生物工程应用先进材料的抗菌性能研究
August 4th, 2018
我们提出了一种先进材料的抗菌性能的协议。在这里, 材料表面的抗菌活性通过两种相互补充的方法来测量: 一是基于琼脂盘扩散试验, 另一种是基于 ISO 22196:2007 规范的标准程序。
这种方法可以帮助回答材料工程领域的关键问题，例如抗菌性能，这些问题对于许多生物工程应用来说是非常理想的。该技术可用作跨实验室的一致方案，以帮助经验不足的研究人员，他们需要深入的分步程序来遵循以获得准确的结果。当我们开始寻找抗菌方案时，我们第一次想到了这种方法，并意识到文献中没有关于这种方法的详细方案。
在这项研究中，将测试四种具有不同化学性质的先进材料和一种对照材料的抗菌活性。通过将每种材料切成直径为 10 毫米的圆盘来准备每种材料。接下来，将每个样本浸入 70% 乙醇中 10 分钟，然后每侧用紫外线照射 1 小时，对每个样本进行消毒。
将使用三种不同的微生物来测试先进材料的抗菌活性。革兰氏阳性菌 金黄色葡萄球菌 、革兰氏阴性菌 大肠杆菌 和酵母菌 白色念珠菌。使用无菌棉签，将每种微生物的几个菌落重悬于无菌离心管中所含的 25 mL 胰蛋白酶大豆肉汤或 TSB 中。
涡旋 1 分钟以实现均匀混合。用分光光度计测量每种微生物培养物在 540 nm 处的吸光度。将每种微生物的浓度调整到适当数量的菌落形成单位，或每毫升 CFU。
将微生物悬浮液涡旋 5 秒钟以改善微生物分散，然后将无菌棉签短暂浸入该微生物悬浮液中。将棉签压在含有培养物的管壁上，从拭子中去除多余的液体。用无菌棉签将每个微生物肉汤悬浮液均匀地划到胰蛋白酶大豆琼脂或 TSA 板的表面，分成三个平面，以用微生物覆盖整个表面。
接种后让板干燥 5 分钟。将微生物肉汤悬浮液留在工作台上，以备后用，以检查微生物悬浮液的浓度和纯度。将一对镊子浸入含有 96% 乙醇的烧杯中，然后用酒精燃烧器燃烧，对镊子进行消毒。
使用无菌镊子将要测试的样品盘放在 TSA 板的中心。将 TSA 板在 37 摄氏度下倒置孵育 24 小时。要分析扩散测试结果，请使用数字卡尺测量抑制区的直径和样品盘直径，或者通过拍照并使用合适的图像处理软件来测量
。该程序对于验证先前确定的微生物浓度是否正确以及确保没有微生物环境污染是必要的。使用具有合适高压灭菌吸头和无菌条件的微量移液器，将无菌 TSB 分配到无菌微量离心管中。包括将用作阴性对照的样品。
使用先前用于划线 TSA 板的微生物肉汤悬浮液进行六次十进制连续稀释。使用预先消毒的 Drigalski 刮刀，将 100 升每种选定的稀释液涂抹在 TSA 板上。将 100 l 不含微生物的 TSB 培养基涂抹在 TSA 平板上作为阴性对照。
将 TSA 板在 37 摄氏度下孵育 24 小时。第二天，计算菌落数，以检查每毫升的 CFU 是否与之前确定的 CFU 相似。检查阴性对照板以确认没有微生物环境污染。
通过在 37 摄氏度的轨道振荡器中过夜，在 TSB 中培养要测试的不同微生物来开始此过程。第二天，测量每种过夜培养物的 OD 540，然后在 50 mL 预灭菌离心管中的 20 mL TSB 中将每种培养物稀释至浓度约为每毫升 10 至 6 CFU。将每种材料的四个圆盘和四个对照圆盘放入无菌 48 孔板的单独孔中。
将 150 l 微生物悬浮液移液到每个圆盘表面。将板在 37 摄氏度的培养箱中孵育 24 小时。48 孔板孵育 24 小时后，将 850 l 无菌 PBS 移液到四个样品盘和四个对照盘的表面上，并与微生物悬浮液混合。
从 48 孔板中收集每种 PBS 微生物悬浮混合物和每个圆盘，并转移到 15 mL 预灭菌管中。涡旋 PBS 微生物悬浮混合物和圆盘 1 分钟。以 50 Hz 的频率超声处理 5 分钟，然后再次涡旋 1 分钟，以确保没有活微生物粘附在材料表面。
对超声处理的培养物和含有 TSB 的无菌微量离心管进行十进制连续稀释。将 100 L 每种稀释液涂抹在 TSA 板上，并在 37 摄氏度下用氧孵育板 24 小时。24 小时后，计算菌落数，并以 CFU 每毫升表示该数字。
然后，按照文本协议中的说明分析接触方法结果。琼脂盘扩散试验的结果表明，第一种材料具有非抗菌活性，而其他三种材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性增加。该图显示了孵育 24 小时后每个材料盘针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的标准化光晕。
接触方法的结果还表明，第一种材料具有非抗菌活性，而其他三种材料对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性增加。C 是孵育 24 小时后从对照盘中回收的活细菌。该图显示了四种材料在材料表面对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活力损失百分比。
样本 M1 没有表现出抗菌活性。虽然这里没有显示，但这四种材料都不能通过其他方法抑制酵母（白色念珠菌）的生长。观看此视频后，您应该对如何通过这两种互补方法确定抗菌活性有很好的了解。
概览
本文介绍了一种使用两种互补方法对先进材料进行抗菌特性表征的协议：琼脂盘扩散测试和ISO 22196:2007标准程序。该研究旨在为研究人员提供一种一致的协议，以有效评估抗菌性能。
关键研究组成部分
科学领域
- 材料工程
- 生物工程
- 微生物学
背景
- 抗菌性能对许多生物工程应用至关重要。
- 现有文献缺乏测试材料抗菌活性的详细协议。
- 本研究解决了对标准化方法的需求。
- 四种先进材料和一种对照材料被测试了它们的抗菌活性。
研究目的
- 开发一个可靠的协议来评估材料的抗菌活性。
- 协助经验较少的研究人员提供循序渐进的步骤。
- 比较不同先进材料对特定微生物的有效性。
使用的方法
- 材料盘的制备和灭菌。
- 将微生物悬液接种到琼脂板上。
- 孵化和测量抑菌区。
- 使用连续稀释分析微生物活性。
主要结果
- 结果显示被测试材料之间的抗菌活性水平不同。
- 第一种材料没有显示抗菌活性。
- 其他材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现出增加的抗菌活性。
- 接触法结果确认了琼脂盘扩散测试的发现。
结论
- 开发的协议为抗菌测试提供了一种系统的方法。
- 它可以在各个实验室中使用以确保结果的一致性。
