Name: 小鼠原发性肾管上皮细胞的分离、鉴定及高通量的细胞外流量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学习从小鼠肾脏分离原代肾小管上皮细胞的方法，用于高通量细胞外流量分析。该技术可评估线粒体生物能量学，为研究肾脏代谢疾病和筛选治疗化合物提供可重复的实验平台。

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本工作获得了以下资助：Lina A. Shehadeh 获美国国立卫生研究院（R56HL132209&#160;和 1R01HL140468）以及迈阿密心脏研究所的资助。

所有涉及动物的实验均经迈阿密大学机构动物护理和使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）指南。
1. 包被板和试剂的准备
<ol>
	<li>准备胶原蛋白包被：
	<ol>
		<li>将35 μL I型胶原蛋白加入到2 mL预过滤的20 mM乙酸溶液中，覆盖一个60-mm培养皿。室温孵育1小时，风干后进行紫外照射。</li>
		<li>用PBS洗涤包被表面3次以去除任何酸残留，并将其保存在37 °C、无CO2的细胞培养孵箱中，直至细胞准备接种。最终胶原蛋白包被浓度为5 μg/cm2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备灌注缓冲液：将300 μL青霉素-链霉素（P/S）加入30 mL PBS中，并在37 °C水浴中预热，直至开始分离操作。</li>
	<li>准备消化缓冲液：将3.9 mg II型胶原酶溶解于30 mL PBS中，使用0.2-μm瓶顶滤器过滤溶液，并在37 °C水浴中预热，直至开始分离操作。</li>
	<li>准备细胞培养基：
	<ol>
		<li>将补充剂恢复至室温。无需过滤，将补充剂（0.05 mL胎牛血清、10 ng/mL表皮生长因子、5 μg/mL胰岛素、0.5 μg/mL肾上腺素、36 ng/mL氢化可的松、5 μg/mL转铁蛋白和4 pg/mL三碘甲腺原氨酸）加入500 mL肾上皮细胞生长基础培养基2中。</li>
		<li>将培养基在37 °C水浴中预热，直至准备使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备化合物：分别用DMSO配制50 mM FCCP、10 mM鱼藤酮、10 mM寡霉素、10 mM抗霉素A、50 mM L-肉碱和50 mM依托莫司的储备液，分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>在220 mL 150 mM NaCl溶液中配制2.5 mM棕榈酸钠溶液，并在75 °C水浴中加热至棕榈酸完全溶解。</li>
	<li>准备牛血清白蛋白（BSA）：在250 mL 150 mM NaCl溶液中配制0.34 mM无脂肪BSA。对照BSA作为棕榈酸-BSA溶液的阴性对照，可通过步骤1.8的方法制备。</li>
	<li>将棕榈酸与BSA偶联（Palm-BSA）：
	<ol>
		<li>在BSA溶液仍处于高温状态时，逐步加入棕榈酸溶液。然后调节pH至7.4，并在37 °C混合至少1小时以完成偶联反应。</li>
		<li>偶联完成后，向溶液中再加入150 mL 150 mM NaCl，充分混匀后分装并保存于-20 °C。最终溶液含1 mM棕榈酸钠和0.17 mM BSA，将作为脂肪酸底物用于基于脂肪酸的细胞外通量分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备细胞外通量分析基础培养基：
	<ol>
		<li>将1袋DMEM粉末和20 mL 200 mM L-谷氨酰胺（终浓度4 mM）加入1 L高压灭菌的dH2O中，轻轻混匀。</li>
		<li>在生物能量学实验当天，向已配制的基础培养基中加入100 µM丙酮酸钠，用于后续制备葡萄糖或脂肪酸为基础的细胞外通量分析培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备葡萄糖为基础的培养基：
