>
	<li>离心沉淀细胞（200 × g，3 分钟）。</li>
	<li>移除上清液，轻轻弹击离心管，以松动沉淀物。</li>
	<li>在1 mL干细胞培养基中重悬细胞。</li>
	<li>使用自动细胞计数器，按照供应商说明书进行细胞计数。</li>
	<li>每孔（96孔板）接种20,000个活细胞于50 µL干细胞培养基中，培养基中添加2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂（参见 表1和表2).</li>
	<li>24 小时后，观察细胞贴壁情况，并更换为含有 2 µM RHO/ROCK 通路抑制剂和 6 ng/mL 己二甲溴铵的 100 µl 干细胞培养基（参见 表1 和 2），慢病毒转染前一小时。 
	注意：细胞应牢固贴附于培养板底部。</li>
	<li>将Id1慢病毒置于冰上解冻。</li>
	<li>每孔加入 3 µL 纯化的慢病毒（病毒滴度应在 108 到 109 TU/mL），然后将培养板放回细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中继续培养。2，20% O₂2).</li>
	<li>病毒感染后24小时，向感染的细胞中加入100 µL新鲜干细胞培养基。</li>
	<li>慢病毒感染48小时后，将含有病毒的培养基更换为200 µL新鲜干细胞培养基，其中添加1 µg/mL嘌呤霉素。</li>
	<li>每天更换培养基，加入200 µL干细胞培养基，并补充1 µg/mL嘌呤霉素。</li>
	<li>当细胞培养达到 80% 汇合度时，使用不含 Ca 的 200 µL PBS 解离细胞2+ 和 Mg2+ + 0.5 mM EDTA（适用于96孔板的一个孔）。</li>
	<li>将细胞悬液收集至离心管中。</li>
	<li>用 5 mL 含 Ca 的 PBS 中和解离试剂2+ 和 Mg2+.</li>
	<li>离心沉淀细胞（200 × g，3 分钟）。</li>
	<li>移除上清液，轻轻弹击离心管，以松动沉淀物。</li>
	<li>用添加了2 µM RHO/ROCK通路抑制剂的干细胞培养基重悬细胞，体积为1 mL。</li>
	<li>将所有细胞（1 mL）转移至12孔板中已包被的孔内。</li>
	<li>24小时后，观察细胞在孔板中的贴壁情况，并在转导前1小时更换为1 mL干细胞培养基，培养基中添加2 µM RHO/ROCK通路抑制剂和6 ng/mL六亚甲基溴化铵。</li>
	<li>将Id1慢病毒在冰上解冻。</li>
	<li>每孔加入 5 µL 纯化的病毒（12 孔板）。</li>
	<li>慢病毒感染24小时后，将含有病毒的培养基更换为1 mL新鲜干细胞培养基，其中添加3 µg/mL嘌呤霉素。</li>
	<li>慢病毒感染48小时后，将含有病毒的培养基更换为1 mL新鲜干细胞培养基，其中添加6 µg/mL嘌呤霉素。</li>
	<li>当细胞培养达到80%融合度时，使用500 µL不含Ca的PBS解离细胞2+ 和 Mg2+ 以及含0.5 mM EDTA（适用于12孔板的一个孔）。</li>
	<li>将一半（250 µL）细胞悬液转移至已包被试剂的6孔板的一个孔中，该孔内含有2 mL添加了2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂的干细胞培养基。</li>
	<li>使用剩余的一半样本（250 µL）进行RNA提取和qRT-PCR，以确定慢病毒介导的 Id1 表达水平，如 Colas 中所示 等 (2012)4. 
	注意：重要提示：如果 Id1 mRNA 表达水平低于 0.005 倍 GAPDH 表达水平（参见 表3 对于qRT-PCR引物），重复上述感染过程，直至Id1表达水平超过阈值。</li>
</ol>
2. hPSCsId1 的维持
<ol>
	<li>将hPSCsId1在包被的6孔板中培养，每孔加入3 mL干细胞培养基，并补充6 µg/mL嘌呤霉素。</li>
	<li>当hPSCsId1达到80%融合度时，使用无酶解离试剂按照生产商说明书将细胞以集落形式传代（1:6传代比例），每孔加入3 mL干细胞培养基，并补充6 µg/mL嘌呤霉素。</li>
</ol>
3. 分化前人多能干细胞Id1 的制备
<ol>
	<li>用包被试剂对12孔板进行包被，每孔500 µL。</li>
	<li>当hPSCsId1达到90%融合度时，通过每孔加入1 mL不含Ca2+和Mg2+但含有0.5 mM EDTA的PBS溶液，孵育5–10分钟使细胞解离。每隔1分钟检查一次解离情况，当80%的细胞已从培养板上脱落时，进行下一步操作。</li>
	<li>将细胞悬液收集至离心管中。</li>
	<li>加入5 mL含Ca2+和Mg2+的PBS以中和解离试剂。</li>
	<li>离心收集细胞（200 × g，3分钟）。</li>
	<li>弃去上清液，轻轻弹击离心管以松动细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞重悬于2 mL干细胞培养基中，培养基中添加2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
	<li>每孔接种300,000个细胞至1 mL干细胞培养基中，培养基中添加2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂和6 µg/mL嘌呤霉素，并将培养板转移至组织培养孵箱中。</li>
	<li>每日更换培养基，加入含6 µg/mL嘌呤霉素的2 mL干细胞培养基，直至细胞达到90%融合度。此时开始心肌细胞分化（下一步）。</li>
</ol>
4. 将hPSCsId1分化为第一心区样心脏前体细胞（FHF-L CPs）
<ol>
	<li>对于12孔板体系，在第0天启动分化，用1.5 mL添加了Activin A（100 ng/mL）的诱导培养基（表1）替换干细胞培养基（不同板型所需的推荐体积和Activin A浓度参见表2）。</li>
	<li>在第1天（启动分化24小时后），每孔12孔板更换为2 mL不含Activin A的诱导培养基。</li>
