秀丽线虫生殖的计算分析研究细胞核、蛋白质和细胞骨架的分布

该方法的总体目标是自动分析秀丽隐杆线虫种系，以研究其细胞核、蛋白质和细胞骨架分布。这种方法可以帮助回答秀丽隐杆线虫领域中关于细胞核和精子数量、核分布和种系细胞骨架结构的关键问题。该技术的主要优点是它减少了分析时间，增加了样品量，并消除了与手动分析相关的人为错误。

为了对样品进行成像，将带有染色种系的载玻片放入共聚焦显微镜 63X 物镜上方的载玻片架中，并找到种系。聚焦于种系的顶部，并用共聚焦显微镜软件进行标记。确定总种系厚度后，定义每个切片的厚度，最大为 0.5 微米，并标记完整的种系。

然后，开始采集，扫描每个切片八次并平均值以提高图像质量。获得所有图像后，将图像导入适当的图像分析软件程序，并使用表面功能工具选择有丝分裂区域。将出现种系远端的图像。

取消自动表面创建向导，并在三维堆栈中图像的第一个和最后一个切片处的有丝分裂区域周围手动绘制感兴趣区域。单击 Create Surface，然后单击 Mask Channel ，以屏蔽除 DAPI 通道之外的所有通道。使用点函数工具，定义 XY 直径为 2 微米且 Z 直径未定义的有丝分裂区域的大小参数。

单击 subtract background （减去背景） 以减去背景。要定义最小阈值，请增加 DAPI 染色野生型种系上的最小 3D 渲染阈值，直到第一个斑点出现在种系之外，并为每个区域生成 3D 模型。保存图像后，单击表格以查看软件自动生成的细胞核数，并将图像导出为 TIFF 文件。

对于过渡区，如前所述创建曲面。然后，单击 Mask Channel 以屏蔽除 DAPI 通道之外的所有通道。使用点功能，定义 XY 直径为 2 微米，Z 直径为 1.5 微米，然后单击减去背景以减去背景。

要定义最小阈值，请增加 DAPI 染色野生型种系上的最小 3D 渲染阈值，直到第一个斑点出现在种系之外，并为每个区域生成 3D 模型。保存图像后，单击表格以查看软件自动生成的细胞核数，并将图像导出为 TIFF 文件。为了对精子数量进行评分，选择精子作为感兴趣的区域，如细胞核区域所示，并使用点功能工具定义 XY 直径在 0.75 到 1 微米之间，Z 直径未定义，以检测每个精子。

选中"背景减去"框，然后使用软件计算的背景校正值减去背景。然后，调整 3D 渲染阈值以检测精子中所有 DAPI 染色的精子。对于卵母细胞中的染色体计数，选择卵母细胞并将 XY 直径定义为小于 0.75 微米，并在开发 3D 模型之前定义阈值。

然后，将图像保存为 TIFF 文件以导出。对于细胞骨架种系重建，确定种系中感兴趣的有丝分裂区域并创建表面掩码，如前所述。单击 Mask Channels（遮罩通道）以遮罩除鬼笔环肽通道之外的所有通道，并使用 Surface 功能工具定义 0.25 微米的表面细节。

减去背景后，调整 3D 渲染阈值以将显影的 3D 图像存储以导出为 TIFF 文件。细胞核分布取决于分化阶段。例如，在有丝分裂区域，内部肌动蛋白表现为细胞核组织在其上的固体块。

在野生型种系中，有丝分裂区包含大约 250 个细胞核，与种系的其余部分相比，细胞核紧密堆积。然而，当细胞核远离远端时，它们看起来更接近种系的圆周，分布的变化从过渡区开始，到细胞核进入减数分裂前期的第三阶段结束。在过渡区，种系内部肌动蛋白呈现出更圆柱形的结构，当它到达厚层时变成一个空心圆柱体。

第二层肌动蛋白覆盖内层，形成种系。圆柱体肌动蛋白结构内的这个圆柱体向卵母细胞区域消失，此时肌动蛋白表现为覆盖卵母细胞的粗纤维。在精原细胞中，肌动蛋白也形成厚厚的纤维束，尽管这些纤维似乎比卵母细胞区域更紧密地堆积在一起。

如图所示，种系近端的三维渲染显示每个中平均有 151 个精子。掌握后，每个种系可在 10 分钟内完成该分析。在尝试此过程时，请务必记住根据用于在实验中可视化种系的物镜放大倍数来定义分析参数。

观看此视频后，您应该对如何对种系进行自动分析、研究细胞骨架结构以及对种系内的细胞核数量进行评分有很好的了解。