	<ol>
		<li>为通过糖酵解测定细胞呼吸能力，向上述步骤1.9所述的基础培养基中加入17.5 mM葡萄糖粉末、100 µM对照BSA（如步骤1.7所述）和20 µM依托莫司（以抑制脂肪酸氧化）。</li>
		<li>将培养基在37 °C预热，调节pH至7.4，并保持在37 °C水浴中，直至用于细胞外通量分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备脂肪酸为基础的培养基：
	<ol>
		<li>为通过脂肪酸氧化测定细胞呼吸能力，向上述步骤1.9所述的基础培养基中加入10 mM 2D-葡萄糖粉末（抑制糖酵解的葡萄糖类似物）、100 µM Palm-BSA（如步骤1.8所述）和100 µM L-肉碱。</li>
		<li>将培养基在37 °C预热，调节pH至7.4，并保持在37 °C水浴中，直至用于细胞外通量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠肾脏的灌注、消化与收获
<ol>
	<li>使用异氟烷气流麻醉小鼠，并将其固定于仰卧位。确保仅在动物失去翻正反射后开始分离操作，并在操作前和操作过程中使用无创镊子通过夹捏评估来监测麻醉深度22。</li>
	<li>使用脱毛膏去除小鼠胸部至腹部区域的毛发，用碘液消毒，并擦去残留的碘液。</li>
	<li>在胸部做切口，切开皮肤以暴露整个腹部区域，并显露心脏和肾脏。</li>
	<li>将灌注泵设置为32 mL/min，在开始灌注前排除管路中的所有气泡。</li>
	<li>当灌注液充满心脏后，立即通过心尖将27号针头插入左心室，同时刺穿右心房以形成出口，使灌注液随心脏泵动循环并最终从右心房出口流出。</li>
	<li>灌注结束后，将泵速调至30 mL/min进行消化。</li>
	<li>当20 mL消化缓冲液经心尖灌注后，取出双侧肾脏用于肾小管细胞的分离。</li>
</ol>
3. 组织处理与原代肾小管细胞的分离
<ol>
	<li>去除肾包膜和髓质，将两个肾脏切成微小碎片，放入10 mL消化缓冲液中，在37 °C培养箱中轻轻旋转孵育5分钟。</li>
	<li>将缓冲液通过70-μm滤膜以去除未消化的肾组织。加入10 mL培养基以终止消化反应。</li>
	<li>为收集肾小管细胞，将过滤后的细胞悬液在50 × g条件下离心5分钟，收集第一个沉淀。将上清液转移至新管中，加入5 mL培养基，再次在50 × g条件下离心5分钟，以确保所有肾小管细胞均收集到第二个沉淀中。 
	此离心步骤采用较低转速，主要使较重的小管沉淀。之后，当细胞从分离过程中恢复后，在传代培养期间，纯化的肾小管培养物将以较高转速进行离心。</li>
	<li>将第一个沉淀重悬于20 mL培养基中，并在50 × g条件下离心5分钟，收集第三个沉淀。</li>
	<li>将第二个和第三个沉淀重悬于1 mL培养基中。取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，将混合液加入计数载玻片的A室中，从自动细胞计数仪记录细胞活力（参见材料表）。</li>
	<li>将最多107个细胞（异质性细胞群体）接种至预先用胶原蛋白包被的单个60-mm培养皿中，过夜培养以使肾小管细胞贴壁。</li>
</ol>
4. 原代小管细胞的传代培养与鉴定
<ol>
	<li>分离后的第1天，收集培养基，以50 × g离心5分钟，使任何漂浮的小管沉淀。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于4 mL新鲜培养基中，并重新接种回同一培养皿中。</li>
	<li>分离后的第4天，弃去旧培养基，加入新鲜培养基。</li>
	<li>分离后的第7天，将细胞在37 °C下用2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育5分钟以解离细胞。加入3 mL培养基终止反应，并以250 × g离心5分钟收集细胞。</li>
	<li>为从P0代传代并鉴定细胞至P1代，将每孔5,000个细胞接种至经I型胶原包被的24孔板中，包被方法如上所述。</li>
