Name: 秀丽线虫生殖的计算分析研究细胞核、蛋白质和细胞骨架的分布 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习使用自动化方法对秀丽线虫生殖腺进行三维重建，分析细胞核、蛋白质分布和细胞骨架结构。该技术可显著减少分析时间并提高准确性，适用于发育生物学研究。

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感谢Monash Microimaging提供的技术支持。Caenorhabditis遗传中心提供了一些菌株，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。本研究得到了蒙纳士大学生物医学发现奖学金、澳大利亚国家健康与医学研究委员会项目资助（GNT1105374）、澳大利亚国家健康与医学研究委员会高级研究员奖学金（GNT1137645）以及veski创新奖学金（VIF 23）对Roger Pocock的资助。

1. 准备与线虫培养
注意：所有产品信息请参见材料表。
<ol>
	<li>OP50 Escherichia coli 培养物：将 OP50 菌株在溶菌肉汤（LB）（1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、0.5% NaCl，pH 7.0）中于 37 °C 无抗生素条件下过夜培养。</li>
	<li>将 400 µL OP50 菌液接种至线虫生长培养基（NGM）平板（含 1.5 g NaCl、8.5 g 琼脂、1.25 g 蛋白胨、1 mL 1 M CaCl2、1 mL 5 mg/mL 乙醇溶解胆固醇、1 mL 1 M MgSO4 和 25 mL 1 M KPO4 缓冲液）上，室温晾干细菌 48 小时。</li>
	<li>将线虫转移至已接种细菌的 NGM 平板，并在 15 °C 或 20 °C 下培养。
	<ol>
		<li>分析成年雌雄同体生殖系时，挑选健康进食的 L4 期线虫至细菌菌苔上，于 20 °C 培养过夜。</li>
		<li>对雌雄同体线虫进行精子计数时，将 L4 期线虫在 20 °C 下培养 12 小时，直至其达到 L4/成虫蜕皮阶段。为使线虫同步至 L4 期，可通过挑选产卵较多的成虫置于漂白液（1 M NaOH 与漂白剂按 1:1 混合）中制备卵，使卵孵化后挑选 L4 期个体用于实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备特氟龙载玻片：用移液器枪头吸取 25 µL 多聚-L-赖氨酸溶液滴加于载玻片表面并均匀涂布。用纸巾吸去多余液体后，室温晾干，随后将载玻片置于 65 °C 恒温箱中孵育 15–20 分钟。</li>
</ol>
2. 生殖系解剖与染色6,13
<ol>
	<li>在22 mm × 22 mm盖玻片上滴加10 µL 0.01% 四咪唑（麻醉剂），挑取一天龄成虫线虫放入其中。</li>
	<li>用5 mL注射器和24号针头在虫体尾部开始麻醉时进行解剖&#34; x&#160;1&#34;，并确保生殖系未受损伤。 
	注意：解剖必须在蠕虫完全麻痹之前进行，以确保蠕虫体内的负压和蠕虫自身的运动有助于生殖系内容物的排出。在计数精子时，解剖过程中需注意避免解剖针损伤受精囊。除受精囊之后的解剖位点外，应避免针尖接触生殖系组织。若观察到生殖系结构破裂或有内容物泄漏，该生殖系不应用于后续分析。</li>
	<li>将倒置的盖玻片置于多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，使解剖得到的生殖腺组织接触载玻片。</li>
	<li>用镊子夹住盖玻片一角，用滤纸吸去盖玻片下多余的液体，然后将载玻片置于液氮中1分钟。迅速用针剥离盖玻片，使生殖腺留在载玻片上。</li>
	<li>将载玻片转移至染色缸中的 -20 °C 甲醇中处理 30 - 60 秒，随后在新配制的固定液（含 0.08 M HEPES（pH 6.9）、1.6 mM MgSO₄ 的 1x 磷酸盐缓冲液（PBS））中孵育 30 分钟4，0.8 mM 乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）和 3.7% 多聚甲醛）于室温下。</li>
	<li>将载玻片置于含有1×PBS（pH 7.4）和0.1% Tween-20的染色缸中，洗涤10分钟。重复此步骤一次。</li>
	<li>用封闭液（将900 µL羊血清加入1700 µL蒸馏H₂O中配制，终浓度为30%）封闭生殖腺，每样本加入30 µL2在室温下，将湿纸巾放入塑料盒中制成湿盒，然后在其中孵育300 µL的10倍浓度PBS，孵育时间为30分钟。</li>
	<li>将按1:300比例用30%山羊血清配制的REC-8抗体溶液50 µL加入每个样本中，4°C孵育过夜。</li>
	<li>将载玻片置于含有1×PBS缓冲液（含0.1% Tween-20）的容器中清洗10分钟。重复该步骤一次，然后用纸巾轻触载玻片角落以吸除多余液体。</li>
	<li>用30%正常山羊血清稀释绿色荧光染料（发射波长488 nm）标记的二抗（1:1000）、鬼笔环肽（肌动蛋白染料，1:4000）和DAPI（DNA染料，1:4000），配制二抗溶液。</li>
	<li>加入50 µL二抗溶液至载玻片上。</li>
	<li>室温孵育1小时。</li>
	<li>将载玻片置于含有1×PBS和0.1% Tween-20的容器中，清洗两次，每次10分钟。拭去多余液体。</li>
	<li>加入30 µL固定剂至载玻片上，并放置一个12 mm2 在顶部放置1.5 µm盖玻片，并于4 °C下干燥载玻片过夜。</li>
