小鼠原发性肾管上皮细胞的分离、鉴定及高通量的细胞外流量分析
2018年6月20日
该协议提供了一种经济高效的方法, 以分离和表征小鼠原发性肾管细胞, 随后可以进行亚培养, 以评估肾脏生物学功能, 包括线粒体生物能学。
这种方法可以帮助回答有关肾脏代谢的关键问题，例如脂肪酸氧化，这与肾纤维化和各种其他肾病的发展密切相关。该技术的主要优点是使用高通量平台筛选调节肾小管上皮细胞中线粒体生物能量学的化合物。该技术的意义延伸到肾脏代谢疾病的治疗，因为它允许对调节肾上皮细胞中线粒体代谢的化合物进行高吞吐量筛选。
要制备胶原蛋白包被的 60 毫米培养皿，请向每个培养皿中加入 2 毫升预过滤的 20 毫摩尔乙酸，然后加入 35 微升胶原蛋白 I 溶液。然后，将板在室温下孵育一小时，风干，并将其暴露在紫外线下。接下来，使用 PBS 冲洗掉乙酸残留物。进行 3 次冲洗。
然后，将培养皿储存在 37 摄氏度的无二氧化碳细胞培养箱中。准备好小鼠进行手术后，使用脱毛膏去除胸部和腹部的毛皮。然后，用碘对皮肤进行消毒，并擦去碘残留物。
接下来，切开腹腔，露出心脏和肾脏。现在，以每分钟 32 毫升的速度设置灌注泵，并在开始灌注之前去除管道中的任何气泡。在线路末端使用 27 号针头。
要继续，将针头通过心尖插入左心室。一旦缓冲液充满心脏，就在右心房戳一个洞，为灌注缓冲液创造一个出口。接下来，切换到消化缓冲液，将泵速略微降低至每分钟 30 毫升进行消化。
灌注 20 mL 消化缓冲液后，取出两个肾脏以进行肾小管细胞分离。要处理收获的肾脏，首先，去除肾包膜和髓质。然后，将两个肾脏切成小块，在 37 摄氏度的烤箱中放入 10 毫升消化缓冲液中孵育 5 分钟。
消化后，将缓冲液通过 70 微米过滤器，去除任何未消化的组织。收集消化的组织后，加入 10 毫升培养基以停止消化。接下来，将过滤后的组织悬液以 50 g 离心 5 分钟，以沉淀肾小管细胞。
然后，将上清液转移到新试管中，加入 5 毫升培养基，并重复离心以收集任何剩余的肾小管细胞。现在，将第一个沉淀重悬于 20 mL 培养基中，并以 50 g 离心 5 分钟，以进一步纯化收集的细胞。处理上清液。
然后，将两个沉淀重悬于 10 mL 培养基中。接下来，使用台盼蓝染色对活细胞进行计数。然后，将多达 1000 万个细胞接种到 60 毫米的胶原蛋白包被培养皿上，让肾小管细胞附着过夜。
首先，将 40， 000 个细胞的 P1 肾小管细胞接种到新鲜制备的涂有胶原蛋白的 96 孔微孔板的孔中。每孔使用 100 微升培养基。细胞外通量测定中细胞密度和化合物浓度的优化是实验成功的关键。
我们建议进行中试滴定实验，以确定最佳细胞密度和化合物浓度。接下来，水合传感器探针板。首先，提起传感器探针板，用 200 μL 校准溶液填充板的每个孔。
然后，重新定位探针板以浸没传感器，并在 37 摄氏度下孵育组件过夜。第二天，吸出旧培养基，并用 175 μL 的葡萄糖或脂肪酸检测培养基替换。然后，在没有二氧化碳的情况下继续孵育一小时。
在细胞孵育过程中，用 25 μL 寡霉素加载小柱的端口 A，用 FCCP 加载端口 B，用鱼藤酮/抗霉素 A 加载端口 C，用水加载端口 D 和所有其他端口。现在，将小柱存放在无二氧化碳的培养箱中，直到设置准备好进行校准。继续打开细胞外通量分析仪和控制器。
接下来，打开 Analyzer 软件，选择标准分析，然后按 Assay Wizard（分析向导）选项。然后，在 Compounds 选项卡下，将化合物分配给相应的端口。在 Background Correction 选项卡下，选择不包含单元格的井。
接下来，使用 Groups and Labels 选项卡标记实验组。然后，在 Protocol（实验方案）选项卡下，使用可用命令设置适当的混合和测量周期。这些设置在文本协议中指示，输入后，请保存模板以备将来使用。
现在，按 结束向导 继续。现在，按 Start 开始校准。然后，分析仪弹出板支架并提示插入小柱板。
此校准过程需要 20 到 25 分钟才能完成。校准系统后，按提示命令将校准板更换为细胞板，然后继续运行。运行完成后，保存 OCR 数据，并从分析仪中取出板。
现在，将 Hoechst 添加到每个检测孔中，并在 37 摄氏度下孵育板 5 分钟。然后，使用 355 纳米激发和 460 纳米发射对细胞进行计数，并将 OCR 数据标准化为细胞计数。在该方案中，将异质性的肾细胞群、未完全消化的小管和其他组织碎片培养在胶原包被的平板上。
分离后第二天，离心培养基以去除碎片，并重新接种管状细胞。随后，细胞更容易附着，到培养第 5 天时，它们达到 80% 至 90% 的汇合度。然后将肾脏 TECs 传代培养并在一周内生长至汇合。
在接下来的两个段落中也发生了类似的增长。单层细胞形成圆顶，从板上掀起并通过紧密连接保持附着。使用描述的不同电镀密度下 OCR 的描述细胞外通量分析来测量分离的初级 TECs 的线粒体呼吸。
以更高密度铺板的细胞的 OCR 成比例增加。每孔 40， 000 个细胞比任何其他铺板密度更好地覆盖板表面，因此使其成为测试细胞和化合物之间相互作用的最佳浓度。例如，将含有脂肪酸底物的培养基与糖酵解抑制剂 2DG 一起应用于 TEC 上，以直接评估 TEC 在第 1 代和第 2 代的脂肪酸氧化。
在尝试此过程时，请务必始终记录每个孔中的确切体积和浓度。组分最终浓度的改变会导致整个实验失败。该技术发展后，将为肾病学领域的研究人员探索肾小管脂肪酸代谢在各种肾病发病机制中的作用铺平道路。
概述
该协议提供了一种经济有效的方法来分离和表征小鼠原代肾小管细胞，这些细胞随后可以被亚培养以评估体外肾生物功能，包括线粒体生物能学。
关键研究组成部分
科学领域
- 肾脏学
- 细胞生物学
- 代谢研究
背景
- 该方法解决了有关肾脏代谢的关键问题。
- 它关注与肾纤维化和肾病相关的脂肪酸氧化。
- 该技术允许高通量筛选化合物。
- 它对于肾脏代谢疾病的治疗具有重要意义。
研究目的
- 分离和表征肾小管细胞。
- 评估这些细胞中的线粒体生物能学。
- 使得可以对影响肾脏代谢的化合物进行高通量筛选。
使用的方法
- 为细胞培养准备胶原蛋白涂层的培养皿。
- 手术分离小鼠肾脏以提取肾小管细胞。
- 使用消化缓冲液和离心来纯化细胞。
- 进行细胞外通量分析以评估线粒体功能。
主要结果
- 成功分离和培养了肾小管细胞。
- 细胞在五天内达到80-90%的融合度。
- 实现了线粒体代谢化合物的高通量筛选。
- 该协议允许在肾细胞研究中获得可重复的结果。
结论
- 该协议有效用于研究肾小管细胞功能。
- 它提供了对肾脏代谢和潜在治疗的见解。
