Name: 生物工程应用先进材料的抗菌性能研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 了解先进材料的抗菌性能研究方法，使用琼脂扩散法和ISO 22196标准程序评估金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果。该方案为生物工程应用提供可靠的抗菌测试流程。

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作者感谢瓦伦西亚天主教大学圣维森特·马尔蒂尔通过2017-231-001UCV和2018-231-001UCV资助项目为本工作提供的财政支持。

1. 样品制备
<ol>
	<li>使用直径为10 mm的圆柱形打孔器将材料样品切割成直径10 mm的圆片。 
	注意：脆性材料可先在合适的无菌溶剂中软化1小时，然后切割成圆片。例如，亲水性材料如海藻酸锌按照本方案进行测试时，需在切割前用高压灭菌水润湿，以避免样品断裂。然而，其他疏水性材料如聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸酯)则无需预先溶胀即可顺利切割。</li>
	<li>将样品材料圆片置于真空烘箱（&lt;10-2 Torr）中，在60 °C下干燥24小时。 
	注意：某些材料可能需要更高的干燥温度。但重要的是，温度不得达到可能导致材料热降解的程度。</li>
	<li>使用数字卡尺测量材料薄膜的厚度。 
	注意：本方案建议在比较不同材料的抗菌活性时，使用厚度一致且相近的材料薄膜。</li>
	<li>将每个样品通过浸入70%乙醇中10分钟，并随后对每一面进行1小时的紫外线（UV）照射，以实现灭菌。 
	注意：紫外线照射可将每个样品置于无菌培养皿中，放入配备12.0 W UV-C辐射灯的层流罩内进行。 
	警告：研究人员应避免暴露于紫外线辐射下，因其具有致突变性。</li>
	<li>对对照材料圆片执行步骤1.1、1.2、1.3和1.4。 
	注意：在扩散法和接触法中，可使用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）或其他非抗菌材料作为对照圆片。此外，在表征纳米复合材料或处理材料时，应使用基体材料作为对照材料。</li>
</ol>
2. 推荐的微生物
注意：我们建议使用 3 种不同的微生物，以研究测试材料对多种微生物的抗菌能力。
<ol>
	<li>使用三种微生物的纯培养物：Staphylococcus aureus（革兰氏阳性细菌）、Escherichia coli（革兰氏阴性细菌）以及酵母菌Candida albicans。 
	注意：必要时可通过调整培养条件，使用本方案检测其他微生物种类。 
	警告：必须根据本方案中所使用的微生物类型，遵循相应的生物安全防护措施。</li>
	<li>操作过程中应使用预先灭菌或经高压灭菌的材料，并全程使用本生灯进行微生物操作，或在必要时使用生物安全柜，以确保无菌条件。 
	注意：推荐的高压灭菌条件为：培养基在121 °C下灭菌15分钟，实验材料和生物废弃物在121 °C下灭菌20分钟。</li>
</ol>
3. 琼脂扩散法试验（扩散法）
注意：当抗菌化合物的液体扩散可能是先进材料主要的抗菌机制时，扩散法可提供有关这些材料抗菌能力的非常有用的信息。位于琼脂平板中心的材料圆片在培养24小时后，可在其周围形成一个透明的抑菌环（晕圈），表明微生物生长受到抑制（见图1）。
<ol>
	<li>扩散试验步骤
	<ol>
		<li>根据制造商说明制备胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）并进行高压灭菌。</li>
		<li>在无菌条件下，使用本生灯或层流罩，将TSA倒入无菌培养皿中。 
		注意：TSA平板厚度必须为4–6 mm。</li>
		<li>将待测的不同微生物在37 °C培养箱中，于含TSA的培养皿内需氧培养18–24小时。</li>
		<li>根据制造商说明制备胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）并进行高压灭菌。</li>
		<li>在无菌条件下，使用本生灯或层流罩，通过预灭菌的移液管将TSB加入50 mL预灭菌离心管中。</li>