</ol>
3. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>打开共聚焦显微镜、激光器、共振扫描器及共聚焦显微镜软件。将带有染色生殖系的玻片放置在63X物镜上方的载物片架上。</li>
	<li>找到生殖系，聚焦于生殖系顶部，并使用共聚焦显微镜软件进行标记。同样地，聚焦于生殖系底部并标记，以确定生殖系的总厚度。</li>
	<li>通过设定每层切片厚度至多为0.5 µm，对整个生殖系进行成像。标记完整的生殖系后开始采集。每层切片扫描8次并取平均值，以提高图像质量。共振扫描器可实现快速扫描，避免成像过程中的荧光漂白。若显微镜无共振扫描器，则将扫描次数减少至4次，以避免漂白。</li>
</ol>
4. 细胞核数量与分布的成像后分析
注意：有关所用软件工具和按钮的截图，请参见补充图1。
<ol>
	<li>将图像导入 Imaris 8.4.1 或更高版本的软件中。</li>
	<li>通过识别各区域的细胞核形态，定义生殖系中的有丝分裂区、过渡区、减数分裂区、卵母细胞区和受精囊。</li>
	<li>使用软件中的表面功能按钮（补充图 1A）选择感兴趣区域。</li>
	<li>取消自动表面创建向导，并在三维图像堆栈的第一层和最后一层手动绘制感兴趣区域。</li>
	<li>点击 创建表面。 
	注意：软件将自动填充第一层与最后一层之间的图像堆栈。</li>
	<li>点击 遮罩通道 按钮（补充图 1B-C），对除 DAPI 外的所有通道进行遮罩。</li>
	<li>使用点状结构功能按钮（补充图 1A）定义细胞核大小参数。对于有丝分裂区，设定 XY 直径为 2 µm，Z 直径不定义；对于过渡区，设定 XY 直径为 2 µm，Z 直径为 1.5 µm（补充图 1D）。 
	注意：根据显微镜的放大倍数和具体参数调整直径设置。在本实验方案中，所用物镜为 63X，并在成像时额外提供了 1.70 倍的放大。若更换物镜（例如改为 40X），则需相应调整直径参数。应使用野生型生殖系进行参数调试以确定正确设置。野生型生殖臂的有丝分裂区约含有 250 个细胞核，应调整直径参数以接近该数值。至少使用 15 条生殖系来确定最佳直径值。过渡区（150–170 个细胞核）和减数分裂区（600–700 个细胞核）的校准也应采用类似方法。</li>
	<li>通过设定最小阈值来限制点状结构的检测（补充图 1E）。使用 DAPI 染色的野生型生殖系，逐步提高三维渲染的最小阈值，直至在生殖系外首次出现检测点，以此确定最小阈值。</li>
	<li>保存图像，并从软件自动生成的表格中获取细胞核数量。将图像导出为 TIF 文件。</li>
</ol>
5. 精子与染色体数目评分的成像后分析
<ol>
	<li>选择受精囊作为感兴趣区域，进行三维重建。为检测每一条精子，定义X轴和Y轴的点直径在0.75 - 1.0 µm之间，Z轴直径则不作定义。使用“斑点”功能按钮，如补充图1所示。</li>
	<li>勾选“减去背景”复选框，并使用软件计算出的背景校正值进行背景扣除（补充图1D）。 
	注意：Imaris软件会优先选取高强度信号点，因此只要感兴趣区域与背景之间存在显著差异，背景的影响就很小。另一种方法是手动定义背景校正，此时可为背景输入合适的数值。若需对独立样本的强度进行比较，则应采用手动背景校正。</li>
	<li>调整三维重建的阈值，以检测受精囊中所有经DAPI染色的精子（补充图1E）。</li>
	<li>进行染色体计数时，在构建三维模型前，定义X轴和Y轴的点直径&#60;0.75 µm。</li>
	<li>保存图像并导出为TIF文件。</li>
</ol>
6. 生殖系细胞骨架重建的成像后分析
<ol>
	<li>在生殖系中确定感兴趣区域，并通过点击 Mask channels 按钮屏蔽除phalloidin以外的所有通道。</li>
	<li>使用表面功能按钮设置0.25 µm的表面细节（补充图1）。 
	注意：这意味着每0.25 µm将被渲染成三维模型。对于生殖系中需要生成三维表面模型的任何区域，表面细节可保持恒定为0.25 µm。然而，由于卵母细胞区域存在结构清晰的肌动蛋白纤维，该区域的表面细节可增加至0.35–0.5 µm。</li>
	<li>勾选背景扣除选项，并使用软件计算出的背景校正值进行背景扣除（补充图1D）。</li>
	<li>根据待分析结构的不同，调整三维渲染的阈值（补充图1E）。</li>
	<li>保存生成的三维图像，并导出为TIF文件。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本实验方案的目标是提高生殖系分析的准确性并减少所需时间。在完成生殖系组织的标准解剖制备后，通过计算机三维重建生成生殖系细胞核的三维模型。三维重建不仅能够观察生殖系细胞核在空间中的分布情况，还可计算生殖系特定区域内的细胞核数量。本方法的关键在于对细胞核的大小和形状参数进行精确界定，而这取决于染色的清晰度以及成像时所使用的放大倍数。我们通过与已发表的手动分析数据进行比较，验证了该方法的准确性1。为进一步确认本方法的准确性，我们在不同条件下检测了多种突变体，并将结果与已发表的文献数据进行比对。结果证实本方法能够有效检测细微表型和显著表型，分别以cpb-3和glp-1突变体为例。此外，该方法对生殖系内或不同品系间细胞核大小与形状的变化具有良好的适应性。这一特性还使得该方法可用于识别和计数生殖系中的更小结构，例如染色体和精子。若有必要，该方法还支持对细胞核大小和形状参数进行进一步的调试与优化。我们的分析揭示了生殖系中细胞核的分布特征，并表明有丝分裂区和粗线期区域的细胞核呈现出不同的排列模式。通过对REC-8和DAPI染色图像进行三维重建，我们还展示了REC-8蛋白...