	<li>步骤4.4后的24小时，用4%多聚甲醛（PFA）固定P1代细胞10分钟，用0.2% Triton X-100透化3分钟，并用10%驴血清（DS）在室温下封闭1小时。</li>
	<li>将以下蛋白在10%驴血清（DS）中按1:100稀释：近端小管标志物血管紧张素原（AGT）和水通道蛋白1（AQP1）；远端小管标志物E-钙黏蛋白；系膜细胞标志物CD90/Thy1；以及巨噬细胞标志物含EGF样结构域黏蛋白样激素受体样1（F4/80）和分化簇68（CD68），并与细胞在4 °C下孵育过夜。</li>
	<li>次日，使用1:200的抗兔、抗小鼠或抗大鼠荧光二抗孵育45分钟以检测染色情况。在共聚焦显微镜下成像，确认标志物的表达，如图2A所示。</li>
	<li>P1代传代后的第3天，通过步骤4.5中所述的小管、系膜和巨噬细胞标志物染色，对细胞进行P2代传代及鉴定。在共聚焦显微镜下观察染色结果，确认标志物的表达，如图2A所示。</li>
	<li>P2代传代后的第3天，通过步骤4.5中所述的小管、系膜和巨噬细胞标志物染色，对细胞进行P3代传代及鉴定。在共聚焦显微镜下观察染色结果，确认标志物的表达，如图2A所示。</li>
	<li>制备组织染色：
	<ol>
		<li>将冷冻的野生型和Col4a3-/-肾组织切片在室温下晾干1小时，用4% PFA固定10分钟，用0.2% Triton X-100透化10分钟，并用10%驴血清（DS）在室温下封闭1小时。加入步骤4.5中所述标志蛋白抗体（1:200稀释），在4 °C下孵育过夜。</li>
		<li>次日，使用1:200的抗兔、抗小鼠或抗大鼠荧光二抗孵育45分钟检测染色。在共聚焦显微镜下成像，确认标志物的表达，如图2B和图2C所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 线粒体生物能量学检测
<ol>
	<li>前一天在已包被 5 μg/cm2 I 型胶原蛋白的 96 孔微孔板中，每孔加入 100 μL 培养基，接种 P1 肾小管细胞，细胞密度分别为 20,000、30,000 或 40,000 个细胞/孔。</li>
	<li>为水合传感器微孔板，抬起传感器微孔板，向每孔中加入 200 μL 校准液，然后小心地将微孔板放回，使传感器浸入校准液中。将微孔板置于 37 °C、无 CO2 的培养箱中至少 7 小时，以备使用。 
	为获得最佳结果，建议过夜水合微孔板。</li>
	<li>准备化合物：在含葡萄糖（见步骤 1.10）或脂肪酸（见步骤 1.11）的细胞外通量测定培养基中，分别配制 8 µM 寡霉素、9 µM FCCP 以及 20 µM 鱼藤酮/抗霉素 A 混合液。</li>
	<li>更换培养基：吸除细胞培养基，每孔加入 175 µL 葡萄糖或脂肪酸测定培养基（根据所用化合物确定，见步骤 5.3），在 37 °C、无 CO2 的培养箱中孵育 1 小时。</li>
	<li>向微孔板各加样孔中加入 25 µL 下列化合物：向 A 孔加入 8 μM 寡霉素，使终浓度为 1 μM（注意：由于每孔含有 175 µL 培养基，化合物将被稀释 8 倍）；向 B 孔加入 9 μM FCCP，使终浓度为 1 μM（注意：由于每孔含有 175 µL 培养基及从 A 孔注入的 25 µL 溶液，化合物将被稀释 9 倍）；向 C 孔加入 20 μM 鱼藤酮/抗霉素 A 混合液，使每种化合物的终浓度为 2 μM（注意：由于每孔含有 175 µL 培养基及从 A 和 B 孔注入的共 50 µL 溶液，化合物将被稀释 10 倍）。</li>
	<li>向所有背景孔（无细胞）的 D 孔及其他各孔中加入水。将微孔板置于 37 °C、无 CO2 的培养箱中孵育 10 分钟。</li>
	<li>打开细胞外通量分析仪及其控制器。</li>
	<li>启动分析仪软件，并输入以下程序：
	<ol>
		<li>选择 标准测定，点击 测定向导。在 化合物 选项卡中设定化合物布局，并在 组别与标签 选项卡中对实验组进行标记。请记得将无细胞的空孔设为背景孔。</li>
