Name: 体外肠道宿主-微生物界面合成细菌联合的可行性评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 了解体外肠道宿主-微生物界面合成细菌联合的可行性评价方法，该方法整合合成口腔菌群与体外胃肠消化模型，用于评估病原体细胞入侵和益生菌制剂存活能力，为食品、制药和营养学研究提供重要工具。

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作者衷心感谢佛兰德斯研究基金会为 Marta Calatayud Arroyo 提供的资助（FWO 博士后基金-12N2815N）。Emma Hernandez-Sanabria 是由佛兰德斯创新与创业署（Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie，IWT）资助的博士后研究员。

1. 菌株与培养条件
注意：该合成口腔菌群由口腔微生物组中常见的菌株组成3。
<ol>
	<li>从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获取以下菌株：Aggregatibacter actinomycetemcomitans（ATCC 43718）、Fusobacterium nucleatum（ATCC 10953）、Porphyromonas gingivalis（ATCC 33277）、Prevotella intermedia（ATCC 25611）、Streptococcus mutans（ATCC 25175）、Streptococcus sobrinus（ATCC 33478）、Actinomyces naeslundii（ATCC 51655）、Streptococcus gordonii（ATCC 49818）、Actinomyces viscosus（ATCC 15987）以及Streptococcus mitis（ATCC 49456）。</li>
	<li>从莱布尼茨微生物与细胞培养物保藏中心（DSMZ）获取Veillonella parvula（DSM 2007），从BCCM/LMG细菌保藏中心获取Streptococcus sanguinis（LMG 14657），并使用Streptococcus salivarius菌株TOVE-R9和Streptococcus oralis10。</li>
</ol>
2. 口腔微生物组代表性多物种群落的构建
注意：构建一个合成菌群以模拟口腔细菌对表面的潜在黏附能力 体外 肠道上皮。按照Hernandez-Sanabria所述方法，在添加了5 μg/mL血红素、1 μg/mL甲萘醌和5%无菌去纤维马血的血琼脂平板上培养细菌。 等 (2017)11简而言之：
<ol>
	<li>将100 mg血红素溶解于2 mL 1 M NaOH中，加入100 mL蒸馏并经高压灭菌的水。储存于避光容器中。在加入培养基前，经0.22 µm滤膜过滤除菌。</li>
	<li>将100 mg甲萘醌溶解于20 mL 96%乙醇中。在加入培养基前，经0.22 µm滤膜过滤除菌。</li>
	<li>根据生产商说明书制备1 L血琼脂培养基（见材料表），并进行高压灭菌。待冷却后加入马血和补充物。混匀后倾注平板。</li>
	<li>按先前报道的方法制备改良脑心浸液（BHI）液体培养基12。高压灭菌后加入5 μg/mL血红素和1 μg/mL甲萘醌。</li>
	<li>将9 mL培养基分装至Hungate管中，用橡胶塞和铝盖密封。用N2/CO2（90%/10%）气体冲洗管内环境。</li>
	<li>用注射器取出1 mL厌氧培养基，置于1.5 mL微量离心管中。挑取各细菌种类的单菌落，重悬于培养基中，再转移回厌氧改良BHI培养基中。除S. salivarius需培养24 h外，其余均在37 °C下培养48 h。</li>
	<li>如需在构建合成菌群前确认培养物纯度，操作如下：
	<ol>
		<li>参照Hernandez-Sanabria et al.（2010）13的方法从液体培养物中提取DNA，使用引物27F（AGAGTTTGATYMTGGCTCAG）和1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACT）扩增16S rRNA基因，并采用以下程序：95 °C预变性5分钟，随后进行30个循环（95 °C变性1分钟、55 °C退火1分钟、72 °C延伸1.5分钟），最后在72 °C延伸5分钟。</li>
		<li>使用商用试剂盒（见材料表）纯化PCR产物，操作遵循生产商说明书。</li>
