利用二溴马来酰亚胺-二硫键化学法制备偶联诱导荧光的聚乙二醇化病毒样颗粒
2018年5月27日
本文介绍了一种利用二溴马来酰亚胺对Qβ病毒样颗粒（VLP）上的二硫键进行荧光功能化的实验方法。我们描述了Qβ的表达与纯化过程、二溴马来酰亚胺功能化分子的合成，以及二溴马来酰亚胺与Qβ之间的偶联反应。所得到的黄色荧光偶联颗粒可作为细胞内的荧光探针使用。
本生物偶联方法的总体目标是对含二硫键的病毒样颗粒进行荧光功能化修饰。该方法有助于解答针对可修饰氨基酸残基数量有限的病毒样颗粒在生物偶联反应中的关键问题。该技术的主要优势在于，仅通过一步反应即可同时引入新的功能基团并形成偶联诱导的荧光团。除了Q-Beta之外，我们认为该反应还可适用于任何含有二硫键的病毒样颗粒。
在开始表达Q-Beta噬菌体的实验操作之前，使用1:1的次氯酸钠-乙醇溶液擦拭实验台面。在无菌环境下，将E.coli BL21的单菌落分别接种至SOB培养基中，制备两份3毫升的预培养液。将培养液置于37摄氏度、相对湿度0%的环境中，在250 rpm转速下振荡培养过夜。次日，从摇床中取出两份3毫升的预培养液，在无菌条件下将每份预培养液分别转移至含有1升新鲜SOB培养基的2升挡板锥形瓶中。将两瓶接种后的培养基置于37摄氏度、相对湿度0%的环境中，在250 rpm转速下继续振荡培养。培养细菌至其在600纳米处的光密度（OD 600）达到0.9至1.0，通常需要约5小时。当培养液达到目标OD 600值时，使用P1000移液器向每个锥形瓶中加入1毫升1摩尔的IPTG以诱导蛋白表达。将锥形瓶继续留在温控室内的摇床上振荡培养过夜。
次日早晨，从摇床中取出锥形瓶，将每个瓶中的内容物转移至一个一升的瓶子中，在4°C条件下以20,621 ×g离心一小时，以收集细胞。离心完成后，通过倾倒去除上清液，并将上清液倒入含有约五毫升次氯酸钠的锥形瓶中，以灭活细菌。
为收集细胞沉淀，使用刮勺将离心管底部的细胞沉淀刮下，并转移至50毫升离心管中。
开始Q-Beta纯化操作时，用20至30毫升0.1摩尔磷酸钾缓冲液（pH 7）重悬每个细胞沉淀。确保重悬液中无团块。根据制造商说明书，使用微流化处理器裂解细胞。至少裂解两次以提高颗粒的得率。将裂解液转移至250毫升离心管中，在4°C、20,621 × g条件下离心1小时。测量上清液体积（单位为毫升）。将该数值乘以0.265，然后向上清液中加入相应克数的硫酸铵。加入搅拌子，在4°C下以200 rpm在搅拌器上搅拌至少1小时，使蛋白沉淀。在250毫升离心管中于4°C、20,621 × g条件下离心1小时。弃去上清液，用约40毫升0.1摩尔磷酸钾缓冲液（pH 7）重悬沉淀。向粗样品中加入等体积的1:1氯仿:正丁醇溶液，涡旋混合数秒。将混合液转移至38毫升离心管中，在4°C、20,621 × g条件下离心30分钟。用移液器小心吸取上层水相，注意避免吸取水相与有机相之间形成的凝胶样中间层。
接下来，解冻65%至40%的预制蔗糖梯度溶液。将约两毫升提取物加到每个梯度中。
在4°C条件下，以99,582 ×g离心16小时，采用自由减速模式。超速离心完成后，将发光二极管光源置于每根离心管下方照射，确认可见蓝色条带。使用长针头注射器回收这些颗粒。在4°C条件下，以370,541 ×g再次超速离心2.5小时，获得颗粒沉淀。纯化后的颗粒沉淀应呈透明状。弃去上清液，用0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH 7）重新悬浮沉淀。
该示意图展示了将要演示的偶联过程。使用相对于1毫克Q-Beta中二硫键的10当量的三(2-羧乙基)膦（Tris(2-carboxyethyl)phosphine）或TCEP，在室温下反应一小时，将所有二硫键还原，从而生成还原型Q-Beta衣壳。在对Q-Beta上的二硫键进行还原前，应 freshly 配制TCEP溶液。
