Name: 一种基于液滴的单链 dna 放大术和微球 pcr 扩增法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 了解基于液滴的微流控平台制备方法，利用聚丙烯酰胺微球进行微球PCR扩增，无需分离步骤即可高效生成单链DNA。该技术在疾病诊断和治疗领域具有重要应用价值。

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本研究由一项名为 &#34;农业科学合作研究计划 &amp;#38; 技术开发（项目编号：PJ0011642）&#34; 由韩国农村振兴厅资助。本研究还部分得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究中心项目（NRF-2017R1A2B4012253）的资助，该项目由科技信息通信部资助。 &amp;#38; 未来规划部，大韩民国。本研究还得到了大韩民国产业通商资源部资助的创意与产业融合教育项目（项目编号：N0000717）的资助。

1. PDMS 微流控平台的制备
<ol>
	<li>通过按10:1的体积比混合基础聚合物和催化剂，制备20 mL液态PDMS预聚物。将10 mL液态PDMS浇注到硅片上预先制备的SU-8模具上，用于微流控网络的上部结构；对于底部平坦部分，则将相同体积的液态PDMS浇注到无模具结构的硅片上。 
	注意：微流控网络在CAD程序中设计，随后转换为光掩模，以通过典型的光刻工艺制备母模（参见补充图）。该母模由硅片上的负性光刻胶SU-8模具构成11。</li>
	<li>将涂有液态PDMS预聚物的两片硅片置于加热板上，在75 °C下固化30分钟。
	<ol>
		<li>手动从SU-8模具上剥离固化的PDMS层。将直径为1.5 mm的圆形打孔工具对准复制出的微流控网络上的油口，以连接微尺度流道与宏观流体样品。手动打出通孔。</li>
		<li>重复此打孔操作三次，用于形成两个溶液入口及出口端口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用手持式电晕处理仪对上层和底层PDMS层进行亲水表面处理，每个样品处理数秒12。
	<ol>
		<li>将两层经等离子体处理的PDMS堆叠后，使用加热板在90 °C下加热30分钟，完成PDMS与PDMS之间的键合。通过注射泵向三个入口端口通入加压水，以实现结构键合并测试所制备器件的泄漏情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 聚丙烯酰胺寡微球的制备
<ol>
	<li>按照表1中详述的配方制备微珠混合物。</li>
	<li>涡旋并短暂离心标准单链DNA丙烯酰胺标记探针（Ap，100 μM）和丙烯酰胺:双丙烯酰胺（19:1）储备液。</li>
	<li>通过混合25 μL 40%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液、10 μL单链DNA（丙烯酰胺探针）、10 μL 5x TBE缓冲液（1.1 M Tris；900 mM 硼酸；25 mM EDTA）和5 μL水来制备溶液I。用50 μL 20%过硫酸铵制备溶液II。</li>
	<li>准备两个注射器，分别装入溶液I和溶液II，并将其安装到泵上，以将溶液引入微流控平台。准备含有0.4% TEMED的矿物油，用于微球表面的固化。 
	注意：TEMED是众所周知的自由基稳定剂。自由基可加速过硫酸铵（APS）引发的聚合反应速率，从而催化丙烯酰胺的聚合。</li>
	<li>用4 mL矿物油填充玻璃瓶，以产生连续流动。</li>
	<li>在玻璃瓶盖上插入两根管子作为微流控储液池：气动端口用于将空气压缩机产生的压缩空气导入玻璃瓶，流体端口用于将加压的油从玻璃瓶输送至微通道网络。将玻璃瓶与微流控装置的油入口之间用管路连接。
	<ol>
		<li>将管路连接至微流控装置的两个溶液入口，以从注射泵输送两种溶液。将管路插入出口端口，以便将生成的微球转移至烧杯中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将注射泵的流速设置为0.4 - 0.7 mL/h。使用调压阀调节空气压缩机的压缩空气压力（82 - 116 kPa）。将置于加热板上玻璃烧杯内的磁力搅拌子转速设为500 rpm。启动注射泵，并通过电磁阀的开关控制，将外部压缩机产生的压缩空气通入玻璃瓶13。</li>
	<li>使用数字显微镜观察流动聚焦结构中微球的形成以及在玻璃烧杯中生成微球的固化过程。 
	注意：微球的尺寸和生成速度取决于溶液的流速以及施加于矿物油流动的压力（表2）。</li>
</ol>
3. 进行聚丙烯酰胺寡核苷酸微球计数
<ol>
	<li>进行血细胞计数板定量时，取少量聚丙烯酰胺寡聚微球水溶液（约 100 μL），滴加到血细胞计数板的玻璃表面，并轻轻将微球悬浮液充满计数室的加样区。 
	注意：更多细节请参见 http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer。</li>
	<li>使用显微镜和手动计数器，对一组 16 个方格内的微球进行计数。随后移动血细胞计数板至计数室的下一组区域，继续计数，直至完成全部四组 16 个角落方格的计数。</li>
	<li>计算微球的平均数量，并推算原始微球悬浮液中的微球总数。</li>
	<li>将 100 μL 微球转移至 1.5 mL 微离心管中。通过低速离心（400 × g）并用移液器小心吸除上清液。</li>
</ol>
4. 在聚丙烯酰胺寡微球表面进行DNA杂交