		<li>使用无菌棉签从步骤3.1.3中挑取数个菌落，悬浮于装有25 mL TSB的无菌离心管中，并涡旋混匀1分钟，以获得均匀的菌悬液。</li>
		<li>使用分光光度计将菌液在540 nm处的吸光度调整至合适的菌落形成单位（CFU）浓度：细菌约为1.5 × 108 CFU/mL，酵母菌为1 × 106 至 5 × 106 CFU/mL。 
		注意：测定吸光度时所用的菌液和比色皿体积应根据所用分光光度计的类型进行选择。</li>
		<li>将微生物肉汤涡旋5秒以提高微生物分散性，然后将无菌棉签短暂浸入该菌悬液中。通过将棉签在装有菌液的管壁上轻压，去除多余液体。</li>
		<li>用该无菌棉签将微生物肉汤菌悬液均匀涂布于TSA平板表面，沿三个方向划线，使整个平板表面均匀覆盖微生物，接种后静置干燥5分钟。 
		注意：为去除多余水分，接种前应将TSA平板倒置并敞开放置于37 °C环境中10–15分钟。</li>
		<li>将一对镊子浸入盛有96%乙醇的烧杯中进行消毒，随后用本生灯或酒精灯火焰灼烧灭菌。</li>
		<li>使用无菌镊子将待测样品片和对照片放置于TSA平板中央。</li>
		<li>将TSA平板倒置，在37 °C下需氧培养24小时。 
		注意：为避免污染风险，建议将TSA平板倒置培养。但如果样品片从平板上脱落，则不应倒置培养。此时建议在层流罩中将平板干燥。该抗菌试验应在不同日期至少重复四次，以确保可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测微生物菌悬液浓度与纯度 
	注意：以下步骤用于验证步骤3.1.7中通过分光光度计测定的微生物浓度是否准确，并确保未发生环境微生物污染。若培养24小时后出现多种类型的微生物菌落，则可轻易发现环境微生物污染。此外，必须通过阴性TSB对照平板确保在系列稀释操作过程中TSB培养基未受微生物污染。
	<ol>
		<li>在无菌条件下，使用带有灭菌吸头的微量移液器，将无菌TSB（步骤3.1.4制备）分装至无菌微量离心管中。其中一管作为阴性TSB对照。</li>
		<li>使用步骤3.1.9中的微生物肉汤菌悬液，在含TSB的无菌微量离心管中进行系列十倍稀释。</li>
		<li>使用预灭菌的Drigalski刮刀或替代工具，将每种稀释液各100 µL涂布于TSA平板上。同时将100 μL不含微生物的TSB培养基（步骤3.2.1制备）涂布于一个TSA平板上，作为阴性TSB对照平板。</li>
		<li>将TSA平板在37 °C下需氧培养24小时。</li>
		<li>计数菌落数量，以确认CFU/mL与步骤3.1.7中测定的结果相近。</li>
		<li>检查TSA平板上是否仅存在单一类型的菌落，以确认无环境微生物污染。</li>
		<li>检查阴性TSB对照平板上无任何菌落生长，以确认无微生物污染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 材料表面抗菌活性的测定（接触法）
 
注意：当表面接触可能是某些先进材料主要的抗菌作用机制时，接触法可提供关于这些材料抗菌能力的非常有用的信息。在该方法中，将微生物直接放置于材料表面，经过一定时间后即可测定其生长抑制情况。
<ol>
	<li>初始操作
	<ol>
		<li>按照制造商说明制备并高压灭菌TSB。</li>
		<li>在无菌条件下，使用本生灯或超净工作台，通过预灭菌的移液管将TSB加入50 mL预灭菌离心管中。</li>
		<li>将待测的不同微生物在含TSB的离心管中，于37 °C、140 rpm的摇床中需氧培养过夜。</li>
		<li>将过夜培养物用20 mL TSB在50 mL预灭菌离心管中稀释至浓度约为106 CFU/mL（通过分光光度计在540 nm处测定）。 
		注意：用于测定吸光度的培养物体积和比色皿体积需根据所使用的分光光度计类型进行选择。</li>
		<li>在含有TSB的无菌微量离心管中对该培养物进行连续十倍稀释。取100 µL稀释液涂布于TSA平板上，并在37 °C需氧培养24小时。</li>
		<li>计数菌落数量，以确认初始细胞浓度约为1 × 106 CFU/mL。</li>
		<li>在无菌48孔板的不同孔中，分别放置4个用于24小时后微生物计数的对照圆片，以及每种待测材料的4个样品圆片用于24小时后的微生物计数。</li>