将0.002克TCEP溶解于1毫升超纯水中，配制成100X储存液。取200微升浓度为5毫克/毫升的Q-Beta加入微量离心管中。然后向该微量离心管中加入20微升100X TCEP储存液。室温孵育1小时。
同时，配制用于后续重新连接还原性二硫键的二溴马来酰亚胺聚乙二醇（DB-PEG）溶液。将 0.0017 克 DB-PEG 溶解于 100 微升二甲基甲酰胺中。加入 680 微升 10 毫摩尔磷酸钠溶液（pH 5）。接着，将还原后的 Q-Beta 加入 DB-PEG 溶液中，并在手持式 365 纳米紫外灯下观察混合过程。混合后应立即观察到明亮的黄色荧光。将反应液置于室温下，于旋转仪中过夜反应。
次日早晨，使用1× PBS在4°C、3,283 × g条件下通过离心滤器纯化反应混合物，离心时间为20分钟。最后，通过非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和天然琼脂糖凝胶电泳监测偶联反应。
通过非还原性 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳在紫外光和考马斯亮蓝染色下证实了 DB-PEG 在 Q-Beta 上的偶联。所有荧光条带均与考马斯亮蓝染色条带共定位，表明偶联成功。通过天然琼脂糖凝胶电泳和透射电子显微镜确认了 Q-Beta-PEG 偶联物的完整性。
上方的显微图像显示 Q-Beta-maleimide 或 Q-Beta-M，下方的显微图像显示 Q-Beta-PEG。在 0.1 摩尔的磷酸钾缓冲液中，Q-Beta-M 和 Q-Beta-PEG 的荧光光谱显示其激发最大值约为 400 纳米，发射最大值约为 540 至 550 纳米。当将 Q-Beta-PEG 在无血清 DMEM 培养基中与小鼠巨噬细胞共同孵育，随后进行核染色时，共定位图像显示黄色荧光颗粒被细胞摄取，并可在孵育四小时后进行追踪。
相比之下，未修饰的Q-Beta病毒样颗粒显示出可忽略不计的荧光。
本方案可帮助研究人员在四天内纯化Q-Beta，并进行过夜的再交联偶联反应。在实施该操作时，需注意偶联反应在酸性条件（如pH 5）下效果最佳。
观看本视频后，您应充分了解如何纯化Q-Beta病毒样颗粒（VLP），并利用二溴马来酰亚胺类化合物重新桥接其二硫键，从而制备荧光标记的VLP。该技术建立后，为研究人员提供了一种额外的功能化手段，可用于对Q-Beta噬菌体外表面进行双重功能化修饰。
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概述
本文介绍了一种生物偶联方法，用于对含二硫键的病毒样颗粒（特别是Qβ VLPs）进行荧光功能化修饰。该技术可在单一反应中引入新的功能基团，并形成偶联诱导的荧光团。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物偶联
- 病毒样颗粒
- 荧光标记
背景
- 病毒样颗粒中的二硫键限制了功能化修饰的选择。
- 荧光探针对于细胞研究至关重要。
- Qβ噬菌体是本方法的模型体系。
- 无菌操作技术对实验成功至关重要。
研究目的
- 开发一种在Qβ病毒样颗粒上对二硫键进行功能化修饰的方法。
- 实现对病毒样颗粒中生物偶联反应的研究。
- 构建用于细胞应用的荧光探针。
使用的方法
- Qβ噬菌体的表达与纯化。
- 二溴马来酰亚胺功能化分子的合成。
- 二溴马来酰亚胺与Qβ的偶联反应。
- 起始培养物制备过程中无菌技术的应用。
