Name: 前体钙成像用于可视化大脑对果蝇内分泌信号的反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 学习离体钙成像技术用于研究果蝇大脑对内分泌信号的神经反应。该方法利用GCaMP6荧光指示剂检测神经元激活，帮助研究者探索激素调控脑功能的机制。

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本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（15K07147、17K07419）（授予石本博、佐野弘子）、稻盛财团研究资助（授予HI）以及熊本大学分子胚胎学与遗传学研究所发育医学共同利用/共同研究中心项目的资助（授予HS）。我们感谢上口泉博士和山田大地先生在使用成像系统方面提供的帮助。

1. 幼虫脑外植体的制备
<ol>
	<li>制作成像室。 
	注意：稳定的记录需要将脑组织外植块固定。此处使用一种低成本、手工制作的成像室进行 Ca2+ 成像系统
	<ol>
		<li>使用镊子在塑料培养皿（35 mm × 10 mm）底部中央轻轻刮擦，形成凹痕，以容纳幼虫脑的腹神经节，便于后续制片（步骤 1.3， 图1).</li>
		<li>用牙签在凹槽两侧各放置一滴少量的超级胶水，然后将一根钨丝（直径0.125 mm，长度6至7 mm）粘附在胶水上。</li>
		<li>使用一小块类似腻子的可重复利用粘合剂，在凹槽周围制作一个圆形壁（直径10 mm，高3 mm）图1). 
		注意：墙体内部空间随后将用磷酸盐缓冲液（PBS；0.14 M NaCl，0.0027 M KCl，0.01 M PO43-，pH 7.4 ± 0.05（25 °C 时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物准备 
	注意：对于钙成像，需在目标细胞类型中表达钙指示剂 GCaMP6s，这通常通过组织特异性 GAL4 与 UAS-GCaMP6s为确保信号通过候选受体介导，还需在受体缺陷型突变体中表达 GCaMP6s。
	<ol>
		<li>当需要对不同基因型（如野生型和突变体）进行实验比较时，应使测试幼虫的年龄相匹配，以避免因发育阶段不同导致的GCaMP6表达水平差异和生理差异。</li>
		<li>将亲代果蝇（每种性别各30只）置于含有标准果蝇培养基的培养管中，静置8小时，以允许果蝇在培养基表面产卵。在25 °C、60–70%相对湿度条件下，按12小时光照-12小时黑暗循环进行大量培养幼虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>幼虫脑解剖
	<ol>
		<li>在产卵后90-120小时，收集幼虫并用蒸馏水至少清洗3次，以去除附着的食物残渣。</li>
		<li>将一条幼虫置于盛有冰冷 PBS 的 1.5 英寸方形表面皿中。 
		注意：接下来的两个步骤需在解剖显微镜下的此培养皿中进行。</li>
		<li>用镊子轻轻夹住幼虫的中部，用另一把镊子夹住口钩，轻柔地拉动口钩，将包含脑的幼虫前部与身体其余部分分离。 
		注意：也可使用手术剪。</li>
		<li>用镊子夹住幼虫前端，将幼虫翻转。去除附着在脑部的多余组织，例如成虫盘、脂肪体和围心体。轻柔地将脑部分离出口器。</li>
		<li>在成像腔室中由可重复使用的腻子状粘合剂形成的环内加入 200 µL PBS。用巴斯德吸管轻轻吸取含有解剖所得脑组织的 PBS，然后将其转移至成像腔室中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将大脑置入成像室
	<ol>
		<li>用镊子夹住从腹神经节延伸出的肌纤维。将脑组织轻轻插入钨丝下方的凹槽内。</li>
