用自动光学相机进行细胞迁移的体外试验优化划痕试验
August 8th, 2018
在这里, 我们描述了一个程序, 以测试的细胞迁移体外与自动光学相机显微镜。刮伤试验已被广泛使用, 在结束后的划痕是一个设定的周期。光学显微镜能够可靠、廉价地检测细胞的迁移。
这种技术的主要优点是您可以在自动光学显微镜中实时观察细胞。这种治疗的影响延伸到慢性伤口或癌症的治疗，其中迁移在这些疾病中起着至关重要的作用。首先，用每次洗涤 5 毫升无菌无镁和无钙 PBS 洗涤 HaCaT 细胞的汇合培养物两次。
接下来，将细胞与 1 毫升胰蛋白酶在 37 摄氏度的培养箱中孵育 5 到 8 分钟。在光学显微镜下确认分离后，用补充有 FBS 的 9 毫升培养基终止酶促反应。并将细胞稀释至每 250 微升培养基加 FBS 浓度的 7.5 倍 10 至第四个细胞。
接下来，将 250 微升细胞接种到圆底 48 孔组织培养板的每个孔中，然后轻轻地将板从一侧滑到另一侧，以确保细胞均匀分布在孔底。然后将板转移到细胞培养箱中。当培养物达到 90% 至 95% 汇合时，用 250 微升新鲜制备的培养基补充每毫升 10 微克丝裂霉素 C 替换每个孔中的上清液，然后将板放回培养箱中再放置两个小时。
孵育结束时，用 250 μL PBS 洗涤细胞，并向每个孔中加入 250 μL 新鲜 PBS。然后使用 200 微升微量移液器吸头在每个细胞单层上做一个垂直划痕。当所有单层都被划伤后，用 250 微升的目标肽刺激物替换每个孔中的 PBS，并将板安装到光学相机系统中，盖子完好无损。
要设置光学相机，请打开 acquire 窗口并选择 Wound healing（伤口愈合）。选择板类型并取消选择未使用的孔。接下来，单击启用并右键单击其中一个孔以调整焦点以适应细胞的位置。
在图片间隔下设置图像的时间段，并设置重复次数以适应所需的时间段。然后选择适当的分析类型。然后单击开始开始对细胞进行成像。
当伤口发生时，皮肤细胞开始增殖并迁移穿过伤口床以闭合伤口，这一过程可以通过光学相机观察到。孵育 48 小时后，内皮生长因子处理诱导伤口闭合近 95%，而未处理的对照孔为 38%，乳铁蛋白和乳铁蛋白培养物分别为 33% 和 62% 闭合。也可以为每个生长刺激绘制由初始划痕的间隙宽度变化确定的伤口闭合百分比。
该视频介绍了一种简单有效的方案，用于研究角质形成细胞在单层健康细胞中划痕上的迁移。虽然该测定中使用的细胞是 HaCaT 细胞，但该方法也可以应用于其他细胞系、真菌甚至细菌，只要它们粘附在微量滴定板的底部即可。
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概述
本文描述了一种使用自动光学相机显微镜进行体外细胞迁移测试的程序。划痕测试被强调为观察细胞迁移随时间变化的可靠方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 显微镜学
- 体外技术
背景
- 划痕测试是一种广泛用于研究细胞迁移的技术。
- 自动光学显微镜提供了细胞的实时观察。
- 理解细胞迁移对于慢性伤口和癌症治疗至关重要。
- 这种方法具有成本效益，可靠地检测细胞运动。
研究目的
- 展示一种评估细胞迁移的可靠方法。
- 探索细胞迁移在慢性伤口治疗和癌症治疗中的影响。
- 利用自动光学显微镜进行实时分析。
所用方法
- 用PBS洗涤HaCaT细胞的汇合培养物。
- 用胰蛋白酶孵育细胞以使其脱附。
- 用培养基终止酶反应。
- 将细胞稀释至特定浓度进行分析。
主要结果
- 实现了细胞迁移的实时观察。
- 该方法对于监测划痕闭合证明有效。
- 结果可以为慢性伤口和癌症的治疗策略提供参考。
- 自动显微镜增强了迁移评估的可靠性。
结论
- 自动光学显微镜是研究细胞迁移的有价值工具。
- 这种技术可以推动慢性伤口愈合和癌症治疗研究的进展。
- 进一步的研究可能会扩大其在各种生物学背景下的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell migration assays are critical for evaluating therapeutic candidates in wound healing and oncology, yet traditional scratch assays suffer from edge artifacts and manual analysis bottlenecks. This optimized protocol addresses reproducibility challenges by eliminating cation-mediated cell accumulation and integrating automated imaging, enabling consistent, quantitative migration readouts. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, real-time data on pro- and anti-migratory compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying migration changes in response to stimuli like lactoferrin or growth factors.
- Operational Value: Reduces variability from manual scratch analysis and temperature fluctuations through automated optical imaging.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative wound closure metrics from identical scratch sections over time.
- Operational Value: Eliminates labor-intensive image cycling and analysis, improving throughput for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant HaCaT keratinocytes to model epithelial migration, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures assay continuity from discovery to preclinical evaluation via reproducible, automated workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early discovery and enabling quantitative lead identification through measurable migration inhibition or stimulation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating migration as a dependent variable in response to peptide or cytokine treatments.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., % wound closure) that allow comparison across compound libraries or protein variants.
- Analytics: Generates time-series migration data suitable for statistical comparison and dose-response modeling.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance through use of human keratinocyte cells and wound-healing context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for migration assays across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in migration assays.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through automated imaging and consistent scratch preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative migration data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated migration effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and sterile technique for monolayer preparation.
- Dependent on automated optical camera systems with time-lapse and analysis capabilities.
- Necessitates standardization of scratch width and timing across wells for comparable data.
- Involves optimization of PBS washing steps to prevent edge artifacts in different cell lines.
- Limited to adherent cells compatible with microtiter plate bottom attachment.
