一种基于液滴的单链 dna 放大术和微球 pcr 扩增法

该方法有助于回答微流体系统和分子生物技术领域组合技术中的关键问题，如微流体器件和不对称PCR方法。该技术的主要优点是高效生成高度均质的微球，并生产单链DNA，而无需任何额外的分离步骤。这种技术的含义延伸到各种疾病的诊断或治疗。

由于单链DNA的生成是ap-ta-mo-sis测定的关键，因此可用于检测和治疗。虽然该方法可以深入了解 MEMS 中的三维微流体系统，但也可以应用于用于疾病检测和治疗的其他系统。一般来说，对这种方法的新鲜人很难正确控制流体向相反方向流动。

该方法的视觉演示对于观察流聚焦几何中的微球形成和生成的微球的凝固至关重要。首先，通过将基础聚合物和催化剂混合在10比1的比例中，准备20毫升的液体PDMS预聚合物。将 10 毫升液体 PDMS 倒入微流体网络上部的硅晶圆上准备好的 SU-8 模具。

对于底部平坦部分，在没有模具结构的情况下，将相同体积的液体 PDMS 倒在硅片上。将两个涂有液体PDMS预聚合物的硅片放在预热热板上，在75摄氏度下固化30分钟。之后，从 SU-8 模具中手动剥离固化的 PDMS 层。

将直径为 1.5 毫米的圆形打孔工具与复制的微流体网络上的油口对齐，用于将微米级流量通道与大流体样本连接在一起。然后手动打出通孔。重复冲孔过程三次后，使用手持式电晕处理仪对上部和底部 PDMS 层进行亲水性表面处理，每个样品几秒钟。

将两个等离子处理的 PDMS 层堆叠在 90 摄氏度的高温下，在 PDMS 到 PDMS 粘合过程中的热板上加热 30 分钟。涡流并短暂离心标准单链DNA丙烯石标记探头和19对1丙烯酰胺二库存溶液。通过混合25微升40%丙烯酰胺二溶液、10微升单链DNA、10微升5X TBE缓冲液和5微升水来准备溶液。

准备溶液二，用50微升20%的硫酸铵。准备两个单独填充溶液一和溶液二的注射器，并将它们安装到注射器泵上，将溶液流入微流体平台。准备矿物油与0.4%TEMED混合，用于微球的表面凝固。

在用矿物油填充玻璃瓶后，将两根管子插入玻璃瓶盖的气动和流体端口，作为微流体储液罐。连接玻璃瓶和微流体装置中的油口之间的管。将管子连接到微流体装置中的两个溶液端口，以便从注射器泵提供两个溶液。

然后将管子插入出口端口，以便将生成的微球转移到烧杯中。接下来，将注射器泵的流量设置为每小时 0.4 至 0.7 毫升。使用调节器调节压缩机的压缩空气压力。

将带磁性搅拌棒的玻璃烧杯放在加热板上，并设置转速。操作注射器泵，并使用电磁阀的开路控制将外部压缩机产生的压缩空气供应到玻璃瓶中。使用数字显微镜，观察微球在流聚焦几何体中的形成和玻璃杯机中生成的微球的凝固。

观察微球的形成是最关键的步骤之一，因为这是本研究中产生微球和微流体系统的主要过程。在此之后，将100微升微球转移到1.5毫升微离心管中。然后通过温和离心和移液去除上清液。

使用 100 微升 1X TE 缓冲液重新暂停免费探针改性氰氨酸-3，以达到 100 微摩尔的最终浓度。接下来，在含有AP共聚合物微球的无菌1.5毫升微离心管中加入100微摩尔补充探针改性氰氨酸-3。轻点管子几次，在黑暗中室温下混合和孵育一小时。

孵育后，丢弃上流液，并通过移液去除残留缓冲液。然后用500微升TE缓冲液冲洗三次。将微球放在 75 到 50 毫米的玻璃滑梯上，并在成像前用铝箔盖住。

使用具有 40 倍放大倍率的光学显微镜，通过显微计数获得大约 25 个微球。在此之后，按照文本协议中所述合并所有试剂。将样品放入热循环器中，并在适当的条件下启动非对称 PCR。

非对称 PCR 后上经的收集是最关键的步骤之一，因为它是生成微球单链 DNA 的主要过程。放大后，向每个样品添加八升 6X 加载缓冲液。将每个样品的15微升装入2%的加糖凝胶中。

然后在 1X TAE 缓冲器中以 100 伏执行电泳 35 分钟。将杂交微球放在支架中，将支架连接到共合显微镜的舞台上。选择激光并在激光控制中将其打开。

在显微镜控制中选择目标透镜。然后在配置控制中选择氰氨酸-3和通道所需的过滤器。最后，开始实验并观察样本。

制造的聚合物液滴基微流体平台由两个PDMS层组成。三种微流体通道网络用于生成微球，即流聚焦几何、一、二混解蛇形通道和微球凝固聚合通道。实验室气动控制系统用于矿物油的连续流动，两个注射器泵用于在微流体平台中生成微球。

如果微球与五分之一丙烯体DNA探针正确功能化，它们应在杂交实验期间覆盖表面的荧光活性，如这些荧光图像所示。如果共聚合物化不能正确发生，光学微球图像将在微球内出现内部污染。使用DNA寡基因器操作微球的3D表面是一个更快的过程，流动微球合成平台可以为单链DNA扩增和纯化提供工具。

最初共混合的五金AP在退火到其互补模板后，为DNA聚合提供了一个三极羟基端。在非对称PCR实验中观察到双链DNA污染物。通过凝胶电泳分析，与合成尺寸标记进行比较，证明了微球PCR产生的单链DNA。

在尝试此过程时，必须记住，在此方法中获取放大周期、退火温度和探针序列时，需要事先了解优化 PCR 实验所必需的协议和调整。该技术开发后，为诊断和治疗领域的研究人员将分子生物技术和生物医学两个区域连接为一线铺平了道路。不要忘记，使用丙烯酰胺溶液可能很危险，在执行此过程时应始终采取预防措施，如戴上手套和实验室外套。