		<li>用移液器将150 µL微生物悬液滴加到每个圆片表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对照材料与待测材料上的微生物计数（24小时后）
	<ol>
		<li>完成步骤4.1.6后，将48孔板中剩余的4个样品圆片在37 °C下需氧培养24小时。 
		注意：可根据需要调整24小时的培养时间，以研究更短或更长时间下的生长抑制情况。</li>
		<li>培养24小时后，向4个样品圆片表面各加入850 µL无菌PBS，并与原有的150 µL微生物悬液混合。</li>
		<li>从48孔板中收集PBS/微生物悬液混合物及每个圆片，转移至10 mL预灭菌试管中。</li>
		<li>将PBS/微生物悬液混合物与每个圆片先涡旋震荡1分钟，再于50 Hz超声5分钟，最后再次涡旋震荡1分钟，以确保无活微生物仍附着于材料表面。</li>
		<li>将每次超声处理后的培养物在含TSB的无菌微量离心管中进行连续十倍稀释，取100 µL涂布于TSA平板，于37 °C需氧培养24小时。</li>
		<li>计数菌落数量，即为各样品和对照圆片表面的可存活微生物数量，以CFU/mL表示该活细胞数。</li>
		<li>对样品和对照圆片的最终微生物培养结果进行拍照记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 抗微生物结果分析
<img alt="带有抗菌晕圈的微生物培养皿，采用纸片扩散法抑制微生物生长。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：抗菌“晕圈”标准化宽度的测量。 本图显示了抑菌圈直径（diz）和纸片直径（d）。 <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>扩散法结果分析 
	<ol>
		<li>测量抑菌圈的直径（diz）以及圆盘直径（d）（参见 图1使用数字卡尺测量。 
		注意：抑菌圈或抗菌“晕圈”是由抗菌材料圆片抑制微生物生长而形成的（参见 图1可以观察到，在样品周围存在一个透明环状区域，而培养皿的其余部分微生物生长良好，呈现不透明区域。</li>
		<li>测定抗菌“晕圈”的归一化宽度（nwhalo通过应用公式（1）计算每个圆盘的 )。 
		(1)     <img alt="静力平衡方程；晕宽计算公式；n_hw = (d_iz - d)/(2/d)" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>测定经4次确定的抗菌“晕圈”归一化宽度的平均值与标准差 nwhalo 每个样本的数值。</li>
		<li>拍摄最终微生物培养物与材料圆片的照片。 
		注：抑菌圈的直径（diz）以及圆盘直径（d) 也可通过使用合适的图像处理软件，从第 5.1.4 步拍摄的照片中进行测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接触法结果分析
	<ol>
		<li>根据公式（2）确定回收的可存活微生物数量。 
		(2)     <img alt="平衡方程 N=C·D/A；公式计算；教学用途；静力平衡概念" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
		注意：此处， N 是每平方厘米回收的可存活微生物数量2 每份测试样本； C 是平板计数； D 是稀释倍数； A 测试试样的表面积，单位为 cm²2 通过样品圆盘直径确定。</li>
		<li>确定活力丧失（LV) 以反映通过应用公式（3）对细胞生长的抑制作用。 
		(3)     <img alt="晶状体体积损失公式，LV(%)=(C−S)/C×100，数学方程示意图。" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq3v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3"> 
		注：此处，C 为可存活微生物的平均数量（N) 单位为 CFU/mL·cm2，从对照样本中在24小时后回收的；S 是指存活微生物的数量（N) 单位：CFU/mL·cm2，从测试样本中在24小时后回收。</li>
		<li>计算4次测定结果的活力损失均值与标准差 LV(%) 每个样本的数值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

