Name: 活体哺乳动物细胞器中单膜蛋白的多色定位显微术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学习利用自标记蛋白和双色定位显微术在活细胞中对单膜蛋白进行多色定位成像，实现约18纳米的高精度分辨率，揭示线粒体等细胞器内蛋白质的空间组织与动态行为。

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作者感谢奥斯纳布吕克大学的生物物理学团队和Jacob Piehler提供的持续支持，感谢Wladislaw Kohl提供的技术支持和材料制备，以及CellNanOs委员会提供显微镜设备使用。本项目由SFB 944资助。

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<li>Niewidok, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+dynamic+biphasic+partition+of+RNA-binding+proteins+in+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules.</a> J Cell Biol. , (2018).</li>
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<li>Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shuttling+of+PINK1+between+Mitochondrial+Microcompartments+Resolved+by+Triple-Color+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy.</a> ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).</li>
<li>Shim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种用于移动膜蛋白双色单分子定位的技术。按照本方案，膜蛋白与自标记蛋白融合，后者可与分别偶联至其对应底物的罗丹明染料TMR和SiR发生反应。罗丹明染料具有高亮度和良好的光稳定性，因此能够实现重复成像1。为确保实验成功，需注意若干条件和关键要点。
首先，选择合适的滤光片和分光器以清晰分离TMR和SiR的信号非常重要。为了减少细胞外背景信号，使用PLL-PEG-RGD对盖玻片进行预清洁和包被是有效的。染料-底物的最终浓度必须根据自标记酶对其底物的亲和力以及酶在细胞内的可及性进行测试。对于线粒体蛋白17&#160;和应激颗粒13，纳摩尔至皮摩尔浓度已足够。对于其他细胞器，所需浓度需另行测试。如果在记录开始时染色过强，无法分辨单个分子，则最好等待荧光染料发生漂白，使其数量减少至可分辨单个粒子（SP）的水平。我们发现，在染色过程中，BG-底物浓度高于30 nM、HTL-底物浓度高于1 nM，或延长染色时间以增加标记分子数量的做法均不可行。每...

本实验方案的目的是提供一种成像方法，用于在活细胞内对单个膜蛋白进行定位和追踪。我们将该方法称为追踪与定位显微镜技术（Tracking and Localization Microscopy, TALM）1,2。与随机光学重建显微镜技术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）3 和荧光激活定位显微镜技术（(F)PALM）4,5 类似，TALM 是一种基于单分子的荧光定位技术。然而，该方法的独特之处在于，通过结合膜蛋白的运动性以及对同一标记分子在不同位置的重复成像，能够揭示出可移动蛋白所能到达的微区室。换句话说，蛋白可能的定位范围由细胞器的结构以及蛋白自身的运动性共同决定1。该方法与其他多种超分辨率成像技术具有互补性6,7,8，因为它通过成像可移动蛋白来生成定位图和轨迹图。标记方法基于使用基因工程构建的融合蛋白，这些融合蛋白本身不具荧光。这些融合蛋白是可自标记的酶，能与连接了染料的底物发生共价反应。该策略的优势在于，可通过添加底物的量来控制标记程度。此外，还可根据所选的偶联染料来调整荧光颜色。目前已有多种可用的自标记酶标签9。使用自标记酶标签的另一个优势是，偶联染料通常比荧光蛋白更稳定且亮度更高1，因此单个蛋白在漂白前可被更长时间、更精确地记录。这使得可移动蛋白的运动轨迹得以记录，并可从中提取扩散系数10,11。
本文展示了TALM在研究线粒体膜蛋白上的可行性，但该方法也可应用于其他细胞内和细胞外膜蛋白，包括不同类型的细胞12,13。我们证明，多色TALM能够同时区分不同亚区室中的蛋白质，可作为现有超分辨率荧光显微技术的有力补充14,15,16。TALM适用于活细胞成像17。所选用的罗丹明染料四甲基罗丹明（TMR）和硅基罗丹明（SiR）具有优异的光物理特性，特别是其高亮度和稳定性，使得能够在多个成像帧中连续记录单个膜蛋白，从而获得定位（及轨迹）图谱。然而，TALM在定位具有高扩散系数的可溶性蛋白时存在局限性，因为其运动模糊程度过高，且每帧采集的光子数过低，难以实现精确定位。此外，与STORM或受激辐射损耗显微镜（STED）等技术相比，TALM所需的激发光强度更低6,7，从而减轻了光毒性效应。这一点尤为重要，因为光毒性应激常会影响细胞器形态18&#160;，进而干扰对蛋白运动性的分析19。综上所述，我们提出在活细胞中应用多色TALM技术，该技术填补了定位显微技术（如STORM/STED/(F)PALM）与蛋白运动性分析技术（如光漂白后荧光恢复（FRAP）20,21、荧光相关光谱（FCS）22和荧光互相关光谱（FCCS）11,23）之间的空白。