		<li>在10 μL总反应体系中进行纯化产物的测序反应，体系包含0.5 μL染料（见材料表）、3.2 pmol M13f引物（CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC）、2.0 μL 5x测序缓冲液和20 ng模板，使用商用测序系统及配套试剂盒（见材料表）。 
		注：本步骤由商业服务机构完成。</li>
		<li>对所有序列进行BLAST比对分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），确定最接近的已知分类单元，并使用RDP Classifier在线工具（http://rdp.cme.msu.edu/）和SINA比对服务（https://www.arb-silva.de/aligner/）与原始菌株序列进行比对。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参照Hernandez-Sanabria et al.（2017）11所述方法，使用流式细胞术结合SYBR Green/碘化丙啶染色测定培养结束时的细胞数量。用改良BHI培养基将菌液稀释至105 cells mL-1。</li>
	<li>将1 mL S. mitis加入75 mL厌氧BHI培养基中，培养至稳定期（6 h）。随后，在厌氧条件下收集每种稀释菌株各0.75 mL并混合。</li>
	<li>所有菌液混合后，取1 mL微生态系统样品加入75 mL BHI培养基中。将合成菌群置于含10% CO2、10% H2、80% N2的气体环境中，在37 °C、200 rpm条件下培养48 h（见材料表）。</li>
	<li>在将菌群接种至细胞模型前，参照步骤2.8测定细胞密度。可使用定量实时PCR结合Slomka et al.（2017）10中表1提供的引物及退火温度分析菌群组成。此外，可采用16S rRNA基因扩增子测序以获取初始菌群成员信息13,14。对于任一用于鉴定身份的实验方案，均应以cDNA为模板反映正在活跃转录蛋白的细菌，以DNA为模板揭示菌株的存在与否。</li>
</ol>
3. 细胞培养通用操作规范
注意：关于细胞培养的一般性操作，作者参考了 Master 和 Stacey（2007）15。所使用的细胞系可从英国公共卫生署（Public Health England, UK）的欧洲认证细胞库（European Collection of Authenticated Cell Cultures）获取（Caco-2 ECACC 86010202 和 HT29-MTX-E12 ECACC 12040401）。细胞培养所需试剂可购买获得（见材料表），除非另有说明。
<ol>
	<li>Caco-2 和 HT29-MTX 细胞系的维持与传代 
	注意：Caco-2 和 HT29-MTX 细胞通常在含有补充成分的 DMEM 培养基（表1）的 25 cm2 组织培养瓶中常规培养。当细胞融合度达到 60–70% 时进行胰酶消化传代。
	<ol>
		<li>从培养瓶中移除细胞培养基。用不含 Ca++/Mg++ 的 PBS 洗涤两次，每次 5 mL。</li>
		<li>加入 2 mL 含 0.5 mg/L 胰酶和 0.22 g/L 乙二胺四乙酸（EDTA）的溶液。轻轻晃动培养瓶使胰酶溶液分布均匀。吸出 1.5 mL 胰酶溶液，将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞是否已从瓶壁脱落。如需要，可额外孵育 5 分钟。</li>
		<li>向培养瓶中加入 5 mL 含补充成分的细胞培养基以中和胰酶活性。用移液器反复吹打，获得均一的单细胞悬液。</li>
		<li>立即取 50 µL 细胞悬液，与无菌的 0.4% 台盼蓝溶液按 1:1（v/v）比例混合（Caco-2 细胞）或 1:5（v/v）比例混合（HT29-MTX 细胞）。通过移液器吹打混匀后，加入细胞计数板（见 材料表）。</li>
		<li>在显微镜下计数活细胞（明亮的白色细胞）（参见仪器制造商说明书）。</li>
		<li>将细胞以 Caco-2 细胞 4 × 105 个细胞/cm2、HT29-MTX 细胞 1 × 104 个细胞/cm2 的密度接种至新培养瓶中。 
