优化的划痕实验方法 体外 使用自动化光学相机检测细胞迁移
2018年8月8日
在此，我们描述了一种检测细胞迁移的方法 体外 使用自动光学显微相机进行观察。划痕实验已被广泛应用于监测划痕闭合情况，通常在设定的时间段内进行跟踪。光学显微镜可实现对细胞迁移的可靠且低成本的检测。
该技术的主要优势在于，您可以在自动光学显微镜下实时观察细胞。该处理方法的意义延伸至慢性伤口或癌症的治疗领域，因为在这些疾病中，细胞迁移起着至关重要的作用。首先，用五毫升无菌的无镁无钙 PBS 洗涤一次融合的 HaCaT 细胞培养物，共洗涤两次，每次使用五毫升 PBS。
接下来，在37°C培养箱中用1毫升胰蛋白酶孵育细胞5至8分钟。在光学显微镜下确认细胞脱落之后，加入9毫升含FBS的培养基以终止酶促反应。然后将细胞稀释至每250微升含FBS的培养基中7.5 × 10⁴个细胞的浓度。
接下来，将250微升细胞悬液接种至圆底48孔组织培养板的每个孔中，轻轻左右滑动培养板，确保细胞均匀分布在孔底。然后将培养板转移至细胞培养箱中。当细胞培养达到90%至95%融合度时，弃去每孔中的上清液，更换为250微升新鲜配制的、添加了10微克/毫升丝裂霉素C的培养基，并将培养板放回培养箱继续孵育2小时。
孵育结束后，用250微升PBS洗涤细胞，并向每孔加入250微升新鲜PBS。然后使用200微升微量移液枪头，在每孔细胞单层上制造一条垂直划痕。待所有细胞单层划痕完成后，将每孔中的PBS更换为250微升目标肽刺激物，并将培养板连同盖子一起安装至光学成像系统中。
打开采集窗口并选择“伤口愈合”以设置光学相机。选择培养板类型，并取消选择未使用的孔。然后点击“启用”，并用鼠标右键点击其中一个孔，以调整焦距，使其与细胞位置匹配。
在图片时间间隔中设置图像的时间段，并设置重复次数以匹配所需的时间周期。然后选择适当的分析类型。最后点击开始，以启动细胞成像。
当伤口发生时，皮肤细胞开始增殖并迁移通过伤口床以闭合伤口，这一过程可通过光学显微镜观察。经过48小时的培养，内皮生长因子处理组的伤口闭合率接近95%，而未处理对照组的闭合率为38%，乳铁蛋白和乳铁素肽培养组的闭合率分别为33%和62%。根据初始划痕后间隙宽度的变化所确定的伤口闭合百分比，也可针对每种生长刺激条件进行绘图分析。
本视频介绍了一种简单高效的实验方案，用于研究角质形成细胞在健康细胞单层中划痕后发生的迁移。尽管本实验所用细胞为HaCaT细胞，但该方法也可应用于其他细胞系、真菌甚至细菌，只要这些细胞能够贴附于微量培养板底部即可。
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概述
本文介绍了一种使用自动光学相机显微镜在体外检测细胞迁移的实验方法。划痕实验被强调为一种可靠的方法，可用于观察细胞随时间的迁移过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 显微镜技术
- 体外技术
背景
- 划痕实验是一种广泛用于研究细胞迁移的技术。
- 自动化光学显微镜可实现对细胞的实时观察。
- 理解细胞迁移在慢性伤口和癌症治疗中至关重要。
- 该方法在检测细胞运动方面具有成本低且可靠的优势。
研究目的
- 展示一种评估细胞迁移的可靠方法。
- 探讨细胞迁移在慢性伤口治疗和癌症治疗中的意义。
- 利用自动化光学显微镜进行实时分析。
使用的方法
- 用 PBS 清洗 HaCaT 细胞的融合培养物。
- 用胰蛋白酶孵育细胞以使其脱离。
- 加入培养基终止酶促反应。
- 将细胞稀释至特定浓度用于分析。
主要结果
- 实现了对细胞迁移的实时观察。
- 该方法在监测划痕愈合方面证明有效。
- 研究结果可为慢性伤口和癌症的治疗策略提供依据。
- 自动化显微镜技术提高了迁移评估的可靠性。
结论
- 自动光学显微镜是研究细胞迁移的有力工具。
- 该技术可推动慢性伤口愈合和癌症治疗领域的研究进展。
- 未来的研究可能会进一步拓展其在多种生物学背景下的应用。
常见问题
行业重要性概述
细胞迁移实验对于评估伤口愈合和肿瘤学领域的治疗候选物至关重要，但传统的划痕实验存在边缘伪影和手动分析瓶颈问题。本优化方案通过消除阳离子介导的细胞聚集，并结合自动化成像，解决了可重复性方面的挑战，实现了稳定且定量的迁移检测结果。该方法通过提供有关促迁移和抗迁移化合物的可靠实时数据，支持早期靶点验证和机制层面的风险评估。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化乳铁蛋白或生长因子等刺激物引起的细胞迁移变化，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过自动光学成像，减少人工划痕分析和温度波动带来的实验变异性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：对相同划痕区域随时间变化产生标准化的定量伤口闭合指标。
- 操作价值：消除耗时的图像轮换与分析过程，提高化合物筛选的通量。
转化与临床前研究
- 科学价值：采用与疾病相关的 HaCaT 角质形成细胞模拟上皮细胞迁移，支持转化生物标志物的一致性研究。
- 操作价值：通过可重复、自动化的实验流程，确保从发现到临床前评估的检测连续性。
流程与工作流整合
该方法适用于发现研究的连续过程，既可在早期发现阶段支持假设验证，又能通过可量化的迁移抑制或促进效应实现先导化合物的定量筛选。
- 发现生物学：通过将迁移作为对肽或细胞因子处理的因变量进行分离，支持通路的阐明。
- 筛选：提供可重复的定量输出结果（例如，伤口闭合百分比），可用于化合物库或蛋白质变体间的比较。
- 分析：生成适用于统计比较和剂量-反应建模的时间序列迁移数据。
- 转化研究：通过使用人角质形成细胞及伤口愈合背景，建立与临床前研究的相关性。
- 企业级复用：建立可复用、自动化的迁移检测平台，适用于多个项目和细胞类型。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低迁移实验中的机制模糊性，提高预测的可信度。
- 操作价值：通过自动化成像和一致的划痕制备，增强实验的标准化和可扩展性。
- 战略价值：在研发早期提供可靠、定量的迁移数据，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于经验证的化合物迁移效应，实现风险调整后的化合物优先级排序。
实施注意事项
- 单层细胞制备需要具备细胞培养和无菌操作技术的专业知识。
- 依赖配备延时成像和分析功能的自动光学摄像系统。
- 为获得可比较的数据，需在不同孔之间标准化划痕宽度和时间。
- 需要优化PBS洗涤步骤，以防止不同细胞系中出现边缘伪影。
- 仅适用于能够贴附于微孔板底部的贴壁细胞。
