离体 用于可视化内分泌信号对大脑反应的钙成像 果蝇

该方法有助于解答内分泌学领域以及神经科学领域中的关键问题，例如我们关于大脑对内分泌信号反应的研究。该技术的主要优势在于，可以独立于其他组织，直接观察内分泌信号对大脑的影响。开始此操作时，使用镊子刮擦塑料培养皿底部中央，制造一个凹痕，以便在解剖后更方便地固定幼虫脑的腹神经节。

用牙签在凹槽两侧各放置一滴少量的超级胶水，并将一根钨棒粘附在胶水上。然后，使用一小块类似腻子的可重复使用粘合剂，在凹槽周围制作一个环形壁。为了分离幼虫大脑，需在产卵后90至120小时收集幼虫，并用蒸馏水至少清洗三次，以去除附着的食物残渣。

接下来，将一条幼虫置于一个盛有冰冻 PBS 的 1.5 英寸方形表面皿中。用一对镊子轻轻夹住幼虫的中段，再用另一对镊子夹住口钩并轻轻牵拉，以分离包含脑部的幼虫前段与身体其余部分。

然后用镊子夹住幼虫前端，将幼虫翻转。去除附着在脑组织上的多余组织，例如成虫盘、脂肪体和环腺。轻轻将脑组织与口器部分分离。

随后，向成像室中先前制备好的粘附环内加入 200 微升 PBS。用巴斯德吸管轻轻吸取含有 PBS 的离体脑组织，转移至成像室中。在成像室内，抓住从腹神经节延伸出的肌纤维，将脑组织轻轻插入钨丝下方的凹陷处。

然后，将钨丝略微上提，使脑组织处于成像的正确位置。为获取钙荧光图像，将含有脑组织外植体的成像室置于显微镜下。降低物镜直至接触 PBS，并在明场照明下调整脑组织位置，使其对焦清晰。

切换至荧光光源，并调整聚焦至表达GCaMP的成功标记细胞。以250 ms/帧的速度开始采集，分辨率为512 × 512像素，采用水冷模式。随后，调整曝光时间，使荧光信号值处于CCD相机的动态范围内，但对于16位图像，信号值不应低于1000个任意单位。

确定成像参数后，在给予肽之前采集一分钟图像，以检测基线信号强度。随后，通过移液将100微升配制好的肽溶液直接加入幼虫浴液中，施加待测肽。记录数分钟内的GCaMP成功发射信号。

为分析数据，打开分析软件，并使用施加肽之前的第一帧作为参考图像。然后，选择插件（Plugins），TurboReg。将序列图像文件选为源（Source），将参考图像选为目标（Target）。

接下来，分别选择处理方法为“刚体”和质量为“精确”。随后，点击“批处理”以开始图像处理。在图像托盘中，通过“分析”、“工具”、“ROI管理器”选择多个感兴趣区域。

然后，在 ROI Manager 窗口中点击更多、多点测量、确定，以测量像素强度。在本实验中，野生型脑组织分别暴露于 CCHa2、Ghrelin 和 Nociceptin，而 CCHa2 受体突变型脑组织则暴露于 CCHa2。通过共聚焦显微镜以 250 ms/帧的速度检测胰岛素生成细胞中的 GCaMP6 信号，并展示所选时间点的静态图像。

绘制了每个时间点 ROI 强度变化与基线信号强度的比值。ROI 设置在相同焦平面内检测到的细胞体上。实线表示 5 到 10 个样本的均值，虚线表示平均值标准误的上下限。

阴影区域表示实验中信号的变化范围。一旦掌握，该技术可在一小时内完成，前提是操作得当。在进行此操作时，重要的是要记住尽快制备脑组织样本，以避免对其造成损伤。

该实验步骤可与遗传学方法结合，以回答受体特异性等更多科学问题。本方案所采用的系统易于制备且可重复使用，因此在筛选等应用中具有较高的实用性。

该技术问世后，为内分泌学和神经科学领域的研究人员探索控制果蝇大脑功能的激素网络铺平了道路。