通过一种简单易行的方案，可分析新型先进材料的抗菌活性，该方案包含两个基于现有方法的互补实验步骤：琼脂平板扩散试验38&#160;和依据ISO 22196:2007标准测定材料表面抗菌活性的方法39。
在这一研究领域中，文献中报道的许多抗菌试验高度依赖于具体的检测方法。因此，在不同实验室之间建立详细且一致的实验方案至关重要。本文正是朝着这一方向迈出的一步。此外，对于许多在该领域经验较少、需要深入且逐步的操作流程以获得准确结果的研究人员而言，本文也可能极具帮助。
本方案可适用于多种材料，这些材料需被切割成直径为10 mm的圆片状。脆性材料可在适当的溶剂中溶胀1小时，以使切割过程更加容易。因此，海藻酸盐等亲水性材料可在经高压灭菌的蒸馏水中水化。其他溶剂（如乙醇、酮类和二氯甲烷）可用于疏水性材料，在切割前溶胀1小时。然而，某些材料（如聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸酯)）无需溶胀，可直接进行切割。随后，将样品材料圆片在真空烘箱中充分干燥，并使用乙醇和紫外线照射对每个样品灭菌1小时，以避免任何污染风险，这一步骤极为重要。
本方案推荐使用TSA和TSB作为培养基，并采用3种微生物的纯培养物，以涵盖广泛的微生物种类：革兰氏阳性菌Staphylococcus aureus、革兰氏阴性菌Escherichia coli以及酵母菌Candida albicans。然而，本方案也可适用于其他需要不同培养条件的替代培养基和微生物。有时，仅测试一种微生物即可初步了解新材料的抗菌活性。
对推荐的3种不同类型微生物表现出强效抗菌活性的材料，还应针对耐药性病原体进行测试，例如本方案中已成功应用的耐甲氧西林表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，MRSE）。其他引起广泛关注的重要耐药微生物包括：革兰氏阳性菌中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，MRSA）和耐万古霉素肠球菌（Enterococci，VRE），以及革兰氏阴性菌中的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）40,41。
本方案无法用于测试材料对病毒和寄生虫等其他类型微生物的生物膜抑制作用及抗菌活性。然而，该方案可为新型先进材料的抗菌研究提供一个非常有用的起点。
在抗菌琼脂纸片扩散试验中，一个关键步骤是将样品纸片放置在平板中央，因为某些材料一旦接触琼脂培养基就会发生折叠。此时，建议使用无菌镊子小心地将样品展开。另一方面，在接触法中，必须用PBS充分清洗对照组和样品纸片，具体操作为移液洗涤四次，随后进行剧烈涡旋振荡和超声处理，以确保没有存活的微生物仍附着在材料表面。
该视频方案可用于多种生物工程应用，例如生物过程工程、组织工程、可控药物递送、包装材料、废水处理和农业，这些领域均需使用具有理想抗菌能力的生物材料。
通过本方案获得的结果包括定性结果（图像）和定量结果（抗菌带的归一化宽度） &#34;halo&#34; 以及活力丧失情况），并对其可重复性进行良好分析（均值 ± 标准差）。在比较不同材料时，需对扩散法和接触法所得的均值进行单因素方差分析（one-way ANOVA），随后采用Turkey's检验进行多重比较。 事后检验 分析，以在统计学上研究它们是否存在显著差异（p &#60;0.01).

植入物失败通常是由于在采取抗菌预防措施和无菌操作条件下仍发生的微生物感染所致。这一问题导致了高昂的医疗成本，并给患者带来极大痛苦1。目前，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等重要细菌被认为与导管及其他医用植入物相关的医院内感染密切相关，是医疗器械最主要的污染物之一2。因此，迫切需要开发新型抗菌策略，以满足日常和临床应用的需求。
抗菌剂包括抗生素3季铵盐化合物4金属离子/氧化物5，以及抗菌肽（AMPs）6抗生素由于细菌耐药性的产生而逐渐变得不那么有效7，由于抗生素滥用而呈上升趋势8季铵盐类化合物由于微生物耐药性的原因，仅在短期使用时非常有效。9金属离子/氧化物长期以来一直被用作高效的抗菌剂，广泛应用于多种常见的商业产品中，包括绷带、水过滤器、涂料 等等。10,11,12然而，已有研究表明，这类化合物可能对某些类型的哺乳动物细胞具有毒性13.