		<li>在 程序 选项卡下，根据 表 1 所示的可用命令，设置以下混合与检测循环：校准，混合 2 分钟，等待 2 分钟，检测 3 分钟（重复此循环 2–3 次）；注入 A 孔，混合 2 分钟，等待 2 分钟，检测 3 分钟（重复此循环 2–3 次）；注入 B 孔，混合 2 分钟，等待 2 分钟，检测 3 分钟（重复此循环 2–3 次）；注入 C 孔，混合 2 分钟，等待 2 分钟，检测 3 分钟（重复此循环 2–3 次）。点击 结束向导。也可将当前模板保存以供后续使用。</li>
		<li>点击 开始 以启动校准。分析仪将自动弹出板架，并提示插入微孔板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当校准步骤完成后（通常需 20–25 分钟），按提示操作，将微孔板更换为细胞板，并继续运行。</li>
	<li>运行结束后，导出数据并移除 96 孔板。向各测定孔中加入 Hoechst（1:1,000），在 37 °C 下孵育 5 分钟。通过测量 Hoechst 荧光信号（激发波长 355 nm，发射波长 460 nm）对 OCR 数据进行细胞数归一化处理。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

我们优化了一种可高效分离小鼠肾小管上皮细胞（TECs）的实验方案，并证明这些细胞可进行传代培养，用于基于外源性底物（脂肪酸和/或葡萄糖）的细胞外通量分析，以评估线粒体呼吸功能。本方案适用于研究近端和远端小管细胞，可作为构建更复杂实验的基础框架，有助于深入理解与TEC病理相关的肾脏疾病。与先前发表的方案9,10,19相比，该方法无需长时间离心的梯度分离步骤，也无需大量使用抗体进行细胞分选，因此为从事肾小管代谢领域研究的科研人员提供了更为高效和优化的操作指南。本方案中的若干关键步骤包括消化过程、细胞的重新收集、接种密度以及细胞外通量分析中化合物的优化。
选择正确类型的胶原酶及最佳浓度是成功消化和解离肾组织中肾小管细胞的关键。与其他类型的胶原酶相比，II型胶原酶含有相对较高的蛋白酶活性，能够解离致密的肾组织结构。为了尽量减少因灌注和消化时间过长而导致的污染风险，以30 mL/min的速度灌注0.013%的II型胶原酶。肾包膜仅在从动物体内取出双侧肾脏并转移至无菌细胞培养操作台后才予以去除。将肾脏剪切成微小组织块后，继续在10 mL消化缓冲液中孵育5分钟，以实现充分消化并最大程度释放肾小管细胞。
尽管在消化后，组织悬液需通过70 µm滤膜以去除较大的组织碎片，但仍会有未完全消化的肾小管通过滤膜并残留在细胞悬液中，随后被接种至培养皿。这些小管释放出小管细胞并牢固贴附于培养皿所需的时间比正常情况更长。因此，在细胞接种后的第二天收集细胞悬液并进行离心，使未贴附的小管及细胞形成沉淀，这一步骤显得尤为重要。该低速离心过程可进一步去除密度小于小管细胞的其他细胞类型，同时促使未贴附的小管和小管细胞沉降。
确定合适的细胞密度是成功进行细胞外通量分析的第一步，也是关键步骤。结果显示，在XF96微孔板中，每孔接种40,000个细胞，对于原代肾小管细胞在脂肪酸和葡萄糖为基础的呼吸实验中均最为理想（图3C）。在本实验方案中，分离得到的肾小管细胞在第1代和第2代时用于细胞外通量分析。尽管第3代细胞仍维持肾小管标志物的表达（图2），并在生物能量学实验中表现出尚可的性能（图3A），但其基础呼吸水平较第2代有所下降（通过比较 图3A 与 图3C 中最右侧图示的OCR值可看出）。这种下降可能对健康肾小管细胞（例如，从年轻野生型小鼠中分离的细胞）影响不大。然而，对于已存在线粒体呼吸功能减退的慢性肾病（CKD）小鼠模型来源的细胞研究而言，细胞代次过高可能导致基础呼吸水平进一步降低，从而影响细胞外通量分析的结果。在本研究中，第1代和第2代细胞均表现出较高的基础呼吸水平。因此，按照本方案，我们建议在对健康和疾病动物来源的细胞进行线粒体呼吸研究时，使用这两个较早的细胞代次。如果第1代细胞传代后无法获得足够的细胞数量用于通量分析，则仍可考虑使用第2代细胞。除生物能量学研究外，我们先前的研究表明，第3代原代TEC在化合物处理后进行蛋白和RNA分析时仍具有极高应用价值（数据未显示）。因此，我们建议使用本方案分离肾小管细胞的研究人员，应根据不同研究目的谨慎选择最适的细胞代次。
