果蝇分子和免疫组化分析制备周围嗅组织的研制

对果蝇物种中发育中的瞳孔和成人外围嗅觉组织进行分期和解剖的总体目标是为外周嗅觉组织的分子和发育分析生成样本。该方法可以帮助回答嗅觉系统发育和进化领域的关键问题，例如发育中的外周嗅觉组织中特定基因的表达、动力学水平和模式。通过这种方法，我们可以深入了解果蝇物种发育中的外周嗅觉系统。

它也可以应用于其他感觉系统，例如外围味觉和视觉系统。对于 RNA 测序实验，计划收集 100 到 200 个触角盘或天线，用于四个不同的发育阶段。对于免疫组织化学，计划解剖 10 到 20 只果蝇。

使用 70% 乙醇清洁解剖所涉及的所有材料。然后，使用 RNase 中和剂进一步清洁材料。并使用无核酸酶或 DEPC 处理过的水制备所有溶液。

要收集蛹，请每隔 30 分钟监测一次幼虫。并在零时 APF 准备阶段收集蛹。幼虫将是不动的，并被一个非常轻的、几乎是白色的蛹壳包围。

在这个阶段，用湿滤纸将幼虫转移到一个两英寸的小培养皿中。对于零小时 APF 阶段解剖，立即着手收获前触角盘。否则，用石蜡膜覆盖培养皿，让动物在 25 摄氏度下发育，直到它们处于感兴趣的发育阶段。

为了分阶段其他果蝇物种的蛹发育，收集零小时准备幼虫并将它们分类到新鲜的小瓶中。然后记录从预备蛹到成年的天数。只需将此时间缩放到黑腹果蝇的时间线即可。

首先，将 150 μL RNA 分离溶液冷却在不含 RNase 的 1.5 mm 试管中。接下来，将几个单独的 PBS 液滴沉积在解剖垫上。在每滴 PBS 中，放入一个要解剖的蛹。

对于零到两个小时的蛹，用镊子抓住口钩并拉动这些结构以撕出并露出大脑和想象中的椎间盘。对于八小时的蛹，首先从蛹的最前四分之一轻轻剥下蛹壳，露出发育中的头部。然后在颈部关节处拆下头部。

在这个发育阶段，触角盘在头部。现在将含有触角盘的组织转移到另一个 PBS 液滴中。接下来，识别在视叶处连接到大脑的眼触角盘。

使用镊子断开眼触角盘并将其转移到新的液滴上。在八小时的蛹中，眼盘罩住触角盘，两者都在大脑的前方。在下一个液滴中，使用镊子将眼睛和触角盘分开。

然后使用 P20 移液器吸头，用最少量的液体轻轻收集解剖的组织。将圆盘放入 RNA 分离溶液试剂中，并继续解剖触角盘，直到收集到至少 100 个。到蛹形成后 40 小时，成虫触角已经形成最终形状，但仍然是透明的。

在这个阶段，RNA 序列收集至少需要 50 个准备蛹。首先准备 150 μL 冷冻 RNA 分离溶液。在解剖垫上，将蛹放入 PBS 液滴中。

然后用一对镊子稳定身体，从最前四分之一轻轻剥下蛹壳，露出头部。然后，小心地取下颈部关节处的头部。现在轻轻地将头部转移到干净的 PBS 液滴中。

要去除头部周围的膜，请在 PBS 中上下移液头部。通过这种清洁，天线应该变得可见。现在断开天线与节段关节处第二段和第三段之间的膜的连接。

第三段包含触角嗅觉受体。然后用移液管轻轻地将解剖的组织转移到 RNA 分离溶液中，以尽量减少转移的液体量。对于 RNA 提取，在 CO2 垫上麻醉时解剖成虫。

首先，用 RNase 抑制剂处理 CO2 垫和镊子。然后麻醉成虫并在解剖显微镜下观察垫。使用两对镊子稳定身体，轻轻地从第二触角段拉出或捏出第三触角段以收集组织。

通过将镊子浸入液体中并释放，将触角转移到一管 RNA 分离溶液中。天线必须浸没在水中。如果天线卡在侧壁上，RNA 会过早降解。

收集足够的触角后，继续进行 RNA 提取。或者将收集管无限期地存放在 80 摄氏度。如果天线用于免疫组织化学，请在解剖垫上进行解剖，将果蝇浸没在 PBS 中，有或没有 Triton。

解剖的发育嗅觉组织可用于 RNA 提取，然后进行 RT-PCR 以评估基因表达。例如，可以通过这种方式研究表面受体转录本和嗅觉受体转录本的表达。或者，组织可用于免疫组织化学以确定目标基因的表达模式和亚细胞定位。

例如，Rn-EGFP 转基因果蝇可以用抗 GFP 和抗层粘连蛋白抗体染色。分析表明，在蛹形成后 40 小时，Or67d 基因在天线中的特定细胞中活跃，在 GAL4-UAS 系统下驱动 GFP 的表达。一旦掌握，如果作得当，可以在一小时内完成解剖。

在尝试此程序时，重要的是要记住根据每种果蝇物种的蛹发育时间框架，保持时间并适当安排采摘、老化和解剖。在此程序之后，可以执行其他方法，如 qRT-PCR、免疫组织化学以及其他体内染色和转录分析技术，以回答有关发育组织内系统水平转录模式和谱的其他问题。开发完成后，这项技术将为感觉系统进化和发育领域的研究人员铺平道路，以探索果蝇物种其他感觉系统中的转录动力学和新基因发现。

不要忘记，使用锋利的镊子、一些 RNA 提取溶液和甲醛可能非常危险。在执行此程序时，应始终采取预防措施，例如先前的解剖练习，以发展精细运动技能、高度注意力和穿着适当的实验室服装。