	<li>在第3天，每孔12孔板更换为2 mL不含Activin A的诱导培养基。</li>
	<li>在第5天，收集FHF-L CPs用于冷冻保存（下一步）。 
	注意：重要提示：建议在此阶段进行冷冻保存，因为这可以将心脏前体细胞的生成与后续心肌细胞的生产分离开来，并实现大量细胞批次的生物样本库储存。另请注意，第5天的FHF-L CPs也可转移至新包被的培养板以继续分化，具体操作请参阅步骤5.1–5.5以传代FHF-L CPs，然后进入步骤6.5继续分化。</li>
</ol>
5. FHF-L CPs 的冷冻保存
<ol>
	<li>吸弃含有第5天FHF-L CP的孔板中的全部培养基，迅速加入1 mL预热（37 °C）的含酶1x解离试剂（见材料表）。将培养板放入组织培养孵箱中。</li>
	<li>1分钟后，在孵箱内左右轻轻摇动培养板。</li>
	<li>2分钟（总时间）后，从孵箱中取出培养板，加入1 mL含10% FBS的培养基。</li>
	<li>使用5 mL移液器轻柔吹打细胞，促进细胞从培养板表面脱离。</li>
	<li>将细胞悬液收集至离心管中，于200 × g离心3分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>用2 mL冻存液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
	<li>加入适量体积的冻存液（见材料表），使细胞浓度达到目标冻存浓度（通常为5–10 × 106&#160;个细胞/mL）。</li>
	<li>将细胞转移至冻存管中，放入程序降温盒（降温速率为1 °C/min），并将降温盒置于-80 °C冰箱中过夜。</li>
	<li>24小时后，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。 
	注意：本实验方案可在此处暂停。</li>
</ol>
6. FHF-L CP 向心室样心肌细胞的分化
<ol>
	<li>将第5天的FHF-L CPs冻存管从液氮储存中取出，放入干冰容器中。</li>
	<li>将冻存管置于37 °C水浴中2至3分钟，直至细胞悬液完全解冻。 
	注意：重要提示：解冻过程对时间敏感。细胞在冻存液中暴露时间过长（即超过10分钟）会降低细胞活力。</li>
	<li>根据解冻的冻存管数量，将细胞转移至15 mL或50 mL离心管中。</li>
	<li>将预热（37 °C）的心源性培养基（表1）以滴加方式（每30秒5滴）加入细胞悬液中。持续此操作，直至达到1:3的冻存液:心源性培养基比例。此时，加快心源性培养基的添加速度，直至达到1:10的冻存液:心源性培养基比例。 
	注意：重要提示：渗透压的快速变化会增加解冻过程中的细胞死亡；因此，强烈建议按上述方法逐滴添加心源性培养基。</li>
	<li>将细胞悬液离心（200 × g，3分钟），收集细胞沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，并轻轻弹击离心管以松动细胞沉淀。</li>
	<li>用添加了2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂的心源性培养基重悬细胞。 
	注意：细胞活力在不同批次解冻之间可能存在差异，通常&#62;65%的细胞活力预示着良好的接种效率。</li>
	<li>用添加了2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂的心源性培养基稀释浓缩的细胞悬液，以获得所需接种浓度（不同培养板规格的接种浓度参见表2）。 
	注意：重要提示：若细胞接种密度过低，可能导致心肌分化效率下降。</li>
	<li>将细胞接种至培养板中。</li>
	<li>将培养板置于生物安全柜中静置20分钟后，再转移至细胞培养箱中。</li>
	<li>在分化第6天，观察细胞贴壁情况。 
	注意：心肌前体细胞在分化第5天进行冻存，解冻后24小时即为分化第6天。 
	注意：出现漂浮（死亡）细胞是常见现象。</li>
	<li>在分化第7天，吸除50%的培养基，并补充等量的新鲜心源性培养基。 
	注意：此后无需再在心源性培养基中添加RHO/ROCK信号通路抑制剂。</li>
	<li>每隔一天更换50%的心源性培养基。</li>
	<li>注意观察分化第11至第13天之间出现的自发性搏动。</li>
	<li>在分化第15天，使用DAPI（细胞核染色）和ACTC1（泛心肌标志物）通过免疫荧光法定量评估心肌分化效率。</li>
</ol>
7. 心室样心肌细胞的传代与维持
注意：到第14–16天时，应获得一层自发收缩的类似心室的心肌细胞单层。此时建议将心肌细胞解离并重新接种，以使培养物均一化，并防止细胞从培养板上脱落。
<ol>
	<li>吸去孔板中所有培养基，迅速加入 1 mL 预热（37 °C）的含酶解离试剂（1×）。 
	注意：含酶解离试剂（1×）的使用体积因孔板规格而异，但应完全覆盖孔底表面。</li>
	<li>将孔板转移至组织培养孵箱中。</li>
	<li>在孵箱内每 2 分钟轻轻左右摇晃孔板一次，以加速细胞脱离过程。</li>
	<li>5–15 分钟后，当 80% 至 100% 的细胞已从孔底脱离时，取出孔板，并加入等体积含 10% FBS 的培养基以终止含酶解离试剂（1×）的活性。 
	注意：本步骤中使用含酶解离试剂（1×）的孵育时间可能因批次不同而有所差异。</li>
	<li>将细胞悬液收集至离心管中。</li>
	<li>用移液器混匀细胞悬液，并使用自动细胞计数仪进行细胞计数。</li>
	<li>用添加了 2 µM RHO/ROCK 通路抑制剂的维持培养基将细胞悬液稀释至所需细胞浓度（不同孔板规格参见 表 2）。</li>
	<li>将心肌细胞接种至孔板后，轻轻晃动使细胞分布均匀，并在将孔板转移至组织培养孵箱前静置 10–20 分钟以促进细胞贴壁。</li>
	<li>传代后 24 小时，观察细胞贴壁及恢复情况。 
	注意：悬浮（死亡）细胞的存在较为常见。传代后 48–72 小时，心肌细胞应恢复自发性搏动。</li>
	<li>为维持心肌细胞培养，每隔一天更换 50% 培养基为维持培养基，直至用于后续实验的类心室心肌细胞投入使用。</li>
</ol>