		<li>使用另一把镊子将钨丝轻轻向上提起，以将脑组织调整至成像的正确位置（图1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 钙信号的获取2+ 荧光图像
注意：将浸没在PBS中的脑组织样本置于配备20倍水浸物镜（数值孔径N.A. = 0.5）的荧光显微镜下进行成像。PBS不会激活脑内细胞。若需采集Z轴图像，物镜需配备压电驱动的镜头移动装置。使用转盘共聚焦成像系统以提高时间分辨率。在弱光成像条件下，显微镜配备电子倍增电荷耦合器件相机。GCaMP6s荧光成像（激发/发射波长：488/509 nm）需使用488 nm激光器激发，并配备二向色镜和发射滤光片例如528 ± 38 nm 带通滤光片
<ol>
	<li>将含有脑组织外植体的成像室置于显微镜下。</li>
	<li>将物镜降低至接触PBS。在明场照明下，调整脑组织位置并使其对焦。切换至荧光照明，并对GCaMP6s标记的细胞进行调焦。 
	注意：GCaMP6s 的基础绿色荧光应可见。</li>
	<li>在水冷模式下，使用适当的采集软件，以250 ms/帧的速度和512 × 512像素的分辨率开始采集例如，µManager）。调整曝光时间，使荧光值处于CCD相机的动态范围内，但不低于1000（任意单位），适用于16位图像（动态范围0-65,535）。 
	注意：应使用较短的曝光时间以尽量减少GCaMP6s的光漂白。曝光时间需在每次实验中进行优化，因其取决于GCaMP6的表达水平和检测系统的灵敏度。在本实验中，曝光时间为100 ms。 dilp2&#62;GCaMP6s 当特定成像深度需要进行z轴层扫时，可根据曝光时间和帧间隔获取多个z轴层面图像。若相机具有足够的空间分辨率，应增大像素合并（binning）尺寸（即芯片上合并为一个数字像素的感光单元数量），以缩短曝光时间。</li>
	<li>确定成像参数后，在给予肽之前采集1分钟图像以检测基线信号强度（F0).</li>
	<li>加入测试肽；具体操作为，将100 µL肽溶液溶于PBS中，并直接用移液器加入幼虫浴液，以达到最佳浓度。 
	注意：肽溶液应缓慢注射（例如，使用移液器将流速为20 µL/s的溶液加入浴液中。以溶于PBS的无关合成肽作为阴性对照。</li>
	<li>记录 GCaMP6s 发射信号数分钟。</li>
</ol>
3. 数据分析
注意：成像数据使用 ImageJ 离线分析。在延时成像过程中，移液操作会导致幼虫大脑移动，因此在分析前应校正连续图像的位置偏差。可使用 ImageJ 插件 TurboReg 按如下步骤进行校正。
<ol>
	<li>打开分析软件，使用第一帧图像（施加肽之前）作为参考图像。</li>
	<li>选择 Plugins | Registration | TurboReg。</li>
	<li>将序列图像文件选为 Source，将参考图像选为 Target。</li>
	<li>分别选择 Rigid Body（图像的平移和旋转）和 Accurate（&#34;Fast&#34; 为粗略但快速的分析）作为处理方法和质量选项。</li>
	<li>点击 Batch 以开始图像处理。</li>
	<li>在 ImageJ 中使用 Analyze | Tools | ROI Manager 选择多个感兴趣区域（ROIs）。</li>
	<li>在 ROI Manager 窗口中点击 More | Multi Measure | OK，测量像素强度。</li>
	<li>计算 ΔF/F0 = (F - F0)/F0，其中 F 为刺激发生时 ROI 的强度，F0 为特定实验事件发生前立即时间段内的强度（e.g., 刺激开始前的 30 帧）。</li>
	<li>使用多个脑组织样本重复实验，并进行统计分析，以获得每个时间点的均值和均值标准误（SEM）。</li>
</ol>

