一种简便、可再生的新分离大鼠脑微血管膜样品制备方法

该程序的总体目标是从大鼠大脑中分离脑微血管，用于生化研究，旨在了解哺乳动物血脑屏障的分子特征。该方法可以帮助回答血脑屏障生理学和神经药理学中的关键问题，例如健康和疾病中紧密连接蛋白和内源性转运蛋白的调节、定位和表达。该技术的主要优点是，我们可以从个体动物中分离出足够数量的高质量微血管，同时考虑到个体动物之间蛋白质表达的自然变异性。

演示这项技术的将是 Bianca Reilly，她是我实验室的一名优秀本科生。根据文本协议对 Sprague-Dawley 大鼠实施安乐死并斩首后，使用手术剪刀通过单次横向切割从大鼠头骨上切开皮肤。使用 rongeurs，小心地取出颅骨板，并露出大脑。

然后，用抹刀取出器官。分离大脑，将分离的脑组织放入装有 5 毫升 BMB 和 5.0 微升蛋白酶抑制剂混合物的 50 毫升锥形管中。要处理组织，请将其转移到干净的培养皿中。

然后，使用镊子在直径为 12.5 厘米的滤纸上轻轻滚动大脑，以去除松散粘附在大脑皮层上的外脑膜。在此步骤中，应注意确保已从脑组织标本中取出所有脑膜组织。脑膜可以可视化为透明的膜组织，可以很容易地从脑组织中拉出。

轻轻地将脑组织压在滤纸上，然后再次滚动组织，在此步骤中频繁转动滤纸。然后，使用镊子将脉络丛与大脑半球分离。然后，再次轻轻地压平脑组织，并使用镊子去除与白质相邻的嗅球。

将皮质脑组织放入冰镇的玻璃研钵中。然后，加入 5 mL BMB 和蛋白酶抑制剂混合物。使用架空功率匀浆器，将研杵插入研钵中，并以 3， 700 rpm 的速度上下冲程 15 次使脑组织匀浆。

然后，将匀浆倒入标记的离心管中。在样品之间，使用 70% 乙醇清洁研杵。为了进行离心，向每个含有脑匀浆的标记离心管中加入 8.0 毫升 26% 葡聚糖溶液。

将试管倒置两次，然后彻底涡旋样品。使用多个角度对每个样品进行涡旋，以确保脑匀浆溶液与 26% 葡聚糖溶液充分混合。将样品在 5， 000 g 和 4 摄氏度下离心 15 分钟。

吸出上清液，并将沉淀重悬于 5.0 毫升含蛋白酶抑制剂混合物的 BMB 中。然后，涡旋沉淀以确保充分混合。接下来，向每个离心管中加入 8.0 毫升 26% 葡聚糖，并像刚才所示涡旋。

然后，再次离心样品。使用真空瓶和玻璃移液管吸出上清液，并确保含有脑微血管的沉淀不会被破坏。用蛋白酶抑制剂将沉淀重悬于 BMB 中，然后再用 26% 葡聚糖 2 次。

最终离心后，向每个沉淀中加入 5.0 ml BMB 并涡旋以重悬样品。使用本视频中演示的方案，从大鼠大脑中成功分离了完整的微血管。在这张图片中，使用抗 Oatp1a4 的抗体对微血管进行染色，Oatp1a4 是一种在脑微血管内皮细胞质膜上充分表达的转运蛋白。

正如蛋白质印迹所证明的那样，从雌性 Sprague-Dawley 大鼠收获的微血管的膜制剂富含 PECAM-1，也称为 CD31，一种脑微血管系统的标志蛋白。在该方案的优化过程中，在使用两个和四个葡聚糖离心步骤制备的膜样品中观察到 PECAM 富集。根据 Bradford 蛋白测定法测定并列于下表中，膜制备物通常产生的蛋白质浓度在 5.0 毫克/毫升至 10.0 毫克/毫升之间。

值是根据使用 BSA 作为标准生成的标准曲线确定的。此处显示的是 BBB 转运蛋白 Glut1 的蛋白质印迹。在每个膜样品中检测到这种高表达 BBB 蛋白在 54 道尔顿处的清晰单条带。

该图显示了雄性大鼠与雌性大鼠在 BBB 处的 Glut1 表达较高。雄性和雌性动物之间未观察到钠/钾 ATP 酶的表达差异。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 2 到 2 1/2 小时内完成。

在尝试此程序时，重要的是要记住在整个方案中将所有样品保持在冰上，并在离心步骤后从微血管沉淀中吸出上清液时要小心。按照此程序，可以对微血管样品进行其他方法，如免疫共沉淀分析，以回答其他问题，例如血脑屏障上同一蛋白质复合物内不同蛋白质的结合。该技术发展后，为血脑屏障生理学和神经药理学领域的研究人员探索健康和神经系统疾病啮齿动物模型中血脑屏障的分子特征铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何从大鼠大脑中分离出高质量的微血管有一个很好的了解，以便你自己对健康和疾病中的血脑屏障生物学进行研究。