抗菌肽（AMPs）具有优异的抗菌和免疫调节特性14,15，且细菌似乎很难对其产生耐药性16。然而，纯AMPs的制备过程成本高昂，因此难以实现大规模生产。为此，已开发出多种应对AMPs生产难题的策略（例如，小分子抗菌肽模拟物17、肽模拟物（peptoids）18、α-肽19和β-肽20）。甲基丙烯酸酯封端的多肽和多肽模拟物已被合成用于抗菌和防污涂层21。
开发新型抗菌剂（如纯态或杂化形式的先进材料），以预防和治疗多重耐药性感染，正变得日益必要。近几十年来，通过多种方法已开发出一系列适用于组织工程和生物过程工程等多个生物工程领域的新型先进材料，其化学和物理性能得到显著提升：包括在疏水性基底上进行等离子体聚合接枝22,23,24、调控交联密度25,26、溶液中聚合27,28,29,30、致孔剂溶解31,32，以及引入纳米材料（如氧化石墨烯（GO）33,34,35,36&#160;和碳纳米纤维（CNFs）37）等方法。
研究这些新材料的抗菌能力可能会使其潜在的生物工程应用呈指数级增长，因此已成为必不可少的环节。本文提供了一种易于遵循的实验方案，用于量化此类新型先进材料的抗菌活性。在完成样品制备后，采用两种互补的方法：第一种基于琼脂平板扩散试验38&#160;（扩散法），第二种则依据ISO 22196:2007标准39&#160;，用于测定材料表面的抗菌活性（接触法）。

<table><tbody><tr><td>圆柱形冲头&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>10 mm 直径</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>soria genlab</td><td>P101</td><td>90 mm 直径，无菌</td></tr><tr><td>胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）</td><td>Liofilchem</td><td>610052</td><td>脱水培养基 500 g（粉末）</td></tr><tr><td>胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）</td><td>Liofilchem</td><td>610053</td><td>脱水培养基 500 g（粉末）</td></tr><tr><td>无菌棉拭子</td><td>EUTOTUBO</td><td>300200</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>429900</td><td>50 mL，无菌</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>83813360</td><td>无水乙醇</td></tr><tr><td>无菌48孔板</td><td>COSTAR</td><td>3548</td><td>平底带盖，组织培养处理，无热原，聚苯乙烯</td></tr><tr><td>镊子一对</td><td>BRAUN</td><td>24612036</td><td>无齿</td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>VWR</td><td>E404-100TAPBS</td><td></td></tr><tr><td>带连接真空泵的真空烘箱</td><td>JP Selecta, SA</td><td>5900620</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>TELSTAR Technologies, SL</td><td>TELSTAR AH-100</td><td>12.0 W 紫外-C 辐射灯</td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>LABOGENE</td><td>MARS 1200</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>ASTEC CO, LTD</td><td>SCA-165DR</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Biosan</td><td>V-1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Macherey-Nagel, Germany</td><td>Nanocolor UV/VIS II</td><td></td></tr><tr><td>本生灯</td><td>JP Selecta, SA</td><td>7001539</td><td></td></tr><tr><td>酒精灯</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>1658/20</td><td>用于在II级生物安全柜内进行灭菌操作</td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>sartorius stedim</td><td>8864845</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>SELECTA</td><td>3000617</td><td>50/60 Hz</td></tr><tr><td>数显卡尺</td><td>ACHA</td><td>17-260</td><td>0-150 mm</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td>25 mL，无菌</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td>5 mL，无菌</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>VWR</td><td>612-5541</td><td>10 mL，无菌</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>GILSON</td><td>FA10005P</td><td>Pipetman