- 该研究突出了材料性质在生物工程应用中的重要性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Antimicrobial characterization of advanced materials is critical for bioengineering applications where infection risk must be mitigated, such as tissue engineering and implantable devices. This protocol provides a standardized, reproducible method to evaluate antimicrobial activity against relevant bacterial strains, supporting early-stage material screening and de-risking. By enabling consistent assessment across laboratories, it aids in the selection of materials with appropriate functional properties for downstream development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of material-induced antimicrobial effects to support hypothesis testing in biomaterial design.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for comparing antimicrobial performance across material candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative inhibition zone and viability loss data for comparative material screening.
- Operational Value: Establishes reproducible assay conditions using standardized microbial suspensions and incubation parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports evaluation of material biocompatibility by assessing resistance to microbial colonization.
- Operational Value: Delivers data to inform go/no-go decisions in material advancement based on infection risk profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling early evaluation of material properties that influence biological interactions, particularly in antimicrobial performance, before progressing to more complex preclinical models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of material properties affecting microbial growth and survival.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for ranking material candidates by antimicrobial efficacy.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as inhibition zone diameter and percent viability loss for comparative analysis.
- Translational Research: Connects material screening to infection risk assessment in biomedical applications.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for antimicrobial evaluation across multiple material development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in material selection by reducing ambiguity in antimicrobial performance.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across research sites and material batches.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted material prioritization, reducing late-stage failure due to infection-related complications.
- Portfolio Impact: Enables data-driven advancement decisions based on infection mitigation potential.
Implementation Considerations
- Requires microbiological expertise for sterile handling, culture preparation, and CFU quantification.
- Dependent on access to incubators, spectrophotometers, and imaging or caliper tools for zone measurement.
- Necessitates standardized protocols for microbial suspension preparation and dilution to ensure comparability.
- Must account for material-specific variables such as thickness, porosity, and surface chemistry that may affect diffusion or contact efficacy.
- Limited to bacterial and yeast models; does not assess activity against viruses, fungi beyond Candida albicans, or biofilms.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Sample Preparation
1:16
Agar Disk Diffusion Test (Diffusion Method)
3:27
Checking of Microbial Suspension Concentration and Purity
4:40
Measurement of Antimicrobial Activity on Material Surfaces (Contact Method)
6:44
Results: The Diffusion Method and the Contact Method Can Test Anti-microbial Activities of Advanced Materials
7:51
Conclusion