<table><tbody><tr><td>(2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸，1 M) (HEPES)</td><td>Biochrom</td><td>#1104E</td><td></td></tr><tr><td>DC1：二向色分光镜&amp;nbsp;</td><td>Chroma</td><td>640 dcxr</td><td>NC506031</td></tr><tr><td>DC2：多色镜，分光镜</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/640rpc</td><td>已停产</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;acute;s 磷酸盐缓冲液 (PBS) 1x (不含 Ca &amp; Mg)</td><td>Sigma-Aldrich &amp; Co.</td><td>#RNBF8311</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;acute;s MEM，不含酚红、不含 L-谷氨酰胺且不含 NaHCO3，含 1% FBS、0.1% HEPES、0.1% NEAA、0.1% 丙氨酰-L-谷氨酰胺和 34.78% 碳酸氢钠 (NaHCO3 0.75g/l)</td><td></td><td></td><td>成像培养基</td></tr><tr><td>Earle&amp;acute;s 最低必需培养基 (MEM)，含酚红，含 1% 优质胎牛血清 (FBS)、0.1% HEPES (2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸，1 M) 和 0.1% 非必需氨基酸 (NEAA)</td><td></td><td></td><td>生长培养基</td></tr><tr><td>EF：四通道发射滤光片</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F72-866</td><td>Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm</td></tr><tr><td>EMCCD 相机</td><td>Andor</td><td>Andor iXON 897</td><td>EMCCD 相机</td></tr><tr><td>QuadView 滤光立方体发射滤光片，橙色</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F39-637</td><td>带通 582 - 619 nm</td></tr><tr><td>QuadView 滤光立方体发射滤光片，红色</td><td>Chroma</td><td></td><td>带通 655 - 725 nm (HQ 690/70)</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）优质</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>荧光微球：TetraSpeck&amp;trade; 微球，0.1 &amp;micro;m，荧光蓝色/绿色/橙色/深红色</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>荧光微球</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Biochrom</td><td>#0951C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 细胞&amp;nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td>来自患者 Henrietta Lacks 的宫颈癌细胞</td></tr><tr><td>Hela 细胞 CI::paGFP，稳定株</td><td>Muster 等，PLOS One 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela 细胞 CV g::Halo7-Tag，稳定株</td><td>Appelhans 等，NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela 细胞 Tom20::Halo7-Tag，稳定株</td><td>Appelhans 等，NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>图像分光器</td><td>Photometrics</td><td>Dual-View QV2</td><td>图像分光发射</td></tr><tr><td>图像处理软件&amp;nbsp;</td><td>ImageJ2 / Fiji</td><td>免费软件</td><td></td></tr><tr><td>浸油 - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜</td><td>Olympus IX-71/73/83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>561 nm 激光器，200 mW</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-561-200</td><td>561 nm 发射</td></tr><tr><td>642 nm 激光器，140 mW</td><td>Omicron</td><td>Luxx-642-140</td><td>642 nm 发射</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>版本 R2013a</td><td></td></tr><tr><td>含 Earle's 平衡盐溶液的 MEM，2.2 g/L NaHCO3，稳定谷氨酰胺，不含酚红</td><td>Biochrom</td><td>FG-0385</td><td></td></tr><tr><td>含 Earle's 平衡盐溶液的 MEM，含 2.2 g/L NaHCO3，稳定谷氨酰胺，含酚红</td><td>Biochrom</td><td>FG-0325</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker&amp;reg; Deep Red FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td>染料</td></tr><tr><td>MitoTracker&amp;reg; Green FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td>染料</td></tr><tr><td>多模-光学保偏单模光纤</td><td>Pointsource/Qioptiq</td><td></td><td>KineFLEX</td></tr><tr><td>NHS-PEG-MAL，Rapp Polymer&amp;nbsp;</td><td>Rapp Polymere GmbH T&amp;uuml;bingen</td><td></td><td>盖玻片涂层</td></tr><tr><td>非必需氨基酸 (NEAA)</td><td>Biochrom</td><td>#0802E</td><td></td></tr><tr><td>PEG 800 (聚乙二醇) 10%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>货号 Art No. 0263.1</td><td>盖玻片涂层</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biochrom</td><td>#0122E</td><td></td></tr><tr><td>PINK1-Halo7-Tag 表达质粒</td><td>Beinlich 等，ACS Chemical Biology 2015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸 (1.2 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich &amp; Co.</td><td>目录号 Cat. No.P9155</td><td>盖玻片涂层</td></tr><tr><td>RGD 肽 (Ac-CGRGDS-COOH)</td><td>Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim</td><td></td><td>盖玻片涂层 / 整合素受体基序</td></tr><tr><td>与 HaloTag&amp;reg;-配体连接的硅基罗丹明 (SiRHTL)&amp;nbsp;</td><td>由 Kai Johnson 个人赠送</td><td></td><td>染料</td></tr><tr><td>软件分析插件</td><td>自编 C. P. Richter，Osnabr&amp;uuml;ck 生物物理学</td><td>SLIMFAST 16g</td><td></td></tr><tr><td>四甲基罗丹明 / SNAP-Cell&amp;reg; TMR-Star 与 SNAP-配体连接 (TMRstar)&amp;nbsp;</td><td>New England Biolab&amp;reg;</td><td>S9105S</td><td>染料</td></tr><tr><td>与 HaloTag&amp;reg;-配体连接的四甲基罗丹明 (TMRHTL)&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td>染料</td></tr><tr><td>TIRF 聚光镜</td><td>Olympus</td><td>Cell^TIRF MITICO 系统</td><td>TIRF 聚光镜</td></tr><tr><td>TIRF 显微镜控制软件</td><td>Olympus cellSens 1.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF 物镜</td><td>Olympus</td><td>150x 油镜 (数值孔径 N.A. 1.45；Olympus UAPO)</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 10x</td><td>Biochrom</td><td>#0266</td><td></td></tr><tr><td>水 H2O 99.5% Rotipuran&amp;reg; 低有机物&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>货号 Art. No. HN57.1</td><td></td></tr></tbody></table>