		注意：(1) Caco-2 细胞在达到融合状态后会分化并形成紧密连接。因此，在胰酶消化前必须避免过度融合。细胞在培养瓶中过度生长可能导致胰酶消化后细胞无法脱落和/或形成细胞团块。(2) HT29-MTX 细胞为黏液分泌型细胞，具有较高的代谢活性16。这些特性可能导致细胞培养基快速酸化，尤其是在细胞密度较高时。可在细胞培养基中添加 HEPES 缓冲液（表1），以维持 pH 在 7 至 7.2 之间。若 pH 下降，且细胞融合度低于 50%，可更换培养基；但若融合度 &#62;50%，则必须对细胞进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 构建模拟肠道宿主-微生物界面的多区室细胞模型
注意：在双室培养板孔中进行共培养（直径 24 mm，孔径 0.4 μm；参见材料表）。
<ol>
	<li>向顶端室加入1.5 mL完全细胞培养基，向基底室加入2 mL。接种前预孵育20–30分钟，以确保细胞悬液分布均匀。</li>
	<li>用胰蛋白酶消化Caco-2和HT29-MTX细胞培养物，操作步骤如第3节所述。必须严格遵循胰蛋白酶消化程序，以获得两种细胞系均匀分布、无细胞团块的单细胞悬液。</li>
	<li>按照3.1.8节所述方法计数活细胞。</li>
	<li>调整细胞密度至 6.5 x 104 细胞/厘米²2 Caco-2/HT29-MTX 细胞比例为 90/10</li>
	<li>将细胞悬液充分匀浆，然后加入相应体积的Caco-2和HT29-MTX细胞至已预装含补充物的细胞培养基的无菌容器中。通过抽吸去除培养室顶端预孵育的培养基。</li>
	<li>用移液器轻轻吹打细胞悬液混匀，取1.5 mL加入培养小室插入物的顶室。接种过程中需持续保持细胞悬液的均匀性，因为细胞易发生沉降。根据操作者的熟练程度和操作速度，在分装1–3个孔后必须重新混匀细胞悬液。</li>
	<li>轻轻前后移动培养板，然后从右至左再至右移动（5–10 次），使细胞在孔内均匀分散。转移至培养箱中，并重复上述移动操作。</li>
	<li>将Caco-2/HT29-MTX细胞共培养15天，每2天用添加物补充的DMEM培养基更换顶腔和基底腔培养液。此后，细胞培养基可更换为不含抗生素/抗真菌剂溶液的添加物补充DMEM培养基。</li>
	<li>接种后每隔2天更换一次培养基，持续培养至第20–21天。</li>
	<li>在开始实验前，使用电阻测量系统（见材料表）按照制造商说明测量上皮屏障的完整性。
	<ol>
		<li>确保TEER设备已充满电（&#62;24 小时）后开始测量。</li>
		<li>将TEER设备从电源断开，并用塑料 autoclave 袋覆盖。在袋上打一个孔以便引入电极，并将电极插入仪表的输入端口。在将TEER设备放入超净工作台前，用70%乙醇/水（v/v）喷洒消毒。</li>
		<li>为对电极进行消毒，将电极尖端浸入70%乙醇/水（v/v）溶液中15 min。静置空气干燥15 s。用预温的细胞培养基冲洗电极。</li>
		<li>从培养箱中取出细胞，在生物安全柜内使细胞恢复至室温。</li>
		<li>确保电表已与充电器断开连接。将模式开关调至欧姆档，并打开电源开关。</li>
		<li>将电极的短端浸入插入物中，长端置于孔外，测量细胞电阻。保持电极与板插入物呈90°角。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细菌在以下条件下的存活情况 体外 胃肠道转运条件
注意：按照 Minekus 等（2014）17 的方案制备模拟消化液，并进行如下所述的修改。所有稀释均使用超纯水进行。所有溶液均需通过 0.22 µm 滤器过滤除菌，并在无菌条件下进行消化操作。
<ol>
	<li>口腔消化：
	<ol>
		<li>将3 mL细菌群落置于50 mL无菌离心管中，加入3 mL模拟唾液液（SSF），其成分为（单位：mmol L-1）：KCl, 15.1；KH2PO4, 3.7；NaHCO3, 6.8；MgCl2(H2O)6, 0.5；(NH4) CO3, 0.06；HCl, 1.1；CaCl2(H2O)2, 0.75。向SSF中添加来自人唾液的α-淀粉酶（Type IX-A），终浓度为75 U/mL，并加入2 g/L猪胃黏蛋白（type II）。</li>
		<li>在37 °C、100 rpm条件下孵育2分钟。取2 mL样品用于DNA提取和流式细胞术定量分析（S1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胃消化：
	<ol>
		<li>向体系中加入4 mL模拟胃液（SGF），其成分为（单位：mmol L-1）：KCl, 6.9；KH2PO4, 0.9；NaHCO3, 25；NaCl, 47.2；MgCl2(H2O)6, 0.1；(NH4) CO3, 0.5；HCl, 15.6；CaCl2(H2O)2, 0.075。此外，SGF中还含有2 g/L猪胃黏蛋白（type II）。</li>