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<li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li>
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<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的Ca2+成像方法是一种用于检测激素在脑内功能的有效系统。在体条件下，脑接收来自多种内分泌器官的激素。此外，脑持续接收上行的感觉信息，从而引起神经元的自发性激活。该离体系统可消除此类干扰，相比在体成像具有更高的信噪比。在此系统中，可单独或联合测试分子。除肽类激素外，任何水溶性分子（包括天然或合成化合物）均可施加于脑组织外植体。
进行 Ca2+ 成像时，需要固定脑组织外植体。为此，以往曾使用由低熔点琼脂糖或纤维蛋白制成的凝胶基质16,17。这些凝胶基质虽可稳定固定样品，但组织需暴露于30 °C以上的温度，而该温度会引发变温动物（如昆虫）的热休克反应。为避免热应激，可采用物理方式固定脑组织。将附着于体壁的脑组织用昆虫针固定18。我们使用钨丝的方法可实现简单且稳定的样品固定。该系统制备简便、可重复使用，并且与凝胶包埋法相...

器官之间的相互通讯是一种在进化上保守的策略，用于维持稳态以应对环境变化。在人体中，多种激素由内分泌腺释放进入血液循环。这些激素中的许多作用于大脑的下丘脑，从而调控代谢过程以及摄食等基本行为1,2。许多激素是利用哺乳动物模型发现的。然而，这些激素的作用机制，尤其是它们所参与的器官间网络，仍 largely 不清楚。
Drosophila melanogaster 已成为研究器官间通讯的有用模型。在昆虫中，许多生理过程由激素调控。早期关于生长和变态的研究使用了体型较大的昆虫。在这些研究中，通过特定器官的切除或移植，预测了器官间信号分子的存在；随后，昆虫激素中的保幼激素（Juvenile hormone, JH）、前胸腺促激素（Prothoracicotropic hormone, PTTH）和蜕皮激素（Ecdysone）被成功地通过生物化学方法纯化3,4,5。目前认为，一大类细胞间信号肽参与调控昆虫生命周期中的多种生理事件6,7。这些肽大多作用于G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs），尽管最初使用传统方法难以鉴定其对应的特异性GPCR。《Drosophila全基因组序列》的发表8&#160;成为关键突破，使得研究人员能够基于与其他昆虫中已知活性肽的同源性，鉴定出Drosophila中的生物活性肽。此外，通过基于细胞培养的GPCR-配体结合实验，结合基因组预测的GPCR信息，成功鉴定了多个肽的受体。随后，表达谱分析进一步预测了这些肽及其受体所介导的器官间信号通路。值得注意的是，许多假定的肽类受体在脑中表达，提示脑是肽类激素的主要靶组织之一9。此外，Drosophila中先进的遗传工具也推动了肽-GPCR组合生理功能的鉴定。例如，基于GAL4和LexA的双元转录系统可实现基因在特定空间和时间上的敲低或过表达。GAL4是一种在酵母中发现的转录因子，可结合一种称为上游激活序列（Upstream Activation Sequence, UAS）的顺式调控元件。在GAL4/UAS系统中，驱动品系提供组织特异性或发育阶段特异性的GAL4表达，而响应品系则在目标基因或shRNA表达构建的上游携带UAS序列。LexA/LexAop系统基于类似的机制。通过对组织特异性肽敲低和组织特异性GPCR敲低动物进行表型分析，可揭示肽-GPCR信号通路的作用模式和作用部位。然而，仅依靠遗传学数据得出的结论具有局限性。另一方面，当某一特定肽类激素的潜在靶标被缩小至特定组织或细胞类型时，可利用器官离体标本进行ex vivo钙成像，以阐明由肽-GPCR信号介导的器官间通讯。当Gq偶联的GPCR被激活时，由于内质网（ER）中Ca2+的释放，细胞内Ca2+浓度升高10。在脑组织中，神经元的激活同样会引起细胞内Ca2+水平的上升。此类Ca2+浓度的升高可通过钙离子传感器GCaMP进行检测；GCaMP在Ca2+存在时发生构象变化，从而产生荧光信号11。
本文介绍了一种利用果蝇（Drosophila）脑组织离体标本进行钙成像的方法。为了检测某种肽是否能够激活特定神经元，将待测肽作用于表达GCaMP的脑组织离体标本，并通过共聚焦显微镜监测荧光变化。随后，通过在缺乏该G蛋白偶联受体（GPCR）的突变型脑组织中重复相同实验，验证GPCR的参与作用。这种成像与遗传学相结合的方法，可精确揭示肽-GPCR介导的器官间通讯机制。本文还讨论了该实验方案可能的改进方法及其应用前景。

<table><tbody><tr><td>钨棒</td><td>A-M systems, Sequim, WA, USA</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>蓝丁胶</td><td>Bostik, Paris, France</td><td>3049100</td><td>类似腻子的可重复使用粘合剂</td></tr><tr><td>方形表面皿，1 5/8 英寸</td><td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td><td>T900</td><td>磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td><td></td><td>定制合成肽</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptide Institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>伤害感受素</td><td>Peptide Institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>Axio Imager A2</td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>物镜 W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>420957-9900-000</td><td>水浸式物镜</td></tr><tr><td>长行程P-725 PIFOC物镜扫描器</td><td>Physik Instrumente GmbH &amp; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>N/A</td><td>压电驱动镜头移动装置</td></tr><tr><td>共聚焦扫描单元 CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td><td>CSU-W1</td><td>转盘式共聚焦扫描头</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td><td>C9100-13</td><td>EM-CCD相机</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td>1178770</td><td>488 nm激光器</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Yokogawa二向色镜分光器</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>二向色分光镜</td></tr><tr><td>528/38 nm BrightLine单通带滤光片</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>FF01-528/38-25</td><td>发射滤光片</td></tr><tr><td>&amp;micro;Manager</td><td>Open Imaging, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&amp;eacute;venaz, 生物医学成像组，瑞士洛桑联邦理工学院</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