活体哺乳动物细胞器中单个膜蛋白的多色定位显微成像

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

了解蛋白质在细胞亚区室中的定位对于阐明其特定功能至关重要。本文介绍一种超分辨率技术，该技术通过生成蛋白质的定位图和追踪图，确定蛋白质可进入的微区室。此外，利用多色定位显微镜，可同时获得不同亚区室中蛋白质的定位与追踪特征。该技术专用于活细胞，基于对单个可移动膜蛋白的重复成像。目标蛋白通过基因工程与特定的自标记标签融合表达。这些标签是能够以共价方式与底物发生反应的酶，底物上连接有荧光染料。酶标记蛋白与荧光标记底物反应后，即可实现蛋白标记。本文中使用的荧光染料为四甲基罗丹明（Tetramethylrhodamine, TMR）和硅基罗丹明（Silicon Rhodamine, SiR），它们分别连接在相应酶的底物上。通过使用皮摩尔（pM）至纳摩尔（nM）浓度范围的底物，可实现亚化学计量比标记，从而获得清晰可分辨的信号。这些信号的定位精度约为 15–27 nm。该技术支持单分子多色成像，颜色数量受限于可用的膜通透性荧光染料以及自标记酶的种类。我们通过检测质量控制酶——PTEN诱导的激酶1（PINK1）在不同线粒体区室中的定位及其在加工过程中与其他膜蛋白的关系，验证了该技术的可行性。然而，由于标记效率较低，同时标记两个相邻蛋白的概率较小，因此该方法在利用单分子FRET或共追踪来验证不同标记单个蛋白之间真实物理相互作用方面存在局限性。尽管该技术在膜区室蛋白成像方面具有优势，但在大多数情况下并不适用于高移动性可溶性蛋白的定位研究。