注意：将一种相同的DNA探针（其5’端为-NH2基团而非5’-丙烯酰基修饰）加入溶液I中，并平行检测含Ap的微球。DNA杂交结果见图2。Cy3标记的互补寡核苷酸探针（cAp）溶液应置于避光环境中。
<ol>
	<li>用 100 μL 的 1× TE 缓冲液（TE 缓冲液：10 mM Tris 和 1 μM EDTA，pH 8.0）重悬 Cy3-cAp，以获得 100 μM 的终浓度。例如，将 1 pmol 的 cAp 溶于 100 mL TE 缓冲液中，并转移至用铝箔包裹的微量离心管中。 
	注意：链序列见表 3。</li>
	<li>向含有 Ap-共聚微球的无菌 1.5 mL 微量离心管中加入 100 μM 的 Cy3-cAp。</li>
	<li>轻敲管壁数次以混匀，然后在室温避光条件下孵育 1 小时。</li>
	<li>弃去上清液，并通过移液去除残留缓冲液。</li>
	<li>用 500 μL TE 缓冲液洗涤三次。</li>
	<li>轻轻敲击微量离心管使微球重悬，然后重复步骤 4.4。</li>
	<li>将微球置于载玻片（75 mm × 50 mm）上，并在成像前用铝箔覆盖。</li>
</ol>
5. 用于扩增单链DNA的不对称PCR
<ol>
	<li>准备用于扩增待分析单链DNA（ssDNA）的不对称PCR试剂混合物。将表4中的试剂在冰上解冻。Taq DNA聚合酶（50 U/µL）不得长时间置于冰上，应保存在-20 °C，待使用时再取出。</li>
	<li>轻轻涡旋混匀所有试剂，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。</li>
	<li>按照表4所述组合所有试剂。</li>
	<li>将样品放入热循环仪中，并按以下条件启动不对称PCR程序：25个循环（95 °C变性30秒，52 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），85 °C延伸5分钟，最后在4 °C保存。</li>
</ol>
6. 用于扩增单链DNA的微球PCR
注意：本节描述了在PCR反应管中扩增单链DNA的实验方案。微球PCR反应的总体积为50 μL。用于扩增单链DNA的详细序列见表5。在此过程中，微球表面的Ap可与随机DNA模板以互补方式退火。这是生成互补DNA链（反义DNA链，图3）的关键步骤。延伸所得的DNA将作为微球PCR扩增的模板。
<ol>
	<li>配制微球-PCR试剂混合液。将表6中的试剂在冰上解冻；但Taq DNA聚合酶不应长时间置于冰上，应保存在-20 °C，待使用时取出。</li>
	<li>轻轻涡旋混匀所有试剂，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。</li>
	<li>通过显微镜计数获得约~25个微球。 
	注意：单个反应管中微球的数量使用40倍光学显微镜进行计算。微球-PCR扩增通常使用约~25个微球。更详细的信息见步骤3。</li>
	<li>按照表6中所述组合所有试剂。</li>
	<li>将样品放入热循环仪中，并按以下条件启动不对称PCR：25个循环（95 °C 30秒，52 °C 30秒，72 °C 30秒），85 °C 5分钟，然后在4 °C保存。</li>
	<li>扩增完成后，向每个样品中加入8 μL的6×上样缓冲液，取15 μL样品加入2%琼脂糖凝胶中。随后在1× TAE（Tris-乙酸-EDTA，40 mM Tris乙酸，1 mM EDTA，pH 8.2）缓冲液中以100 V电泳35分钟。</li>
</ol>
7. 共聚焦显微镜图像采集
注意：微球-DNA探针杂交结果在共聚焦显微镜下成像，图像分析使用ImageJ软件进行。
<ol>
	<li>将杂交后的微球固定在显微镜载物台的支架上。</li>
	<li>在激光控制中选择激光器（氦氖激光器，543 nm谱线）并开启。</li>
	<li>在显微镜控制中选择物镜镜头。</li>
	<li>在配置控制中为Cy3选择所需的滤光片和通道。</li>
	<li>开始实验并观察样品。共聚焦显微镜的设置参数总结于表7中。</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li>
<li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+%28AIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li>
<li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li>
<li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li>
<li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777(2016).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1537519">Formation of dispersions using &#34;flow focusing&#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045793014002217">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li>
<li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6(2003).</li>
<li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