L P200L，塑料 20-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>Pipetman P1000，200-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>微量移液器&amp;nbsp;</td><td>GILSON</td><td>FA10016</td><td>Pipetman L P12X300L，20-300 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-200-960</td><td>2-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-1K0-480</td><td>100-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>预灭菌试管&amp;nbsp;</td><td>INSULAB</td><td>301402</td><td>10 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>照相机</td><td>Canon EOS 5D</td><td></td><td>任何高分辨率相机均可使用</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;革兰氏阳性菌 金黄色葡萄球菌&lt;/em&gt;</td><td></td><td>&amp;nbsp;菌株 V329</td><td>Cucarella 等人，&lt;em&gt;J Bacteriol&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;183 (9)&lt;/strong&gt;，&amp;nbsp; 2888&amp;ndash;2896 (2001)</td></tr><tr><td>革兰氏阴性菌 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;</td><td>Colecci&amp;oacute;n Espa&amp;ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 101</td><td></td></tr><tr><td>酵母菌 &lt;em&gt;白色念珠菌&lt;/em&gt;</td><td>Colecci&amp;oacute;n Espa&amp;ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 1394</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管&amp;nbsp;</td><td>DASLAB</td><td>175508</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>JP Selecta, SA</td><td>4002136</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计比色皿</td><td>UVAT Bio CB</td><td>F-0902-02</td><td>4.5 mL</td></tr><tr><td>Drigalski 涂布棒</td><td>LABBOX</td><td>SPRP-L05-1K0</td><td>无菌，一次性&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃珠（2 mm 直径）</td><td>Hecht Karl</td><td>1401/2</td><td>可高压灭菌，Drigalski 涂布棒的替代工具</td></tr><tr><td>高压灭菌袋</td><td>DELTALAB</td><td>200318</td><td>用于灭菌微生物残留物或污染材料</td></tr><tr><td>电子移液器填充装置</td><td>JetPip</td><td>JET BIOFIL</td><td></td></tr><tr><td>带 ISO 螺纹的实验室瓶，带刻度，硼硅酸盐 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-100-010</td><td>100 mL，用于培养基高压灭菌</td></tr><tr><td>带 ISO 螺纹的实验室瓶，带刻度，硼硅酸盐 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-250-010</td><td>250 mL，用于培养基高压灭菌</td></tr><tr><td>带 ISO 螺纹的实验室瓶，带刻度，硼硅酸盐 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-500-010</td><td>500 mL，用于培养基高压灭菌</td></tr><tr><td>带 ISO 螺纹的实验室瓶，带刻度，硼硅酸盐 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-1K0-010</td><td>1000 mL，用于培养基高压灭菌</td></tr><tr><td>乳胶手套</td><td>DENIA</td><td>2278000000</td><td></td></tr><tr><td>灭菌指示胶带</td><td>LABBOX</td><td>STAP-A55-001</td><td>自粘胶带，内含浸渍纸张，暴露于灭菌过程后变色</td></tr><tr><td>通用试管架</td><td>LABBOX</td><td>MTSP-001-001</td><td>用于放置离心管</td></tr><tr><td>微量离心管架</td><td>VWR</td><td>211-0210</td><td>用于放置微量离心管</td></tr><tr><td>无菌接种环</td><td>ACEFE S.A.