		<li>测定pH值，必要时用1 M HCl调节至pH 3。在37 °C、100 rpm条件下孵育。取2 mL样品（S2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小肠消化：
	<ol>
		<li>向消化管中加入4 mL模拟肠液（SIF），其成分为（单位：mmol L-1）：KCl, 6.8；KH2PO4, 0.8；NaHCO3, 85；NaCl, 38.4；MgCl2(H2O)6, 0.33；HCl, 8.4；CaCl2(H2O)2, 0.3。</li>
		<li>必要时用1 M NaOH调节至pH 7。在37 °C、100 rpm条件下孵育。取2 mL样品（S3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 细菌定植能力检测 体外 胃肠道转运条件
<ol>
	<li>取2 mL小肠消化液，在2,650 × g 条件下离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将菌体沉淀与5 mL不含抗生素和抗真菌剂的补充DMEM培养基混合。</li>
	<li>使用流式细胞仪（见材料表）对完整/受损细胞进行染色并定量，方法参照Hernandez-Sanabria et al. (2017)11 的描述。</li>
	<li>用不含抗生素和抗真菌剂的补充DMEM培养基稀释，将细胞密度调整至每毫升含105 个活细胞。</li>
	<li>移除transwell系统的顶室培养基，加入1.5 mL细菌悬液。在常规细胞培养条件下（37 °C，95%湿度，5% CO2）共培养2小时。 
	注意：根据实验方案需要，共培养时间可延长至48小时。为避免污染，共培养可在与常规细胞传代不同的培养箱中进行。</li>
	<li>孵育结束后测定TEER值，以评估上皮屏障完整性，方法见4.11节。</li>
	<li>孵育结束后，移除顶室培养基，并收集0.5 mL用于后续分析（S4）。可取部分培养基样品，按照试剂盒说明书使用乳酸脱氢酶（LDH）检测法（见材料表）评估细胞活力。</li>
	<li>加入0.5 mL含10 mM N-乙酰半胱氨酸的HBSS（NAC缓冲液），以溶解HT29-MTX细胞产生的黏液并回收黏附的细菌。将培养板在37 °C、135 rpm振荡条件下孵育1小时（见材料表）。</li>
	<li>将NAC-HBSS溶液转移至微量离心管中（S5），并用1 mL DPBS洗涤细胞两次。</li>
	<li>在单层细胞上加入0.5 mL 0.5% Triton X-100（w/v），通过移液器吹打使细胞裂解，收集液体后涡旋震荡1分钟。操作速度至关重要，以避免去垢剂损伤细菌细胞。</li>
	<li>在2,650 × g 条件下离心5分钟，分离上清液（S6）和沉淀（S7）。</li>
</ol>
7. 样品分析
注意：在模拟胃肠道消化后，分析收集的样品（S1-S7），以评估细菌的存活能力及其对肠道细胞的黏附潜力。
<ol>
	<li>细菌活力：将样品 S1-S5 依次通过 0.45 µm 滤膜两次，并采用活/死细胞染色结合流式细胞术对细菌细胞进行定量，具体操作如步骤 2.811 所述。</li>
	<li>黏附潜能：对 S1-S6 样品进行连续稀释（-1 至 -8），取 10 µL 涂布于血琼脂平板和改良 BHI 平板上。在 37 °C 厌氧条件下培养 24–48 小时。对未稀释的 S7 样品取相同体积进行涂布。
	<ol>
		<li>黏附细菌的分类学鉴定：
		<ol>
			<li>用接种环挑取单个菌落，悬浮于 10 µL 无核酸酶水中。取 4 µL 该悬浮液作为模板，使用 2.7.1 中所述引物和条件对 16S rRNA 基因进行 PCR 扩增。</li>
			<li>按照 2.7.3 中的方案进行测序，并采用 2.7.4 中所述程序对序列进行验证。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要进行后续分析，如总 DNA 提取、qPCR 定量和/或 16S rRNA 扩增子测序、RNA 提取及转录组分析。 
	注意：流式细胞术定量在取样后立即进行。以经 70 °C 处理 3 分钟的样品作为细胞膜通透性对照。通过流式细胞术检测消化液或无菌条件下细胞培养模型获得的样品，评估背景噪声。每个样品均设三个重复。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