细胞外通量分析的工作原理基于所注入化合物与呼吸链复合物之间的相互作用，以及解偶联剂的作用效果。寡霉素（oligomycin）是复合物V（ATP合酶）的抑制剂，用于区分由ATP合成所关联的耗氧量与为克服线粒体内膜正常质子漏而所需的耗氧量。32FCCP 通过破坏线粒体膜电位，使氧气消耗与 ATP 生成解偶联，从而提供最大呼吸能力的测量值。它通过允许质子跨膜运输，绕过了 ATP 合酶介导的质子外排能力的限制。联合使用复合体 III 抑制剂抗霉素 A 和复合体 I 抑制剂鱼藤酮，可完全抑制线粒体呼吸，从而区分线粒体来源的 与 细胞中非线粒体的氧消耗量。在进行细胞外通量检测之前，应针对特定细胞类型对这些化合物进行滴定，以确定可产生最佳OCR曲线的最适浓度。在此，我们推荐在原代TECs的细胞外通量检测中使用1 µM寡霉素、1 µM FCCP以及2 µM鱼藤酮/抗霉素A。
总之，本方案提供了一种简单且经济有效的方法，用于分离肾源性近端和远端肾小管上皮细胞，可用于评估线粒体生物能量学 离体尽管本方案在探索肾小管上皮细胞生物学功能的多种分子生物学研究中具有广泛的应用价值，但我们承认，当将其应用于需要纯化近端或远端肾小管的研究时存在局限性。例如，对于Lowe综合征（一种选择性近端肾小管功能障碍）的研究33，或关于远端肾小管酸中毒（一种远端肾小管功能障碍）的研究34，需要更复杂的细胞分离与纯化方案。然而，对于大多数比较小管的研究而言 与 肾小球研究，以及对肾小管细胞中潜在线粒体呼吸调节因子的筛选，该方案提供了一种可行的高通量方法。因此，该方案在研究与肾脏疾病相关的线粒体功能障碍方面具有广泛的应用前景，可用于药物发现或靶点验证。

肾小管上皮细胞（TEC）的功能与肾脏的整体健康状况密切相关。肾脏内的病理性信号传导可导致TEC去分化，这在肾纤维化和慢性肾脏病（CKD）的发生中起着关键作用1,2。作为高耗能器官，肾脏的耗氧量仅次于心脏，主要依赖线粒体氧化磷酸化过程3。电子显微镜研究表明，线粒体形态的改变与肾小管内的病理事件呈正相关4。TEC中线粒体功能障碍可通过上皮-间质转化5和脂肪酸氧化缺陷6引发肾纤维化。纤维化是一种进行性肾病理改变，最终导致CKD。因此，了解肾TEC的能量状态对于揭示CKD的发病机制至关重要。
有 &#62; 成人肾脏中的20种细胞类型7为了研究肾上皮细胞（TECs）的功能，需要建立肾上皮细胞的原代培养体系，作为开展化学处理和遗传操作等分子生物学应用的平台。重要的是，可对这些细胞进行遗传操作 体内 通过转基因技术或使用AAV基因递送技术在小鼠体内8 从而使分离的原代细胞已实现遗传操作。从小鼠分离原代肾小管细胞9,10大鼠11,12,13，犬14，兔子15,16和人类17,18 已有报道通过纯化步骤获得高纯度的近端小管细胞。在这些既往发表的专注于分离近端小管细胞的实验方案中，采用了梯度离心和分选实验以实现纯化目的19尽管这些方案对于研究近端小管具有重要价值，但在需要同时研究近端和远端小管时则显得不足。例如，我们对Alport综合征的研究表明，近端和远端肾小管在疾病进展过程中均发挥着重要作用20因此，应在培养中同时研究这两种肾小管。最近一项关于肾脏氟中毒的研究也显示，近端和远端肾小管均发生了病理改变。21因此，本分离方案针对小鼠肾脏近端和远端肾小管细胞设计并优化，在试剂成本最低且操作简便的条件下实现高效分离。此外，研究者也可按照本方案操作至第3.1步，随后增加纯化步骤9 从这一点开始，用于分离纯化的近端小管细胞。
分离的细胞具有较高的能量水平，并在传代培养至第4代后仍保持肾小管上皮细胞特性。利用高通量细胞外通量分析仪，我们直接在96孔板中对分离的肾小管上皮细胞（TECs）进行线粒体呼吸功能检测，从而为进一步优化细胞密度提供依据。这些结果表明，该方案可应用于肾小管 离体 采用一致且高度标准化的方法生产肾小管上皮细胞（TECs）的研究。该方案的另一重要意义在于其可作为高通量筛选工具的可行性应用 离体 肾近端和远端小管细胞中线粒体生物能量学的表征。因此，该方法可作为肾脏疾病药物发现或药物特性研究的平台。

