活体哺乳动物细胞器中单个膜蛋白的多色定位显微成像

该技术可以解答调控过程中的关键问题，例如蛋白质动态变化和组织结构在功能适应中所起的作用。该技术的主要优势在于可在活细胞中进行，从而揭示单分子水平上的蛋白质动态行为。尽管该方法最初被用于研究线粒体膜蛋白的时空组织特性，但它也可应用于其他细胞器及其他膜蛋白的研究。

本技术由我实验室的研究生 Timo Appelhans 演示。按照文本方案转染并制备细胞样品和显微镜后，将含有荧光微球的制备样品置于样品架中，夹在聚四氟乙烯环与红色橡胶环之间。启动显微镜、所有硬件组件以及显微成像所需的所有软件。

使用一块新的无绒布，喷上异丙醇后擦拭物镜和盖玻片底部。然后在物镜的镜片上滴加一滴浸油。接着，将装有微珠样品的样品托架放置到显微镜载物台上，使盖玻片底部与浸油接触。

然后使用透射光或激光线对微珠进行聚焦。调节两束激发激光的功率，使两个荧光通道中的信号密度相近。随后寻找具有大量清晰可辨荧光信号的区域。

使用相机控制软件生成荧光通道的合并图像。然后利用图像分光器上的螺丝手动倾斜内部光学图像分光器，以实现两个荧光通道信号的最佳重叠。启动TIRF显微镜控制软件，并选择在实时成像模式下分别显示各个通道。

拍摄一张快照图像，激发所有通道中的荧光。然后使用该图像生成变换矩阵。启动软件分析插件，并将先前记录的荧光微珠双色图像载入软件中。

选择荧光通道的使用方向。当提示校准图像时，点击“是”，并选择先前拍摄的快照。打开单位管理器以定义单位转换系数，然后打开定位管理器。

为了确定点扩散函数（PSF），请按下“PSF半径”按钮。在打开的PSF估算窗口中，定义数值孔径和发射波长最大值，然后点击“估算PSF半径”。

接下来，接受获得的实验点扩散函数（PSF）。定义评估区域、去卷积循环次数以及用于计算的计算机核心数量。然后点击“定位”（Localize）以启动对单个粒子强度分布的拟合，拟合采用二维对称高斯函数。

打开校准管理器。在两个通道的渲染合并图像中，将显示原始信号和定位的中心。选择仿射模式。

然后，通过绘制连接线，手动连接两个通道中源自同一荧光微球的相应局部中心点。连接分布在视场范围内的对应信号。然后按“接受”按钮，并保存变换矩阵。

为了对线粒体膜蛋白进行单分子成像，将样品盖玻片置于橡胶环和聚四氟乙烯环之间固定。然后向腔室中加入0.5至0.8毫升成像缓冲液。清洁物镜镜头和盖玻片底部。

然后在物镜上滴加一滴油后，使用透射光或激光线对细胞进行聚焦。接着调节两束激发激光的功率，使其强度相近，并寻找具有较多荧光信号的区域。在TIRF显微镜控制软件中调整照明角度，设置入射角小于临界角，即采用HILO片层照明模式，以激发特定的兴趣区域。

将TIRF显微镜的照明条件调整为采用HILO照明方式以激发细胞器时，需要快速判断信噪比，并具备TIRF显微镜操作经验以及对细胞形态的了解。设置EM增益，并选择适合实验的曝光时间，以确保每帧采集到足够的光子数。随后调节激光功率，以实现较高的信噪比，因为该比值直接关系到定位精度。

在细胞周边区域寻找具有不重叠、呈长条形的线粒体以及单分子信号的视野。如果在一个或两个通道中均未观察到单个信号，则等待漂白，直至单分子信号出现。若仅需对一个通道进行漂白，在记录另一通道前应关闭其激光，以避免发生漂白。

记录直至信号数量过少而无法合理继续。启动成像处理软件，通过生成至少 1,000 个已记录帧的累积渲染和图像来检查线粒体结构。启动软件分析插件。

为进行定位和追踪的数据处理，请加载原始数据。检查多色图像，并选择两个通道的正确方向。

当提示校准图像时，加载变换矩阵。各通道将被分别显示。通过点击“显示”打开图像容器中的原始数据。

然后在顶部选项卡中打开单元管理器，并定义每个通道的单位转换系数。在顶部选项卡中打开定位管理器，并定义评估框和放气循环次数。单击点扩散函数半径（PSF Radius）以打开PSF估计器。

设置数值孔径和发射波长最大值，以获得理论点扩散函数（PSF）值。按下“接受”。对所有通道重复此操作。

然后按“定位”以启动对两个通道中记录信号的单粒子定位。等待软件完成处理。此时，每个通道的超分辨图像已生成，并显示在软件分析插件的图像容器中。

PINK1 是维持线粒体功能的重要因子。为了确定 PINK1 在功能正常与功能障碍线粒体中相对于 Tom20 的定位，记录了一系列共 1,000 帧的时间序列图像。其中一个通道随时间累积的所有信号叠加图像显示，在正常条件下，PINK1 定位于细胞质、线粒体外膜以及线粒体内部；而在去极化的线粒体中，则主要定位于外膜。

如定位颗粒的叠加图像所示，PINK1 主要分布在极化线粒体内部，而 Tom20 定位于线粒体外膜。在 Tom20 与 PINK1 定位颗粒的合并图像中，这一分布差异更为明显，显示外膜蛋白 Tom20 的分布范围更广。为了验证 PINK1 在线粒体内部的定位，将呼吸链复合物 I 的 30 千道尔顿亚基与光激活型 GFP 融合，并通过荧光光激活定位显微镜进行记录。

累积的三色图像和截面分布显示了复合物一与PINK1的重叠，证实了全长PINK1的导入。这些数据表明，PINK1的不同亚群占据了多个线粒体微区室。一旦掌握，该技术可在20小时内完成，包括数据采集和后续处理，前提是操作正确。

在进行该实验操作时，重要的是要记得检测细胞器的运动情况。通过本方法，可确定蛋白质的相对定位。该技术建立后，为线粒体蛋白质单颗粒示踪领域的研究人员提供了基础，使其能够在Z2细胞以及不同代谢条件和应激状态下观察这些蛋白质的行为。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用双柱显微技术对线粒体蛋白进行成像，以揭示其亚细胞器定位及转运过程。