<ol><li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510, 273-277 (2014).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+cardiomyocytes+reveal+abnormal+TGF-beta+signalling+in+left+ventricular+non-compaction+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy.</a> Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494, 105-110 (2013).</li>
<li>Colas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+microRNA+screening+identifies+let-7+and+mir-18+as+regulators+of+germ+layer+formation+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis.</a> Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).</li>
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<li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental cell. 39, 480-490 (2016).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了获得成功的分化效果，请务必严格遵循上述列出的步骤。此外，我们在此强调几个对分化结果有显著影响的关键参数。在开始分化前，应观察以下三个形态学指标：人多能干细胞Id1具有明显的干细胞形态、细胞间高度紧密聚集，以及在第0天时培养物达到高汇合度（&#62;90%）。为此，最佳的分化条件是将解离后的hPSCsId1以单细胞形式接种，使其形成紧密聚集的单层细胞，并在2至3天内生长至约90%的汇合度。相反，如果hPSCId1培养物表现出细胞和克隆形态不良、克隆间紧密度低，以及培养体系中存在大范围的自发分化区域，则前心场样心前体细胞（FHF-L CP）的分化很难成功。
培养基体积和Activin A浓度是前侧前肠类器官（FHF-L CP）分化过程中的关键参数，且依赖于培养板的规格（见表2）。此外，需要注意的是，最佳Activin A浓度可能因所使用的hPSC细胞系不同而有所差异，可能需要进行浓度优化。
Id1 mRNA 在...