口腔微生物组是人体健康的关键因素，这一点已被多位研究人员近期报道20,21。先前的研究结果表明，摄入含有大量细菌的唾液可能影响小肠的微生物生态系统，而小肠是免疫启动的主要部位之一。将静态的上消化道消化模型与代表宿主界面的肠上皮细胞及黏液分泌细胞相结合，有助于揭示微生物组分对宿主的影响。
体外模型是研究的基本工具，可用于开展机制性研究，并获得旨在减少、提高效率以及更精准定位体内研究的基础知识。因此，在构建合成微生物群落之前，确保无杂菌培养物的纯度、活性和最佳生长状态至关重要。我们建议在将细菌群落暴露于细胞培养物之前，评估其活性和组成，以避免分析结果出现偏差。大量受损细菌可能阻碍黏附作用，进而影响细胞模型的完整性。此外，使用可靠的细胞系来源可最大限度地减少细胞系误认、污染和注释错误，从而提高实验的可重复性22。
加入产黏液细胞可模拟...

人类与细菌共同生活，细菌数量与人体细胞数量相当1。因此，全面了解人类微生物组至关重要。口腔是一个独特的环境，被划分为多个较小的生态位，因而不同区域含有多种多样的细菌和生物膜。作为一个开放的生态系统，口腔中的某些菌种可能是短暂存在的。然而，某些微生物在出生后不久即定植，并形成有序的生物膜2。这些生物膜存在于龈沟上方的牙面、龈下龈沟、舌面、黏膜表面以及牙科修复体和充填物上3。细菌也可能以絮状物或浮游细胞的形式存在于牙根管腔内，或与坏死的牙髓组织混合，或悬浮于液体环境中。
宿主细胞与定植微生物群之间存在着活跃且持续的相互交流4细菌在种内和种间进行交流，仅有少数天然定植菌能够直接黏附于组织表面，而其他细菌则附着于这些初始定植菌。例如，微生物之间的细胞-细胞结合对于将继发性定植菌整合入口腔生物膜并形成复杂的相互作用微生物网络至关重要。4唾液样本中约70%的细菌聚集体由 卟啉单胞菌属 sp. 链球菌 sp. 普雷沃菌属 sp. 韦荣球菌 sp. 和未鉴定种 拟杆菌门. F. nucleatum 是龈下生物膜中的中间定植菌，可与晚期定植菌发生聚集 牙龈卟啉单胞菌，齿垢密螺旋体 和 Tannerella forsythia，这些与牙周炎有关5此外， Streptococcus mitis 同时占据黏膜和牙体栖息地，而 S. sanguinis 和 S. gordonii 更倾向于定植于牙齿3因此，血链球菌 存在于下门齿和犬齿中，而 Actinomyces naeslundii 已在上颌前牙发现6.
此外，固有微生物组在维持人体健康方面发挥着重要作用2。常驻微生物群参与免疫系统的发育训练，并防止病原体的过度增殖。这种定植抗性产生的原因是，本地细菌可能更善于附着于表面，并更高效地代谢可利用的营养物质以支持自身生长。尽管益生菌菌株能够耐受胃肠道的通过并保持活性，但来自胃肠道上部区域、被吞咽进入下部的原生细菌的存留情况尚未被充分阐明。因此，我们将一个代表口腔生态系统的模拟菌群暴露于模拟的胃肠道转运条件下。通过一种模拟肠道上皮的多室模型，评估了细菌细胞的存活能力。目前的肠道模拟系统在腔内微生物群落分析方面已具备良好的可重复性7。然而，细菌黏附与宿主-微生物相互作用通常被分别研究，因为将细胞系与复杂的微生物群落结合仍存在技术挑战8。相比之下，我们提出了一种框架，可为在肠道界面观察到的成功定植现象提供潜在的机制性解释。事实上，该模型可与静态肠道模型联合使用，以评估微生物群落对宿主表面信号传导的影响。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aggregatibacter actinomycetemcomitans &lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC 43718</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Fusobacterium nucleatum &lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC 10953</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Porphyromonas gingivalis &lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC 33277</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Prevotella intermedia &lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC 25611</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Streptococcus mutans &lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC 25175</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Streptococcus sobrinus &lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC 33478</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Actinomyces viscosus &lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC 15987</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Streptococcus salivarius&amp;nbsp; TOVE-R&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Streptococcus mitis &lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC 49456</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Streptococcus sanguinis &lt;/em&gt;</td><td>BCCM/LMG 细菌保藏中心</td><td>LMG 14657</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Veillonella parvula &lt;/em&gt;</td><td>莱布尼茨微生物与细胞培养物保藏中心（DSMZ）</td><td>DSM 2007</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Streptococcus gordonii &lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC 49818</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caco-2 细胞</td><td>欧洲认证细胞培养物保藏中心</td><td>86010202</td><td></td></tr><tr><td>HT29-MTX 细胞</td><td>欧洲认证细胞培养物保藏中心</td><td>12040401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂与耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>脑心浸液（BHI）肉汤</td><td>Oxoid</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>血琼脂 2</td><td>Oxoid</td><td>CM0055</td><td>血琼脂培养基</td></tr><tr><td>甲萘醌</td><td>Sigma</td><td>M9429</td><td></td></tr><tr><td>血红素</td><td>Sigma</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>5% 无菌脱纤维马血</td><td>E&amp;O Laboratories Ltd,</td><td>P030</td><td></td></tr><tr><td>InnuPREP PCRpure 试剂盒</td><td>Analytik Jena</td><td>845-KS-5010250</td><td>PCR 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>Big Dye</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337454</td><td>测序染料</td></tr><tr><td>ABI Prism BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337456</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&amp;nbsp;Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>未包被、细胞培养处理、带通气盖、无菌的 T25 培养瓶</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液&lt;br/&gt; 0.4%，液体，无菌过滤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>含 GlutaMAX 和丙酮酸钠的 DMEM 细胞培养基</td><td>Life technologies</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 聚酯膜细胞培养小室</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3450-24EA</td><td></td></tr><tr><td>猪胃黏蛋白 II 型&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2378</td><td></td></tr><tr><td>灭活胎牛血清</td><td>Greiner Bio One</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂（100X）</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用 Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的 DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Pierce LDH 细胞毒性检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88953</td><td></td></tr><tr><td>Corning HTS Transwell-24 孔，孔径 0.4 &amp;micro;m</td><td>Corning Costar Corp</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Serva Electrophoresis</td><td>28539010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>改进型 Neubauer 计数板</td><td>Carl Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer 24 匀浆器</td><td>MoBio</td><td>13155</td><td></td></tr><tr><td>T100 梯度 PCR 仪</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>冲洗系统</td><td>定制</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>InnOva 4080 恒温摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>8261-30-1007</td><td>用于 2.10 的摇床</td></tr><tr><td>Memmert CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Memmert GmbH &amp; Co.</td><td>ICO150med</td><td></td></tr><tr><td>Millicell ERS（电阻力系统）</td><td>EMD Millipore, Merck KGaA</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Milli-Q academic 超纯水系统</td><td>Millipore, Merck KGaA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>摇床（ROCKER 3D basic）</td><td>IKA</td><td>4000000</td><td>用于 6.10 的摇床</td></tr></tbody></table>

