用于生物工程应用的先进材料的抗菌性能表征

该方法有助于解答材料工程领域中的一些关键问题，例如抗菌性能，这在许多生物工程应用中都具有重要价值。该技术可作为各实验室通用的一致性方案，帮助经验较少的研究人员获得准确结果，尤其适用于需要详细逐步操作流程的实验者。我们最初萌生这一方法的想法，源于在查找抗菌实验方案时，发现文献中尚无关于该方法的详细操作步骤。

本研究将测试四种具有不同化学性质的先进材料以及一种对照材料的抗菌活性。将每种材料切割成直径为10 mm的圆片以进行制备。随后，将每个样品置于70%乙醇中浸泡10分钟，并对每面进行一小时的紫外线照射，以实现灭菌。

将使用三种不同的微生物来测试先进材料的抗菌活性。这些微生物包括革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、革兰氏阴性细菌大肠杆菌（Escherichia coli）以及酵母菌白色念珠菌（Candida albicans）。使用无菌棉签，将每种微生物的数个菌落重新悬浮于装有25 mL胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）的无菌离心管中。

涡旋混匀1分钟，确保均匀混合。使用分光光度计测定每种微生物培养物在540 nm处的吸光度。将每种微生物的浓度调整至合适的菌落形成单位（CFU/毫升）。

将微生物悬液涡旋振荡5秒以改善微生物分散性，然后将无菌棉签短暂浸入该微生物悬液中。通过将棉签在装有培养物的试管壁上轻轻挤压，去除棉签上多余的液体。用该无菌棉签将每种微生物肉汤悬液均匀涂布于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板表面，沿三个方向划线，使微生物完全覆盖整个平板表面。

接种后让平板静置干燥5分钟。将微生物肉汤悬浮液留在实验台上，以备后续检测微生物悬浮液的浓度和纯度。将一对镊子浸入盛有96%乙醇的烧杯中进行消毒，然后用酒精灯火焰灼烧灭菌。

使用无菌镊子将待测样品圆片放置在TSA平板的中心。将TSA平板倒置于37°C下孵育24小时。为分析扩散试验结果，使用数显卡尺测量抑菌圈直径和样品圆片直径，或通过拍照并使用合适的图像处理软件进行测量。

该步骤对于验证先前测定的微生物浓度是否准确，以及确保无微生物环境污染至关重要。在无菌条件下，使用带有灭菌枪头的微量移液器，将无菌TSB加入无菌微量离心管中。需包含一个用作阴性对照的样本。

使用先前用于在TSA平板上划线的微生物肉汤悬浮液进行六次十倍系列稀释。用预先灭菌的Drigalski刮铲，将每种选定稀释液各100 µL涂布于TSA平板上。另取100 µL不含微生物的TSB培养基涂布于TSA平板，作为空白对照。

将TSA平板在37摄氏度下孵育24小时。次日，计数菌落数量，以确认每毫升的菌落形成单位（CFU）与先前测定的结果相近。检查阴性对照平板，以确认无微生物环境污染物。

开始实验前，将待测的不同微生物在TSB培养基中接种，并于37摄氏度下在摇床中过夜培养。次日，测定每种过夜培养物在540 nm处的光密度（OD540），然后将每种培养物取适量加入含有20 mL TSB的50 mL预灭菌离心管中，稀释至浓度约为10⁶ CFU/mL。将每种材料类型的四个圆片及四个对照圆片分别放入无菌48孔板的不同孔中。

用移液器将150 µL微生物悬液滴加到每个圆盘表面。将培养板置于37°C培养箱中孵育24小时。48孔板孵育24小时后，用移液器向四个样品圆盘和四个对照圆盘的表面各加入850 µL无菌PBS，并与微生物悬液混合均匀。

收集48孔板中的每种PBS微生物悬浮液混合物及每枚圆片，转移至15 mL预灭菌离心管中。将PBS微生物悬浮液混合物与圆片涡旋振荡1分钟，随后在50 Hz条件下超声处理5分钟，再涡旋振荡1分钟，以确保无存活微生物仍黏附于材料表面。

取超声处理后的菌液与含有TSB的无菌微量离心管进行十倍系列稀释。将每种稀释液各100 µL涂布于TSA平板上，于37°C有氧条件下培养24小时。培养24小时后，计数菌落数量，并以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）表示结果。

随后按照文本方案中所述方法分析接触法结果。琼脂扩散试验结果显示，第一种材料无抗菌活性，而其余三种材料对金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）的抗菌活性逐渐增强。该图显示了每种材料圆片在孵育24小时后对金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）的标准化抑菌圈。

接触法的结果也表明，第一种材料无抗菌活性，而其余三种材料对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性逐渐增强。C 是对照组圆盘在 24 小时培养后回收的可存活细菌数量。该图表显示了四种材料表面针对金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）的细菌活性损失百分比。

样品M1未表现出抗菌活性。尽管此处未展示，但通过其他方法也发现这四种材料均无法抑制酵母菌白色念珠菌（Candida albicans）的生长。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用这两种互补的方法来测定抗菌活性。