大规模生产人多能干细胞（hPSCs）来源的心脏前体细胞和心肌细胞，是干细胞治疗1、疾病建模2,3以及快速鉴定调控心脏分化4,5,6和生理功能7,8的新通路的先决条件。尽管已有大量研究9,10,11,12,13,14,15报道了高效的人多能干细胞向心肌细胞分化的方案，但均未明确所获得心肌细胞的心区来源，尽管已发现左心室心肌细胞（第一心区）与右心室心肌细胞（第二心区）之间存在显著的分子差异16，且存在特定心区相关的先天性心脏病，例如左心发育不全综合征17或致心律失常性右室心肌病18。因此，从hPSCs中定向生成具有明确心区来源的心脏前体细胞和心肌细胞，已成为提升其在治疗和疾病建模应用中相关性的必要条件。
本方案依赖于Id1的组成型过表达，Id1是一种近期鉴定出的5 第一个心脏区域特化信号，与Activin A联合作用时，对启动hPSCs中的心脏发生既必要又充分。值得注意的是，Cunningham 等 (2017)5 表明 Id1 诱导的前体细胞特异性表达第一心场（HCN4, TBX5）但不包括第二心区标志物（SIX2, ISL1）在经历心脏分化时的情况。此外，作者还展示了整个缺失的转基因小鼠胚胎 Id 基因家族（Id1-4），不形成第一心区心脏前体细胞，而更内侧和后部的心脏前体细胞（第二心区）仍可形成，表明Id蛋白对启动第一心区心脏发生至关重要 体内方便的是，Id1诱导的前体细胞可被冷冻保存，并能自发分化为具有心室样特性的心肌细胞，包括表达心室特异性标志物IRX4, MYL2) 表达和心室样动作电位。
本文介绍一种简单且可扩展的方法，通过过表达 Id1 的人多能干细胞（hPSCs）生成类似第一心区（FHF-L）的心脏前体细胞及类似心室的心肌细胞。该方案的一个重要特点是可通过便捷的冷冻保存步骤，将心脏前体细胞的生成与后续心肌细胞的产生分离开来。综上所述，本方案详细阐述了以下必要步骤：（1）生成过表达 Id1 的人多能干细胞（hPSCs）；（2）从 hPSCs 生成类似第一心区（FHF-L）的心脏前体细胞；（3）冷冻保存所获得的前体细胞；以及（4）恢复 FHF-L 心脏前体细胞的分化过程，并生成高度富集（&#62;70–90%）的搏动性类似心室的心肌细胞。