信号通路在哺乳动物中的保守性使得 秀丽隐杆线虫 研究多种生物过程的优秀模型1,2在我们的实验室中，我们使用 秀丽隐杆线虫 生殖系用于研究干细胞发育、细胞凋亡和基因表达。尽管生殖系是一种三维结构，但由于三维分析耗时且劳动密集，许多研究仍采用二维方法。二维分析很可能无法准确呈现 体内 生殖系中的事件。该 秀丽隐杆线虫 成年雌雄同体具有两条生殖系臂，每条臂内含一个体细胞远端顶端细胞（DTC），该细胞维持远端生殖细胞处于未分化状态3,4这些生殖细胞在远离远端丝状细胞（DTC）并脱离其影响后开始分化，当它们到达生殖腺近端时，分别发育为卵细胞和精子。在此过程中，生殖细胞的细胞核先进行有丝分裂，随后转变为减数分裂。5,6精子的生成在发育的幼虫第四阶段（L4）完成，此后在成虫期开始产生卵母细胞。精子储存在受精囊中，在此处使卵母细胞受精并形成胚胎。
多种遗传和环境因素均可影响 C. elegans 的生殖系发育，导致细胞核数量、凋亡事件数量、染色体动态行为以及蛋白质表达和/或定位发生变化7,8,9,10,11。对这些事件的分析需要依据细胞核形态和分布来识别各个分化阶段。在大样本条件下，人工准确分析这些参数费时且劳动强度大。为克服这些局限性并提高分析的一致性，我们开发了一种自动化方法，用于对 C. elegans 生殖系进行三维检测，以实现细胞核计数、细胞核分布分析、蛋白质表达检测以及细胞骨架结构观察。通过将共聚焦显微镜与三维重建技术相结合，我们获得了可用于识别各生殖细胞分化阶段的细胞核大小和形态参数。此外，该方法还可用于生殖细胞核和精子计数，并对每个卵母细胞中的染色体数目进行评分。
生殖系中的一个关键结构是细胞骨架，它为生殖系区室提供稳定性，有助于胞质流动以及对生殖系细胞核的保护12。通过计算成像，我们对生殖系细胞骨架进行了三维重建，并鉴定了生殖系内独特的细胞骨架特征。本文中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，以说明如何结合共聚焦成像与计算分析，实现对秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖系的全面分析。
我们提出一种对 C. elegans 生殖系进行三维分析的快速方法（图 1）。通过三维分析，可研究生殖系细胞核的三维分布（图 2 和 图 3）、实现细胞的自动计数（图 2）、重建生殖系细胞骨架结构（图 3）、分析蛋白质的分布（图 4），以及对受精囊中的精子数量和卵母细胞中的染色体数目进行评分（图 5）。该方法不仅能够简便而准确地对生殖系进行定量分析，还可识别出具有生理相关性的表型。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 品系：野生型（N2，Bristol） &lt;em&gt;rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III)，cpb-3(bt17) I，glp-1(e2141) III&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; 细菌</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>线虫生长培养基（NGM）平板</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多克隆兔抗REC-8抗体&amp;nbsp;</td><td>SDIX</td><td>29470002</td><td></td></tr><tr><td>山羊来源的Alexa 488标记抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>细胞骨架染料鬼笔环肽&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-12380</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES缓冲液，pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0887</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1389</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛溶液</td><td>默克密理博</td><td>1040031000</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield 固定剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>20&amp;deg;C &amp;和 25&amp;deg;CIncubator&amp;nbsp;</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>任何品牌（Leica，Zeiss）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备 Imaris 软件 8.4.1 或更高版本的计算机，具有使用该软件的完整许可证，以及 Matlab 软件。</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯显微镜载玻片&amp;nbsp;</td><td>Tekdon&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;941-322-8288</td><td></td></tr></tbody></table>