评估合成细菌群落在其上的存活能力 体外 肠道宿主-微生物界面

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

宿主与微生物群之间的相互作用早已被认识并得到广泛描述。口腔与其他胃肠道部位相似，存在常驻微生物群，可防止外源性细菌的定植。事实上，口腔中已发现超过600种细菌，单个个体在任何时间点可能携带约100种不同的细菌。口腔细菌具有附着于口腔生态系统中各种生态位的能力，从而融入常驻微生物群落，并促进其生长与存活。然而，吞咽过程中细菌进入肠道可能扰乱肠道微生物群的平衡。事实上，口服牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）可改变回肠菌群的细菌组成。我们采用合成菌群作为天然口腔生态系统的简化模型，以阐明口腔细菌在模拟胃肠道转运条件下的存活能力与活性。选取14种细菌，经体外（in vitro）唾液、胃液和肠液消化处理后，引入包含Caco-2和HT29-MTX细胞的多室细胞模型，以模拟肠道黏膜上皮。该模型用于揭示被吞咽细菌对参与肠肝循环的细胞的影响。使用合成菌群可实现良好的可控性与可重复性。因此，该方法可适用于评估病原体的存活能力及后续炎症相关变化、益生菌混合物的定植能力，以及最终对肝前循环的潜在细菌影响。

该方案可建立一种适用于阐明口腔细菌在模拟胃肠道转运条件下存活与存活性的模型。来自各菌株的完整细胞数量约为108 细胞/mL-1 在合成群落建立之前，多物种微宇宙在群落构建过程中含有超过90%的可存活细胞图1A 和 1B）。根据活/死菌定量结果，每次消化步骤后细菌活力均有所下降（图2）。这可能是由于胃部通过期间的酸性pH以及小肠消化液中含有的胆盐所致，这些情况在生理条件下会发生。在通过两者的过程中存活率 体外 和 体内 胃肠道消化可能依赖于环境的差异（例如， 喂养 与 空腹条件），甚至细菌保护过程（孢子形成或肠溶包衣）。
流式细胞术计数必须与适当的对照（如...

采用一种新颖的方法评估肠道宿主-微生物相互作用，该方法结合了合成口腔菌群、体外胃肠道消化以及小肠上皮模型。本文介绍了一种可灵活应用于评估病原体细胞侵袭、多物种生物膜形成，甚至益生菌制剂存活能力的方法。

宿主与微生物群之间的相互作用早已被认识并得到广泛描述。口腔与其他消化道部位相似，……

该模型是设定上消化道宿主微环境方向的下一步进展。它能够解决机制性研究问题，并为食品、制药、营养保健品行业以及毒理学领域提供诸多机遇。该技术的主要优势在于，它将胃肠道系统模型与宿主微界面相结合，其中包含复杂的微生物群落。该方法具有很高的适用性和灵活性。可采用其他细胞类型来应用此方法，以评估病原体的存活能力及相关后续信息。该方法还可用于辅助评估益生菌混合物的定植能力，以及细菌对全身循环系统的潜在影响。首先，将培养基进行高压灭菌，然后加入终浓度为 5 µg/mL 的血红素（hemen）和 1 µg/mL 的甲萘醌（menadione）。将 9 mL 培养基分装至 Hungate 试管中，用橡胶塞和铝盖密封。随后，用 90% 氮气和 10% 二氧化碳的混合气体对试管进行通气处理。用注射器吸取1毫升厌氧培养基，转移至1.5毫升微量离心管中。挑取每种细菌的单菌落，并将其重悬于培养基中。然后将菌落转移至改良的厌氧BHI培养基中，在37°C下培养48小时。孵育结束后，使用经滤膜灭菌的 PBS 将培养物稀释至每毫升含 10⁵ 个细胞。然后采用流式细胞术结合赛博绿-碘化丙啶染色法检测细胞数量。评估微生物组群落组成及细胞活性对于避免实验偏差至关重要。从培养瓶中移除细胞培养基，然后用 5 mL 不含钙和镁的 PBS 洗涤细胞一次。向细胞中加入 2 mL 胰蛋白酶 EDTA 溶液，轻轻晃动培养瓶使溶液均匀分布。然后移除 1.5 毫升胰蛋白酶溶液，将培养瓶置于 37 摄氏度孵育 10 分钟。在显微镜下观察细胞是否已脱落，若已脱落，则向培养瓶中加入 5 毫升添加了补剂的细胞培养基以灭活胰蛋白酶，并反复吹打获得均匀的单细胞悬液。立即取 50 微升该细胞悬液与无菌的 0.4% 台盼蓝溶液按 1:1 体积比混合（KCO2 细胞）或按 1:5 体积比混合（HT29MTX 细胞）。用移液器混匀，将细胞悬液加入计数板，然后在显微镜下进行细胞计数。根据文本方案制备KCO2和HT29MTX细胞悬液后，充分混匀悬液，并将相应体积的KCO2和HT29MTX细胞加入已预装含补充物的细胞培养基的无菌容器中。从先前制备好的培养小室的顶端吸出预孵育的培养基。用移液器轻轻吹打混匀细胞悬液，取1.5毫升转移至培养小室插入物的顶端室中，每处理一到三个孔后需再次混匀细胞悬液，以确保悬液始终均匀。轻轻将培养板前后移动，然后再左右移动，使细胞在孔内均匀分布。将培养板放入培养箱中，并重复上述移动操作。细胞接种时需持续均质化细胞悬液，以确保细胞在孔板中分布均匀。在开始ASA实验前，为检测上皮屏障完整性，需确保TER设备在测量开始前已充满电。将TER设备从电源断开，并用塑料 autoclave 袋覆盖。在袋子上打一个孔，以便将电极插入仪表的输入端口。然后在将层流设备转移至超净工作台前，用70%乙醇喷洒袋子。为消毒电极，需将电极尖端浸