<table><tbody><tr><td>ACTC1 抗体</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>激活素A</td><td>干细胞技术</td><td>Hu Recom Activin A</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素（Anti-Anti）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂（不含胰岛素）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂（不含维生素A）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12587001</td><td></td></tr><tr><td>CDH5抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF938</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>干细胞技术</td><td>7930</td><td>冷冻保存试剂</td></tr><tr><td>DMEM高糖</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>含钙 DPBS &amp;& Mg</td><td>康宁</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt 膜电位检测试剂盒&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F10488</td><td>关于光学动作电位的采集，请参阅 McKeithan 等，2017</td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>基质胶，生长因子减量型</td><td>康宁</td><td>356231</td><td>包被试剂</td></tr><tr><td>mTeSR1 培养基套装</td><td>干细胞技术</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>不含钙的 PBS &amp;& Mg</td><td>康宁</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素&amp;nbsp;</td><td>阿克罗斯</td><td>227422500</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>干细胞技术</td><td>5872</td><td>无酶解离试剂</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TAGLN 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>干细胞技术</td><td>72254</td><td>RHO/ROCK 通路抑制剂</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12605 -010</td><td>含酶消化液（1X）</td></tr><tr><td>Tyrodes 溶液混合包&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2145-10X1L</td><td>（关于光学动作电位采集，请参见 McKeithan 等，2017）</td></tr></tbody></table>