多色成像与共定位分析有助于确定蛋白质的亚细胞器定位。我们此前已通过细胞质磷酸酶和张力蛋白同源物 PINK1 证实了这一点，该蛋白由于线粒体蛋白酶的加工而在不同线粒体亚区域中具有不同的定位17PINK1 是维持线粒体功能的重要因子34,35以确定PINK1在不同线粒体区室中随着其加工过程的定位情况（图 4A)，在活细胞中进行了多色超分辨率显微成像。因此，将PINK1与一种自标记标签（HaloTag）进行基因融合。为确定其在功能正常与功能障碍线粒体中相对于其他蛋白的定位，选用作为线粒体外膜转位酶复合物（TOM）组分的Tom2036，用另一种自标记标签（SNAP-tag）进行标记。记录了至少1,000帧（每秒96帧）的时间序列图像。一个通道中所有信号随时间累积的图像显示，PINK1定位于细胞质和线粒体中（<s...

本文介绍了一种在活细胞细胞器中对单个膜蛋白进行多色定位的实验方案。通过使用自标记蛋白来连接荧光染料，可对同一细胞器不同膜区室中分布的蛋白质实现约18 nm精度的定位。

了解蛋白质在细胞亚区室中的定位对于理解其特定功能至关重要。本文介绍了一种……

该技术可以解答调控过程中的关键问题，例如蛋白质动态变化和组织结构在功能适应中所起的作用。该技术的主要优势在于可在活细胞中进行，从而揭示单分子水平上的蛋白质动态行为。尽管该方法最初被用于研究线粒体膜蛋白的时空组织特性，但它也可应用于其他细胞器及其他膜蛋白的研究。本技术由我实验室的研究生 Timo Appelhans 演示。按照文本方案转染并制备细胞样品和显微镜后，将含有荧光微球的制备样品置于样品架中，夹在聚四氟乙烯环与红色橡胶环之间。启动显微镜、所有硬件组件以及显微成像所需的所有软件。使用一块新的无绒布，喷上异丙醇后擦拭物镜和盖玻片底部。然后在物镜的镜片上滴加一滴浸油。接着，将装有微珠样品的样品托架放置到显微镜载物台上，使盖玻片底部与浸油接触。然后使用透射光或激光线对微珠进行聚焦。调节两束激发激光的功率，使两个荧光通道中的信号密度相近。随后寻找具有大量清晰可辨荧光信号的区域。使用相机控制软件生成荧光通道的合并图像。然后利用图像分光器上的螺丝手动倾斜内部光学图像分光器，以实现两个荧光通道信号的最佳重叠。启动TIRF显微镜控制软件，并选择在实时成像模式下分别显示各个通道。拍摄一张快照图像，激发所有通道中的荧光。然后使用该图像生成变换矩阵。启动软件分析插件，并将先前记录的荧光微珠双色图像载入软件中。选择荧光通道的使用方向。当提示校准图像时，点击“是”，并选择先前拍摄的快照。打开单位管理器以定义单位转换系数，然后打开定位管理器。为了确定点扩散函数（PSF），请按下“PSF半径”按钮。在打开的PSF估算窗口中，定义数值孔径和发射波长最大值，然后点击“估算PSF半径”。接下来，接受获得的实验点扩散函数（PSF）。定义评估区域、去卷积循环次数以及用于计算的计算机核心数量。然后点击“定位”（Localize）以启动对单个粒子强度分布的拟合，拟合采用二维对称高斯函数。打开校准管理器。在两个通道的渲染合并图像中，将显示原始信号和定位的中心。选择仿射模式。然后，通过绘制连接线，手动连接两个通道中源自同一荧光微球的相应局部中心点。连接分布在视场范围内的对应信号。然后按“接受”按钮，并保存变换矩阵。为了对线粒体膜蛋白进行单分子成像，将样品盖玻片置于橡胶环和聚四氟乙烯环之间固定。然后向腔室中加入0.5至0.8毫升成像缓冲液。清洁物镜镜头和盖玻片底部。然后在物镜上滴加一滴油后，使用透射光或激光线对细胞进行聚焦。接着调节两束激发激光的功率，使其强度相近，并寻找具有较多荧光信号的区域。在TIRF显微镜控制软件中调整照明角度，设置入射角小于临界角，即采用HILO片层照明模式，以激发特定的兴趣区域。将TIRF显微镜的照明条件调整为采用HILO照明方式以激发细胞器时，需要快速判断信噪比，并具备TIRF显微镜操作经验以及对细胞形态的了解。设置EM增益，并选择适合实验的曝光时间，以确保每帧采集到足够的光

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生物学

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