</td><td>100140055</td><td>容量 10 &amp;micro;L，用于微生物培养&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>材料 M1</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>材料类型 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>材料 M2</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>材料类型 2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>材料 M3</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>材料类型3</td></tr><tr><td>材料 M4</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>材料类型 4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>材料 C</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>对照材料</td></tr></tbody></table>

用于生物工程应用的先进材料的抗菌性能表征

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

开发具有增强性能的新型先进材料，在广泛的生物工程应用中正变得越来越重要。因此，许多新型生物材料被设计用于模拟组织工程和可控药物递送等生物医学应用所需的特定环境。在生物过程工程领域，目前的研究热点还包括开发具有改进性能的材料，用于细胞或酶的固定化。然而，在这些应用中，材料最理想的特性之一是具备抗菌能力，以避免任何不必要的感染。为此，我们提供了基于以下两种方法的材料抗菌性能表征的简易操作流程：（i）琼脂平板扩散试验（扩散法）和（ii）ISO 22196:2007 标准，用于测定材料表面的抗菌活性（接触法）。本实验方案需采用革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及酵母菌，以涵盖广泛的微生物种类。作为示例，按照该方案对4种不同化学性质的材料分别测试其对Staphylococcus aureus、Escherichia coli和Candida albicans的抗菌效果。测试结果表明，第一种材料无抗菌活性，其余三种材料对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均表现出逐渐增强的抗菌活性。然而，这4种材料均无法抑制Candida albicans的生长。

本方案以4种不同化学性质的材料为例，测试其对3种推荐微生物——Staphylococcus aureus、Escherichia coli和Candida albicans——的抗菌能力。琼脂盘扩散试验（扩散法）结果显示，第一种材料（M1）未表现出抗菌活性，其结果与对照组圆片（C，图像未显示）一致；而其余3种材料M2、M3和M4对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出逐渐增强的抗菌活性（见图2）。
<img alt="抗生素敏感性试验，含有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养皿，生长抑制圈。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：抗菌扩散法结果。 本图展示了四种材料（M1、M2、M3 和 M4）圆片（直径 10 mm，厚度 1 mm）在孵育 24 小时后对S. aureus和E. coli的抗菌扩散试验结果。<a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图3展示了不同示例材料M1、M2、M3和M4对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生的抗菌“晕圈”的不同归一化宽度（nwhalo），该值通过公式(1)计算得出。然而，这4种材料均未能抑制酵母菌Candida albicans的生长（图像未显示）。
<img alt="抗菌活性图，金黄色葡萄球菌与大肠杆菌对比，显示抑菌圈及柱状图比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：抗菌扩散“抑菌圈”结果。 本图显示了每种材料（M1、M2、M3 和 M4）圆片（直径 10 mm，厚度 1 mm）在 24 小时培养后对 S. aureus 和 E. coli 的归一化“抑菌圈”（nwhalo）。差异具有统计学显著性（p &lt;0.01）。然而，样品 M1 未表现出抗菌活性。<a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
接触法的结果也显示第一种材料（M1）无抗菌活性，与对照组圆片（C）结果一致，而其余3种材料对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性逐渐增强（见图4）。
<img alt="在琼脂平板上金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌生长情况；菌落形成比较，实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：抗菌接触法实验结果。 本图展示了依据ISO 22196:2007标准，在37°C培养24小时后，四种材料（M1、M2、M3和M4）表面针对S. aureus和E. coli的抗菌活性检测结果，所用平板直径为90 mm（稀释倍数为10-4）。C表示从对照组圆片中在培养24小时后回收的可存活细菌数量。<a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
细胞活力损失（%）根据本方案中所示的公式（2）和（3）计算得出（见图5）。