离体 用于可视化内分泌信号对大脑反应的钙成像 果蝇

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

通过内分泌信号进行的器官间通讯，例如从外周到大脑的信号传递，对于维持内环境稳态至关重要。作为内分泌研究的模式动物， 黑腹果蝇，其具有复杂的遗传工具和基因组信息，正被越来越多地使用。本文描述了一种钙成像方法 果蝇 脑组织外植体。该方法可用于检测激素对脑组织的直接信号作用。众所周知，许多肽类激素通过G蛋白偶联受体（GPCRs）发挥作用，其激活可引起细胞内Ca²⁺水平升高。2+浓度。神经激活还会升高细胞内Ca2+ 水平，来自Ca2+ 钙离子内流与释放2+ 储存在内质网（ER）中。钙离子传感器GCaMP可用于监测这些Ca2+ 变化。在该方法中，目标神经元表达GCaMP，随后解剖表达GCaMP的幼虫脑并进行培养 离体 然后将测试肽施加于脑组织外植体，利用配备CCD相机的转盘共聚焦显微镜检测GCaMP的荧光变化。通过该方法，可检测任何水溶性分子，并可使用适当的荧光指示剂成像与神经元激活相关的多种细胞事件。此外，通过改造成像腔室，该方法还可用于成像其他组织 果蝇 器官或其他动物的器官。

通过本实验方案，研究了肽类激素 CCHa2 对脑内胰岛素生成细胞（IPCs）的激活作用。利用 dilp2-GAL412（由 Rulifson 博士惠赠）与 UAS-GCaMP6s13（由 Kim 博士惠赠）组合，将野生型脑组织中的 IPCs 标记为 GCaMP6s。对幼虫脑组织离体样本施加合成的 CCHa2 肽，并实时记录 GCaMP6s 的荧光信号。本实验中，图像采集自单一焦平面。每个 IPC 簇约包含 14 个细胞14，检测到其中 3 至 6 个细胞的信号。施加 CCHa2 后，GCaMP6s 信号强度显著增强（图 2A，视频 1）。野生型脑组织对胃饥饿素（Ghrelin）或痛敏肽（Nociceptin）未表现出明显反应（视频 2 和 3），这两种为哺乳动物特有的肽...