双链DNA（dsDNA）的污染是单链DNA（ssDNA）扩增中的主要问题。在传统的不对称PCR扩增中，仍难以有效抑制双链DNA的扩增15。此外，尽管生成单链DNA的技术已有改进，使样本通量效率得以提高，但由于成本高昂且纯化得率不完全，单链DNA的分离纯化仍然存在困难。
不对称PCR是在处理单链DNA（ssDNA）时最具挑战性的方法之一。该方法使用不等量的引物（例如，20:1的比例），以大量生成ssDNA。然而，要优化每个扩增反应以获得ssDNA非常困难。因此，必须从产物中去除副产物（双链DNA，dsDNA）4。
为了在无需额外分离步骤的情况下生成单链DNA（ssDNA），我们采用丙烯酰化共聚方法制备了聚丙烯酰胺微球，以暴露DNA探针。我们的DNA固定方法可轻松适配基于液滴的微流控平台。成功制备出具有微米级直径的共聚寡微球。随后，通过微球-PCR在单管反应中扩增了ssDNA。当然，若将该方法应用于其他PCR实验，则需...

由于单链DNA（ssDNA）具有进行DNA-DNA杂交的内在特性，它已被广泛视为一种分子识别元件（MRE）1,2。ssDNA合成系统的发展可推动多种生物应用，例如基于互补相互作用的DNA微阵列3、寡核苷酸治疗、诊断技术以及集成化分子传感系统4,5。
迄今为止，已利用微流控装置成功制备出微米级聚合物颗粒。多种微流控技术已被证实可在微通道环境中连续流动条件下高效地生成高度均一的微球6,7。
在Lee et al.8的研究中，报道了一种基于液滴的微流控平台，用于共聚可交联寡聚微球的微流控合成及单链DNA扩增。该微流控平台由两层PDMS（聚二甲基硅氧烷）构成：上层为具有微流控通道网络的结构，用于生成微球；下层为平坦基底。该系统包含三种类型的PDMS流体通道：1）用于生成液滴的流动聚焦通道，2）用于混合两种溶液的蛇形通道，以及3）用于顺序聚合反应以实现微球固化的通道。当两种互不相溶的流体被引入同一PDMS流体通道时，流体被迫通过狭窄的孔道结构。通道几何形状、流速和黏度等流动行为会影响微球的尺寸和形貌。因此，主液流可被分割为微米尺度的单分散微球9,10。
本文提供了一种用于扩增单链DNA（ssDNA）的详细微球-PCR方案。首先，介绍了基于液滴的微流控装置的设计过程。随后，阐述了如何以互补的方式将随机DNA模板功能化至聚丙烯酰胺微球表面。最后，展示了利用微球进行单链DNA扩增的PCR操作流程。

<table><tbody><tr><td>液态聚二甲基硅氧烷，PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>芯片组分</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液（19:1）</td><td>Bio-rad</td><td>1610140</td><td>可共聚寡聚微球的组分</td></tr><tr><td>过硫酸铵，APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液的固化剂</td></tr><tr><td>N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-四甲基乙二胺，TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>过硫酸铵的催化剂</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td>表1. 溶液III. 微球试剂组分</td></tr><tr><td>Cy3标记的互补寡核苷酸探针</td><td>Bioneer</td><td>合成</td><td>表3. 序列信息&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>丙烯酰胺修饰的单链DNA探针</td><td>Bioneer</td><td>合成</td><td>表1. 溶液I. 微球试剂组分</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosesang</td><td>&amp;nbsp;T1016</td><td>TE缓冲液组分，pH缓冲溶液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>TE缓冲液组分，去除离子（Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>单链DNA扩增</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>识别微球表面暴露的寡核苷酸</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>eclipse 80i</td><td>计算微球数量</td></tr><tr><td>T100热循环仪</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td>单链DNA扩增</td></tr><tr><td>手持式电晕处理仪</td><td>Electro-Technic</td><td>BD-20AC Laboratory Corona Treater</td><td>亲水性表面处理</td></tr><tr><td>加热板</td><td>As one</td><td>HI-1000</td><td>用于液态PDMS固化的加热平台</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>kd Scientific</td><td>78-1100</td><td>溶液I和溶液II的均匀流动</td></tr><tr><td>空气压缩机</td><td>Kohands</td><td>KC-250A</td><td>溶液III的流体控制</td></tr><tr><td>亮线血细胞计数板</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>计算微球数量</td></tr></tbody></table>