<img alt="金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌存活率下降柱状图；抗菌效果比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：通过接触法导致的存活能力丧失。 本图显示了M1、M2、M3和M4材料表面针对S. aureus和E. coli的存活率下降（%）。样品M1未表现出抗菌活性。<a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
然而，这4种材料均无法通过接触法抑制酵母菌Candida albicans的生长（图像未显示）。因此，这4种先进材料中有3种对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌表现出抗菌活性，可能在需要高抗菌性能的多种生物工程应用中具有重要用途。然而，这4种材料均无法抑制酵母菌的生长。

我们提出了一种用于先进材料抗菌性能表征的实验方案。在此，通过两种相互补充的方法测定材料表面的抗菌活性：一种基于琼脂平板扩散试验，另一种则是依据ISO 22196:2007标准的规范程序。

具有增强性能的新型先进材料的开发在广泛的生物工程应用中正变得愈发重要。

该方法有助于解答材料工程领域中的一些关键问题，例如抗菌性能，这在许多生物工程应用中都具有重要价值。该技术可作为各实验室通用的一致性方案，帮助经验较少的研究人员获得准确结果，尤其适用于需要详细逐步操作流程的实验者。我们最初萌生这一方法的想法，源于在查找抗菌实验方案时，发现文献中尚无关于该方法的详细操作步骤。本研究将测试四种具有不同化学性质的先进材料以及一种对照材料的抗菌活性。将每种材料切割成直径为10 mm的圆片以进行制备。随后，将每个样品置于70%乙醇中浸泡10分钟，并对每面进行一小时的紫外线照射，以实现灭菌。将使用三种不同的微生物来测试先进材料的抗菌活性。这些微生物包括革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、革兰氏阴性细菌大肠杆菌（Escherichia coli）以及酵母菌白色念珠菌（Candida albicans）。使用无菌棉签，将每种微生物的数个菌落重新悬浮于装有25 mL胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）的无菌离心管中。涡旋混匀1分钟，确保均匀混合。使用分光光度计测定每种微生物培养物在540 nm处的吸光度。将每种微生物的浓度调整至合适的菌落形成单位（CFU/毫升）。将微生物悬液涡旋振荡5秒以改善微生物分散性，然后将无菌棉签短暂浸入该微生物悬液中。通过将棉签在装有培养物的试管壁上轻轻挤压，去除棉签上多余的液体。用该无菌棉签将每种微生物肉汤悬液均匀涂布于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板表面，沿三个方向划线，使微生物完全覆盖整个平板表面。接种后让平板静置干燥5分钟。将微生物肉汤悬浮液留在实验台上，以备后续检测微生物悬浮液的浓度和纯度。将一对镊子浸入盛有96%乙醇的烧杯中进行消毒，然后用酒精灯火焰灼烧灭菌。使用无菌镊子将待测样品圆片放置在TSA平板的中心。将TSA平板倒置于37°C下孵育24小时。为分析扩散试验结果，使用数显卡尺测量抑菌圈直径和样品圆片直径，或通过拍照并使用合适的图像处理软件进行测量。该步骤对于验证先前测定的微生物浓度是否准确，以及确保无微生物环境污染至关重要。在无菌条件下，使用带有灭菌枪头的微量移液器，将无菌TSB加入无菌微量离心管中。需包含一个用作阴性对照的样本。使用先前用于在TSA平板上划线的微生物肉汤悬浮液进行六次十倍系列稀释。用预先灭菌的Drigalski刮铲，将每种选定稀释液各100 µL涂布于TSA平板上。另取100 µL不含微生物的TSB培养基涂布于TSA平板，作为空白对照。将TSA平板在37摄氏度下孵育24小时。次日，计数菌落数量，以确认每毫升的菌落形成单位（CFU）与先前测定的结果相近。检查阴性对照平板，以确认无微生物环境污染物。 开始实验前，将待测的不同微生物在TSB培养基中接种，并于37摄氏度下在摇床中过夜培养。次日，测定每种过夜培养物在540 nm处的光密度（OD540），然后将每种培养物取适量加入含有20 mL TSB的50 mL预灭菌离心管中，稀释至浓度约为10⁶ CFU/mL。将每种材料类型的四个圆片及四个对照圆片分别放入无菌48孔板的不同孔中。用移液器将150 µL微生物悬液滴加到每个圆盘表面。将培养板置于37°C培养箱中孵育24小时。48孔板孵育24小时后，用移液器向四个样品圆盘和四个对照圆盘的表面各加入850 µL无菌PBS，并与微生物悬液混合均匀。收集48孔板中的每种PBS微生物悬浮液混合物及每枚圆片，转移至15 mL预灭菌离心管中。将PBS微生物悬浮液混合物与圆片涡旋振荡1分钟，随后在50 Hz条件下超声处理5分钟，再涡旋振荡1分钟，以确保无存活微生物仍黏附于材料表面。取超声处理后的菌液与含有TSB的无菌微量离心管进行十倍系列稀释。将每种稀释液各100 µL涂布于TSA平板上，于37°C有氧条件下培养24小时。培养24小时后，计数菌落数量，并以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）表示结果。随后按照文本方案中所述方法分析接触法结果。琼脂扩散试验结果显示，第一种材料无抗菌活性，而其余三种材料对金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）的抗菌活性逐渐增强。该图显示了每种材料圆片在孵育24小时后对金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）的标准化抑菌圈。 接触法的结果也表明，第一种材料无抗菌活性，而其余三种材料对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性逐渐增强。C 是对照组圆盘在 24 小时培养后回收的可存活细菌数量。该图表显示了四种材料表面针对金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）的细菌活性损失百分比。样品M1未表现出抗菌活性。尽管此处未展示，但通过其他方法也发现这四种材料均无法抑制酵母菌白色念珠菌（Candida albicans）的生长。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用这两种互补的方法来测定抗菌活性。

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