主要结果
- 成功实现Qβ病毒样颗粒的荧光功能化。
- 形成黄色荧光共轭颗粒。
- 该方法有望应用于其他病毒样颗粒。
- 展示了单步反应引入多种功能基团的可行性。
结论
- 该方法可有效对含二硫键的病毒样颗粒进行荧光标记。
- 该技术可促进病毒学中生物偶联的研究。
- 未来应用可扩展至多种含有二硫键的病毒样颗粒。
常见问题
行业重要性概述
该方法通过一步反应在富含二硫键的病毒样颗粒（VLP）上引入合成配体并产生内在荧光，实现病毒样颗粒的双重功能化，解决了此类颗粒生物偶联手段有限的问题。所获得的荧光探针可用于细胞摄取研究及体外实时追踪，有助于靶点验证和检测方法开发流程的优化。该技术拓展了VLP化学修饰工具箱，提高了早期发现阶段的预测可信度，并减少了载荷递送机制研究中的不确定性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在病毒样颗粒（VLPs）表面暴露的二硫键上进行位点特异性功能化，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：在一个反应中同时实现配体连接与荧光团生成，简化了用于靶点结合研究的探针合成流程。
- 预测价值：生成可追踪的荧光病毒样颗粒（VLPs），支持细胞内化实验及生物分布建模。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：可制备标准化的荧光标记病毒样颗粒（VLP）批次，适用于高内涵筛选和结合实验。
- 操作价值：使用市售滤光片组（激发波长约400 nm，发射波长540–550 nm），无需定制仪器即可实现便捷检测。
- 可扩展性：支持制备探针文库，用于配体-受体相互作用中的构效关系研究。
转化与临床前研究
- 转化连续性： 荧光病毒样颗粒（VLP）在巨噬细胞模型中表现出细胞摄取能力，支持其生物分布和药代动力学特征分析。
- 降低风险： 可在开展体内研究之前，评估表面修饰对VLP稳定性及免疫识别的影响。
- 生物标志物匹配： 在共定位成像工作流程中，有助于将VLP的定位与细胞标志物进行关联分析。
流程与工作流整合
该方法适用于从病毒样颗粒（VLP）制备到先导化合物鉴定的整个发现流程，可快速生成功能化探针，用于后续筛选及机制研究。
- 发现生物学：通过在病毒样颗粒（VLP）上同时修饰示踪和治疗功能基团，支持假设验证。
- 筛选：生成标准化的荧光标记VLP，用于定量结合与内化实验。
- 分析：提供基于荧光的检测信号，用于量化VLP-细胞相互作用及偶联效率。
- 转化研究：通过已证实的巨噬细胞摄取和稳定性评估，衔接临床前研究。
- 企业级复用：建立一种模块化VLP功能化平台，可适用于多种含二硫键的系统。
运营与企业影响
- 科学价值：通过提供可精确控制且可追踪的病毒样颗粒探针，用于作用机制研究，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：在明确的酸性条件（pH 5）下标准化偶联过程，确保不同批次间的可重复性。
- 战略价值：减少对独立标记和纯化步骤的需求，提高探针开发中的资本利用效率。
- 项目组合影响：通过提供基于病毒样颗粒构建体的早期功能数据，支持经风险调整后的项目推进。
实施注意事项
- 需要具备蛋白质表达、纯化以及含二硫键蛋白质的厌氧操作方面的专业知识。
- 需要配备微流化器、超速离心机以及带有合适滤光片组的荧光检测系统。
- 细胞应用时需掌握无菌操作技术并注意内毒素污染问题。
- 当拓展至具有不同二硫键可及性或表面电荷的病毒样颗粒（VLPs）时，可能需要进行优化。
- 实际限制：效率依赖于在二硫键重桥接过程中维持还原条件，并避免氧化降解。