- 高通量能力提高了研究效率。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput extracellular flux analysis of primary mouse renal tubular epithelial cells enables robust interrogation of mitochondrial bioenergetics, a critical determinant in renal disease pathogenesis. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for metabolic pathways implicated in chronic kidney disease. The protocol's scalability and reproducibility position it as a foundational capability for renal metabolism-focused drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of mitochondrial function in disease-relevant renal cell populations.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying fatty acid oxidation and metabolic flux.
- Facilitates functional target validation for pathways linked to renal fibrosis and nephropathies.
- Provides predictive confidence for advancing metabolic targets in renal disease pipelines.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput screening of compounds affecting mitochondrial bioenergetics.
- Optimizes assay conditions for cell density and compound concentration, ensuring reproducibility.
- Generates quantitative outputs (OCR) for reliable compound evaluation and comparison.
- Enables platform reuse for iterative screening and lead optimization cycles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ex vivo metabolic readouts with disease-relevant renal cell models.
- Supports translational biomarker development by linking mitochondrial function to renal pathology.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of metabolic interventions.
- Reduces biological risk by enabling functional assessment prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification, supporting both target validation and compound screening in renal metabolism research.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial respiration and fatty acid oxidation to clarify metabolic pathway involvement in renal disease.
- Screening: Provides high-throughput, reproducible assay conditions for compound evaluation in primary renal cells.
- Analytics: Delivers normalized OCR measurements for robust statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Bridges ex vivo metabolic findings to preclinical models of chronic kidney disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for ongoing renal metabolism research and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metabolic target selection and validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in renal cell-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in renal drug discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic targets and compounds for renal indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and mitochondrial functional assays.
- Needs access to high-throughput extracellular flux analyzers and compatible software.
- Demands rigorous standardization of cell density and compound concentrations for reproducibility.
- Adaptation may be needed for other species or renal cell subtypes.
- Careful tracking of assay variables is essential to avoid experimental failure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Preparing Collagen I Plates
1:31
Perfusion, Digestion and Harvesting Kidneys from Mice
2:36
Tissue Processing and Primary Tubular Cells Isolation
4:11
Mitochondria Bioenergetics Assay
7:26
Results: Renal Tubular Epithelial Cell (TEC) Morphology and Metabolism
9:04
Conclusion