计算分析 秀丽隐杆线虫 生殖系中细胞核、蛋白质及细胞骨架分布的研究

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称 C. elegans）的生殖系被广泛用于研究多种重要的生物学过程，包括干细胞发育、细胞凋亡以及染色体动态。尽管生殖系是一个优秀的研究模型，但由于三维分析所需的时间和劳动强度较大，目前多数分析仍局限于二维层面。此类研究中的主要观测指标包括细胞核的数量/位置以及生殖系内蛋白质的分布情况。本文介绍一种利用共聚焦显微镜和计算方法对生殖系进行自动化分析的技术，可确定生殖系各个区域中细胞核的数量和位置。该方法还可分析生殖系中蛋白质的分布，从而实现对不同遗传背景下蛋白质表达的三维检测。此外，我们的研究揭示了生殖系不同区域中细胞骨架结构的差异，这些差异可能适应了特定的空间发育需求。最后，本方法还能实现对每个生殖系的受精囊中精子数量的自动化计数。综上所述，该方法可实现对 C. elegans 生殖系快速且可重复的表型分析。

图1展示了进行三维生殖系分析所需的时间。在20 °C下培养的L4期雌雄同体线虫经解剖以分离生殖系，并使用DAPI、鬼笔环肽以及针对生殖系蛋白的抗体进行染色。利用共聚焦显微镜对生殖系进行成像。染色与共聚焦显微镜成像约需24小时。对完整生殖系进行计算分析需10至15分钟，用于计数细胞核的数量与位置、确定蛋白分布、分析细胞骨架结构以及统计精子数量。而完全手动分析每条生殖系则需超过2小时，且易受操作者主观因素影响。因此，我们开发的自动化高通量方法显著缩短了分析时间，并提高了实验的可重复性。
自动核计数显示，一个生殖腺丝包含约 1,000 - 1,200 个细胞核图2C)，与先前发表的手工评分数据高度吻合1. 为确认评分的准确性，采用多种突变体和不同条件（<str...