基于液滴的微流控方法与微球pcr扩增用于单链dna扩增子

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

基于液滴的微流控技术能够在微流控通道中可靠地生成均一的微球，从而精确控制所获得微球的尺寸和形貌。已成功制备出与丙烯酰基-DNA探针共聚的微球。合成单链DNA（ssDNA）的方法包括不对称PCR、外切酶消化以及链霉亲和素包被的磁珠分离等。然而，这些方法无法高效地利用大量高纯度的ssDNA。本文介绍了一种微球-PCR方案，详细说明了如何通过简单地从PCR反应管中移液，即可高效扩增ssDNA并将其与双链DNA（dsDNA）分离。该ssDNA的扩增产物可作为DNA微阵列和DNA-SELEX（指数富集配体系统进化）过程中的潜在试剂。

所制备的基于聚合物液滴的微流控平台由两层PDMS组成（图1a）。生成微球时使用了三种类型的微流控通道网络：1）如图1b所示的流动聚焦结构；2）用于混合溶液I和溶液II的蛇形通道；3）用于微球固化的聚合通道。所有通道的高度均为60 μm。混合通道和聚合通道的长度分别为74.35 mm和94.45 mm。用于两种不混溶流体流动的微通道宽度为100 μm，矿物油流动通道的宽度为200 μm。用于微球形成的孔口结构长度为50 μm，宽度为25 μm。扩散器结构的角度为37°。采用实验室自制的气动控制系统以实现矿物油的连续流动，并结合两台注射泵控制溶液流动（图1c），在微流控平台中生成微球（图1d）。当溶液流速和施加压力分别为0.6 mL/h和108 kPa时，微球的生成速度约为每秒30个（表2）。微球在微通道中...

本研究提供了一种用于制备基于液滴的微流控平台的方法，并应用聚丙烯酰胺微球进行微球-PCR扩增。微球-PCR方法能够在无需分离双链DNA的情况下获得单链DNA扩增产物。