从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

大量生成具有特定心区来源的功能性人类多能干细胞衍生的心脏前体细胞和心肌细胞，是细胞治疗心脏疾病及进行疾病建模的前提条件。我们近期研究发现，Id 基因在脊椎动物发育过程中对第一心区前体细胞的特化具有必要且充分的作用。本分化方案基于上述发现，利用 Id1 过表达联合 Activin A 作为强有力的命运特化信号，诱导产生类似第一心区（FHF-L）的前体细胞。重要的是，这些前体细胞可高效分化为类似心室的心肌细胞，效率约为 70–90%。本文中，我们详细描述了两个步骤：1）生成过表达 Id1 的人多能干细胞（hPSCs）；2）大规模分化可冻存的 FHF-L 前体细胞及类似心室的心肌细胞。

生成 hPSCsId1细胞系 
hPSCs 通过慢病毒感染实现 Id1 过表达（图 1A）。一旦生成 hPSCId1 细胞，即通过 qRT-PCR 定量转基因表达水平（图 1B）。仅当 hPSCId1 细胞系中 Id1 mRNA 的表达水平高于 GAPDH 的 0.005 倍时，方可用于后续分化实验。
hPSCsId1 的维持与分化前准备<...

本文介绍一种可扩展的方法，通过简单组合使用Activin A和慢病毒介导的Id1过表达，从人类多能干细胞中生成第一心区样心脏前体细胞和心室样心肌细胞。

由特定心区来源的功能性人类多能干细胞衍生出大量心脏前体细胞和心肌细胞的生成方法……

该简单技术的主要优势在于能够生成具有明确心区来源和亚型的心脏前体细胞和心肌细胞。所获得的细胞可广泛应用于多种研究领域，包括基础发育生物学、概念验证性细胞治疗以及心脏疾病建模研究。本实验操作将由我实验室的Sean Spiering和Michael Yu进行演示。首先，向96孔板中足够数量的孔内各加入50微升包被试剂，以满足后续的细胞接种和病毒感染步骤；然后，向6孔板的一个孔中加入1毫升解离试剂，以解离已接种的多能干细胞。接着，使用无菌移液管将细胞悬液转移至15毫升塑料离心管中。在离心管中加入5毫升含有钙和镁的PBS，以中和解离试剂。然后以200 × g离心细胞3分钟。离心后，弃去上清液，轻轻弹击离心管，使沉淀松动。随后将细胞沉淀溶解于1 mL干细胞培养基中。接下来，使用自动细胞计数仪对细胞数量进行计数。计数完成后，在含有50微升干细胞培养基的96孔板中每孔接种20,000个活细胞，培养基中需添加2 µM的RHO/ROCK信号通路抑制剂。24小时后，观察细胞贴壁情况，然后在慢病毒转导前1小时，将培养基更换为100微升新鲜干细胞培养基。接下来，将 Id1 慢病毒在冰上解冻，然后每孔加入 3 µL 纯化的慢病毒。加入慢病毒后，将培养板放回 37°C、含 5% CO₂ 的细胞培养孵箱中。病毒感染 24 小时后，向感染的细胞中加入 100 µL 新鲜干细胞培养基。48小时后，将含有病毒的培养基更换为200微升新鲜的干细胞培养基，该培养基中添加1微克/毫升嘌呤霉素。每天用200微升新鲜的干细胞培养基（含1微克/毫升嘌呤霉素）更换培养基。在第0天开始分化过程，将干细胞培养基更换为1.5毫升含Activin A的诱导培养基，使用12孔板进行操作。分化开始24小时后，将培养基更换为2毫升不含Activin A的诱导培养基。第3天，再次更换为2毫升不含Activin A的诱导培养基。第5天，吸除含有FHF-L CPs孔中的全部培养基，立即向孔中加入1毫升预热的含酶解离试剂，然后将培养板置于37°C培养箱中孵育。1分钟后，在培养箱内轻轻摇动培养板，2分钟后将其从培养箱中取出，向孔中加入1毫升含10%胎牛血清的培养基。通过轻柔吹打使细胞从培养板上脱离。接下来，将细胞悬液转移至离心管中，进行离心。离心结束后，用两毫升冻存液重悬细胞沉淀，然后计数细胞数量。随后将细胞分装至冻存管中，并将冻存管放入程序降温仪中。 然后将装置转移至零下80摄氏度环境中过夜。24小时后，将小瓶转移至液氮中进行长期保存。在解冻FHF-L CPs之前，用2毫升包被试剂对12孔板的孔进行包被。接下来，将保存在液氮中的五天大的FHF-L CPs转移至干冰容器中。从干冰中取出冻存管，放入37摄氏度水浴中两分钟，以确保完全解冻。细胞完全解冻后，将细胞转移至离心管中，然后每隔30秒向细胞悬液中滴加10滴预热的心源性培养基。继续添加心源性培养基，直至冷冻保存培养基与心源性培养基的比例达到1:3。接下来将细胞进行离心。离心后弃去上清液，轻轻弹击离心管，然后用心源性培养基重悬细胞沉淀，该培养基需添加2 µM的RHO/ROCK信号通路抑制剂。用心源性培养基进一步稀释细胞悬液，以达到所需的细胞浓度。然后将细胞接种到含有两毫升心源性培养基的培养板中。将培养板在组织培养超净台中静置20分钟后，再转移至培养箱中。在分化第六天观察细胞贴壁情况。第七天，吸去一半的心肌诱导培养基，并更换为新鲜培养基。此后每隔一天更换50%的心肌诱导培养基，至第15天时，定量分析心肌分化情况。在此处定量分析了hESC和hPSC细胞系中Id1 mRNA的表达水平。仅使用Id1 mRNA表达水平高于GAPDH的0.005倍的hPSC细胞系进行分化。图中显示的是在第0天，处于最佳密度、亚融合状态和过融合状态的hPSC分化后的明场图像。进一步分化后，细胞融合度在24小时后达到75%。第3天时，正在分化的细胞形成细胞簇；到第5天，细胞仍保持紧密连接的簇状结构，且形态均一。第6天时，前心场样心前体细胞（FHF-L CPs）覆盖了培养孔表面面积的90%以上。事实上，到第12天，心肌细胞开始搏动并表现出心脏收缩。在分化过程的后期，第15天后 MYL2 和 IRX4 的 mRNA 表达水平升高。这两种蛋白均代表心肌细胞中心室特异性的标志物。此处的动作电位曲线反映了快速的上升支和下降支速度，以及心室样平台期。这些特征是分化第25天时心室样心肌细胞的典型表现。总之，生成Id1过表达的人多能干细胞约需两周时间，随后约需5天生成第一心区样前体细胞，再约需10天生成搏动的心室样心肌细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人多潜能干细胞第一心场样心脏祖细胞和心室样细胞的生成

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本方案将介绍从小鼠和人类胚胎干细胞中诱导获得心肌前体细胞的方法。该方案的主要策略是利用流式细胞术，通过在胚胎干细胞系中构建的荧光报告系统来富集心肌前体细胞。...

从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

我们提出了三种新颖且更高效的方案，用于将人诱导性多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并提供了一种递送方法，通过结合细胞注射与补片介导的细胞因子递送，提高移植细胞的定植效率。...

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。...

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

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体外生成心脏区域特异性心脏前体细胞

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。...

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

本文介绍了一种利用人类多能干细胞通过自组织方式高效生成具有发育相关性的人类心脏类器官（hHOs）的实验方案。该方案依赖于发育信号的顺序性激活，可产生高度复杂且功能相关的人类心脏组织。...

生成源自多能干细胞的自组装人类心脏类器官

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

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从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞

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