我们提出一种用于三维重建的自动化方法 秀丽隐杆线虫 生殖系. 该方法可确定生殖系中每个细胞核的数量和位置，并分析生殖系蛋白质分布及细胞骨架结构。

秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖系被用于研究多种重要的生物学过程，包括干细胞发育、细胞凋亡以及……

本方法的总体目标是实现对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）生殖系的自动化分析，以研究其细胞核、蛋白质及细胞骨架的分布情况。该方法有助于解答秀丽隐杆线虫研究领域中的关键问题，例如细胞核和精子的数量、细胞核的分布模式以及生殖系的细胞骨架结构。该技术的主要优势在于能够缩短分析时间、增加样本量，并消除人工分析过程中可能引入的人为误差。为了成像样品，将带有染色生殖系的载玻片放入共聚焦显微镜63倍物镜上方的载物台中，找到生殖系。聚焦于生殖系的顶部，并使用共聚焦显微镜软件标记该位置。确定生殖系的总厚度后，设定每个光学切片的厚度不超过0.5微米，并标记完整的生殖系范围。然后开始采集，对每张切片扫描八次并取平均值，以提高图像质量。当所有图像采集完毕后，将图像导入合适的图像分析软件，使用表面功能工具选择有丝分裂区域。此时将显示生殖腺远端末端的图像。取消自动表面创建向导，手动在三维图像堆栈的第一层和最后一层中围绕有丝分裂区域绘制感兴趣区域。单击“创建表面”，然后选择“遮罩通道”，以遮蔽除DAPI通道外的所有通道。使用斑点功能工具，将有丝分裂区域的大小参数定义为XY方向直径2微米，Z方向直径未定义。单击“减去背景”以减去背景信号。为确定最小阈值，在DAPI染色的野生型生殖腺中逐步提高三维渲染的最小阈值，直至生殖腺外首次出现信号点，随后为每个区域生成三维模型。保存图像后，单击“表格”查看软件自动统计的细胞核数量，并将图像导出为TIFF文件。对于过渡区，按之前所述方法创建表面。然后，点击“掩膜通道”以屏蔽除 DAPI 通道外的所有通道。使用点状功能，设定 XY 直径为 2 微米，Z 直径为 1.5 微米，并点击“减去背景”以去除背景信号。为了确定最小阈值，逐步提高经DAPI染色的野生型生殖腺三维渲染的最小阈值，直至在生殖腺外首次出现信号点，并为每个区域生成三维模型。保存图像后，点击表格以查看软件自动统计的细胞核数量，并将图像导出为TIFF文件。在计数精子数量时，选择受精囊作为感兴趣区域（参照细胞核区域的设定方法），并使用“点”工具，将XY方向的直径设定为0.75至1微米，Z方向直径不作限定，以识别每一个精子。选中“背景减除”框，并使用软件计算出的背景校正值进行背景扣除。然后，调整三维渲染阈值，以检测储精囊中所有经DAPI染色的精子。对于卵母细胞中的染色体计数，选择卵母细胞并将XY直径定义为小于0.75微米，在构建三维模型前设定阈值。然后，将图像另存为 TIFF 文件以供导出。进行细胞骨架生殖系重建时，需在生殖系中确定有丝分裂的目标区域，并如前所述创建表面掩膜。点击“掩膜通道”以屏蔽除鬼笔环肽通道外的所有通道，然后使用表面功能工具定义 0.25 微米的表面细节。扣除背景后，调整三维渲染阈值，以保存生成的三维图像并导出为 TIFF 文件。细胞核的分布依赖于分化阶段

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

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利用邻位连接实验在 C. elegans 生殖系中检测核糖核蛋白复合物的原位组装

这是一种常用的方法 秀丽隐杆线虫 性腺解剖结合冷冻裂解，用于制备生殖系样本以进行免疫荧光分析 通过...

C. elegans 性腺解剖与冰冻裂解用于免疫荧光及 DAPI 染色

本文提供了有效使用SegElegans的详细说明。SegElegans是我们开发的一种深度学习系统，可用于对宽场显微镜图像中的单个线虫进行自动分割，进而用于ImageJ等图像分析软件。我们提供了该系统的在线和离线使用方法。...

自动化分析 秀丽隐杆线虫 使用 SegElegans 进行荧光成像

学习使用自动化方法对秀丽线虫生殖腺进行三维重建，分析细胞核、蛋白质分布和细胞骨架结构。该技术可显著减少分析时间并提高准确性，适用于发育生物学研究。

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