基于液滴的微流控方法与微球PCR扩增用于单链DNA扩增子

基于液滴的微流控技术能够在微流控通道中可靠地生成均一的微球，实现对尺寸的精确控制以及……

该方法有助于解答微流控系统组合技术及分子生物技术领域中的关键问题，例如微流控装置与不对称PCR方法。该技术的主要优势在于能够高效生成高度均一的微球，并且无需额外分离步骤即可产生单链DNA。该技术的应用前景涵盖多种疾病的诊断与治疗。由于单链DNA的生成对于适配体检测实验至关重要，因此该技术可用于疾病的检测与治疗。尽管该方法有助于深入了解微机电系统（MEMS）中的三维微流控系统，但也可应用于其他用于疾病检测与治疗的系统。通常，初次使用该方法的研究人员在有效控制流体防止其反向流动方面会遇到困难。该方法的可视化演示对于观察流动聚焦结构中微球的形成以及所生成微球的固化过程至关重要。首先，通过将基础聚合物与催化剂按10:1的比例混合，制备20毫升液态PDMS预聚物。将10毫升液态PDMS倒入置于硅片上的预制SU-8模具中，用于制作微流控网络的上部结构。对于底部平面部分，在硅片上倒入与有模具结构时相同体积的液态PDMS，但不使用模具结构。将两片涂有液态PDMS预聚物的硅片置于预热的加热板上，在75摄氏度下固化30分钟。随后，手动将固化的PDMS层从SU-8模具上剥离下来。将直径为1.5毫米的圆形打孔工具对准复制的微流控网络上的油相入口，以连接微米级流道与宏观流体样品，然后手动冲出通孔。重复打孔过程三次后，使用手持式电晕处理仪对上下两层PDMS进行亲水表面处理，每个样品处理数秒。将两层经等离子体处理的PDMS堆叠，并在加热板上于90摄氏度加热30分钟，以完成PDMS与PDMS的键合过程。涡旋并短暂离心一条标准的带有丙烯酰胺标记的单链DNA探针以及一份19比1的丙烯酰胺双丙烯酰胺储备溶液。通过混合25微升40%丙烯酰胺双丙烯酰胺溶液、10微升单链DNA、10微升5倍浓度TBE缓冲液以及5微升水来配制溶液一。用50微升20%过硫酸铵制备溶液二。分别将溶液一和溶液二装入两个注射器中，并将注射器安装到注射泵上，以将溶液引入微流控平台。准备含有0.4%TEMED的矿物油，用于微球的表面固化。将矿物油注入玻璃瓶后，将两根管路插入玻璃瓶瓶盖上的气动端口和液体端口，作为微流控储液池。将管路连接在玻璃瓶与微流控装置的油相入口之间。将管路连接至微流控装置的两个溶液入口，以便从注射泵输送两种溶液。然后将试管插入出口端口，以将生成的微球转移至烧杯中。接下来，将注射泵的流速设置为0.4至0.7毫升每小时。使用调压阀调节压缩机的压缩空气压力。将带有磁力搅拌子的玻璃烧杯置于加热板上，并设定旋转速度。启动注射泵，并通过电磁阀的开关控制，将外部压缩机产生的压缩空气通入玻璃瓶中。使用数字显微镜观察流动聚焦结构中微球的形成过程，以及在玻璃烧杯中生成微球的固化过程。观察微球的形成是其中最关键的步骤之一，因为这是本研究中制备微球和微流控系统的主要过程。随后，将100微升微球转移至1.5毫升微量离心管中。然后通过轻柔离心和移液去除上清液。使用100微升1X TE缓冲液重悬互补探针修饰的Cy3，以获得100微摩尔的终浓度。随后，将100微摩尔的互补探针修饰Cy3加入含有AP共聚微球的无菌1.5毫升微量离心管中。轻轻敲击管壁数次以混匀，并在室温避光条件下孵育1小时。孵育结束后，弃去上清液，并通过移液去除残留缓冲液。随后用500 µL TE缓冲液冲洗三次。将微球置于75 mm × 50 mm的玻璃载片上，并在成像前覆盖铝箔。使用40倍光学显微镜通过显微计数法获取约25个微球。随后，按照文本方案所述将所有试剂混合。将样品放入热循环仪中，并在适当条件下启动不对称PCR反应。不对称PCR后收集上清液是最关键的步骤之一，因为这是利用微球生成单链DNA的主要过程。扩增完成后，向每个样本中加入八微升6X上样缓冲液。将每个样本中的15微升上样至2%琼脂糖凝胶中。然后在1×TAE缓冲液中以100伏电压进行35分钟电泳。将杂交后的微球放入支架中，并将支架固定到共聚焦显微镜的载物台上。在激光控制中选择激光并打开。在显微镜控制中选择物镜。然后在配置控制中为氰基-3选择所需的滤光片和通道。最后，启动实验并观察样本。所构建的基于聚合物液滴的微流控平台由两层PDMS组成。采用三种微流控通道网络用于生成微球，分别为聚焦流几何结构、用于混合溶液一和溶液二的蛇形通道，以及用于微球固化的聚合通道。在微流控平台中生成微球时，使用了实验室自制的气动控制系统以实现矿物油的连续流动，以及两台用于溶液流动的注射泵。如果微球被正确地用5'丙烯酰胺修饰的DNA探针功能化，在杂交实验中，这些荧光图像所示，微球表面应呈现出均匀的荧光信号覆盖。如果共聚反应未正确发生，光学显微镜下的微球图像将显示微球内部存在污染。利用DNA寡核苷酸探针对微球的三维表面进行操控是一种更为快速的过程，而流动式微球合成平台则可为单链DNA的扩增与纯化提供一种工具。最初共聚的5'端AP在与互补模板退火后，可为DNA聚合提供3'端羟基。在不对称PCR实验中观察到双链DNA污染物。通过与合成的大小标记物进行凝胶电泳分析比较，证实了从微球PCR中积累得到的单链DNA产物。在进行该实验操作时，需牢记：为了获得本方法中的扩增循环数、退火温度和探针序列，必须具备优化PCR实验所常用的方案知识及必要的调整经验。该技术建立后，为分子生物技术和生物医学领域的诊断与治疗研究者架起了连接两个研究领域的桥梁。切勿忘记，丙烯酰胺溶液具有潜在危害性，操作过程中必须采取预防措施，例如始终佩戴手套和实验服。

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