本文描述了一种实验方案 离体 钙成像 果蝇 脑。在该方法中，可将天然或合成化合物加入缓冲液中，以检测其激活脑内特定神经元的能力。

通过内分泌信号进行的器官间通讯，例如从外周到大脑的信号传递，对于维持内环境稳态至关重要。作为一种模型……

该方法有助于解答内分泌学领域以及神经科学领域中的关键问题，例如我们关于大脑对内分泌信号反应的研究。该技术的主要优势在于，可以独立于其他组织，直接观察内分泌信号对大脑的影响。开始此操作时，使用镊子刮擦塑料培养皿底部中央，制造一个凹痕，以便在解剖后更方便地固定幼虫脑的腹神经节。用牙签在凹槽两侧各放置一滴少量的超级胶水，并将一根钨棒粘附在胶水上。然后，使用一小块类似腻子的可重复使用粘合剂，在凹槽周围制作一个环形壁。为了分离幼虫大脑，需在产卵后90至120小时收集幼虫，并用蒸馏水至少清洗三次，以去除附着的食物残渣。接下来，将一条幼虫置于一个盛有冰冻 PBS 的 1.5 英寸方形表面皿中。用一对镊子轻轻夹住幼虫的中段，再用另一对镊子夹住口钩并轻轻牵拉，以分离包含脑部的幼虫前段与身体其余部分。然后用镊子夹住幼虫前端，将幼虫翻转。去除附着在脑组织上的多余组织，例如成虫盘、脂肪体和环腺。轻轻将脑组织与口器部分分离。随后，向成像室中先前制备好的粘附环内加入 200 微升 PBS。用巴斯德吸管轻轻吸取含有 PBS 的离体脑组织，转移至成像室中。在成像室内，抓住从腹神经节延伸出的肌纤维，将脑组织轻轻插入钨丝下方的凹陷处。然后，将钨丝略微上提，使脑组织处于成像的正确位置。为获取钙荧光图像，将含有脑组织外植体的成像室置于显微镜下。降低物镜直至接触 PBS，并在明场照明下调整脑组织位置，使其对焦清晰。切换至荧光光源，并调整聚焦至表达GCaMP的成功标记细胞。以250 ms/帧的速度开始采集，分辨率为512 × 512像素，采用水冷模式。随后，调整曝光时间，使荧光信号值处于CCD相机的动态范围内，但对于16位图像，信号值不应低于1000个任意单位。确定成像参数后，在给予肽之前采集一分钟图像，以检测基线信号强度。随后，通过移液将100微升配制好的肽溶液直接加入幼虫浴液中，施加待测肽。记录数分钟内的GCaMP成功发射信号。为分析数据，打开分析软件，并使用施加肽之前的第一帧作为参考图像。然后，选择插件（Plugins），TurboReg。将序列图像文件选为源（Source），将参考图像选为目标（Target）。接下来，分别选择处理方法为“刚体”和质量为“精确”。随后，点击“批处理”以开始图像处理。在图像托盘中，通过“分析”、“工具”、“ROI管理器”选择多个感兴趣区域。然后，在 ROI Manager 窗口中点击更多、多点测量、确定，以测量像素强度。在本实验中，野生型脑组织分别暴露于 CCHa2、Ghrelin 和 Nociceptin，而 CCHa2 受体突变型脑组织则暴露于 CCHa2。通过共聚焦显微镜以 250 ms/帧的速度检测胰岛素生成细胞中的 GCaMP6 信号，并展示所选时间点的静态图像。绘制了每个时间点 ROI 强度变化与基线信号强度的比值。ROI 设置在相同焦平面内检测到的细胞体上。实线表示 5 到 10 个样本的均值，虚线表示平均值标准误的上下限。阴影区域表示实验中信号的变化范围。一旦掌握，该技术可在一小时内完成，前提是操作得当。在进行此操作时，重要的是要记住尽快制备脑组织样本，以避免对其造成损伤。该实验步骤可与遗传学方法结合，以回答受体特异性等更多科学问题。本方案所采用的系统易于制备且可重复使用，因此在筛选等应用中具有较高的实用性。该技术问世后，为内分泌学和神经科学领域的研究人员探索控制果蝇大脑功能的激素网络铺平了道路。

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科研

JoVE Journal

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神经科学

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Drosophila 嗅觉中枢对气味刺激反应的钙成像

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本视频演示了一种利用突触定位的钙离子传感器在果蝇中进行体内钙成像的方法。内容涵盖了为显微镜观察准备果蝇、实施嗅觉条件化训练以及可视化气味诱导的钙离子内流的各个步骤。...

体内钙成像利用突触定位钙传感器在黑腹果蝇中的应用

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离体钙成像研究Drosophila脑对神经肽的反应

来源： Lark, A. R., et. al.，基于生物发光钙指示剂GFP-aequorin的活体功能脑成像方法。 J. Vis. Exp.

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Drosophila的前足和喙部含有丰富的味觉感觉神经元。本文介绍一种利用钙成像技术检测活体果蝇前足和喙部感觉神经元在施加外源性味觉信息素后生理反应的方法。...

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本文介绍了一种利用生物发光报告基因的新型 Ca2+ 成像方法。该方法采用 GFP-aequorin 融合蛋白，该蛋白可结合 Ca2+...

在体实验 基于生物发光钙指示剂GFP-aequorin的功能性脑成像方法

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成像钙离子 果蝇 在卵子激活时

本文介绍了一种可在果蝇（Drosophila）学习与记忆过程中可视化突触前和/或突触后钙信号的实验方案。该方法结合了定位于突触的钙离子传感器进行活体钙成像，并采用经典的嗅觉条件化范式，从而能够揭示此类联想学习背后的突触可塑性机制。...

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体内与离体条件下对三龄Drosophila melanogaster幼虫嗅觉环路神经元的钙成像

学习离体钙成像技术用于研究果蝇大脑对内分泌信号的神经反应。该方法利用GCaMP6荧光指示剂检测神经元激活，帮助研究者探索激素调控脑功能的机制。

离体用于可视化内分泌信号对大脑反应的钙成像果蝇

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