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

体外肠道宿主-微生物界面合成细菌联合的可行性评价

本文描述了一种合成操纵子的设计，该操纵子编码卷曲纤维的分泌装置及其结构单体。E.

通过构建单个合成卷曲菌毛操纵子工程化黏附性细菌

来源： Arroyo, M. C., 等 评估合成细菌群落在其上的存活能力 体外 肠道宿主-微生物界面 视频实验杂志...

暴露合成口腔细菌群落于模拟消化阶段

来源：Calatayud Arroyo, M., et al. 在体外肠道宿主-微生物界面评估合成细菌群落的存活能力。J. Vis. Exp.

体外肠道模型评估细菌黏附与内化

基于荧光的口腔厌氧菌活力评估

在本视频中，我们介绍了建立一个 离体 用于研究小鼠肠组织片段与特定肠道细菌相互作用的肠道器官培养系统。该装置包含两对进出液端口，第一对连接肠组织管腔并将其与特定细菌悬液相连，第二对持续向装置的孔中供给培养基以维持 离体...

一种用于研究宿主-微生物群相互作用的离体肠道器官培养系统

在肠道芯片微流控装置中将活性微生物组与微工程化人肠绒毛共培养

本文介绍了一种在体外培养结肠肠道微生物群的实验方案,...

应用先进的体外培养技术研究人类肠道微生物群

本方案描述了一种体外批次培养发酵系统，用于研究人类粪便微生物群。通过使用菊粉（一种广为人知的益生元，也是研究最广泛的微生物群调节剂之一），展示该系统在评估特定干预措施对粪便微生物群组成及代谢活性影响中的应用。...

一种体外批次培养模型用于评估干预方案对人类粪便菌群的影响

本文描述了一种利用体外批次发酵系统研究内源性物质与人类肠道微生物群相互作用的实验方案。...

利用体外批次发酵系统分析内源性代谢物与人体肠道微生物群的相互作用

本文介绍了一种利用新型肠道器官培养系统分析宿主-微生物组相互作用的独特方法 离体 实验。...

一种用于分析宿主-微生物群相互作用的肠道类器官培养系统

本方案详细介绍了用于在厌氧条件下进行复杂粪便菌群连续流培养的微型生物反应器阵列的组装方法。我们还讨论了反应器的组装、接种以及取样方法，以便后续分析。...

复杂粪便菌群连续培养的生物反应器组装

了解体外肠道宿主-微生物界面合成细菌联合的可行性评价方法，该方法整合合成口腔菌群与体外胃肠消化模型，用于评估病原体细胞入侵和益生菌制剂存活能力，为食品、制药和营养学研究提供重要工具。

评估合成细菌群落在其上的存活能力体外肠道宿主-微生物界面

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