<table><tbody><tr><td>大鼠尾部胶原蛋白 I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>J.T.Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>II 型胶原酶</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>肾上皮细胞生长培养基 2 试剂盒</td><td>PromoCell</td><td>C-26130</td><td></td></tr><tr><td>2-脱氧葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>L-肉碱</td><td>Sigma</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>依托莫西</td><td>Sigma</td><td>E-1905</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙 (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>抗霉素 A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>棕榈酸钠</td><td>Sigma</td><td>P9767</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM 溶液</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 干粉</td><td>Sigma</td><td>D5030-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>LifeTechnologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染色液 (0.4%)</td><td>LifeTechnologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>TC10 自动细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td>506BR2119</td><td></td></tr><tr><td>MINIPULS 3 蠕动泵</td><td>Gilson Inc.</td><td>GM3P</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 分析仪</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>S7800A</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 通量试剂包（包含传感器微孔板、微孔板和校准液）</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>10260-100</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠原代肾小管上皮细胞的分离、鉴定及高通量细胞外通量分析

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

肾小管上皮细胞（TECs）中的线粒体功能障碍可导致肾纤维化，这是慢性肾脏病进展的主要原因之一。&#160;慢性肾脏病（CKD）。因此，评估原代肾小管上皮细胞（TECs）的线粒体功能，可能为细胞的生物能量状态提供有价值的见解，进而揭示CKD的病理生理机制。尽管目前已有一些复杂的方案可用于不同物种近端小管的分离与纯化，但该领域仍缺乏一种经济高效且经过优化的方法&#160;无需纯化步骤的肾小管细胞分离。本文提供了一种分离方案，可用于研究原代小鼠近端和远端肾小管上皮细胞（TECs）。该方案不仅所需试剂成本较低，且涉及的动物操作步骤最少；分离获得的细胞在分离后仍保持较高的能量水平，并可传代培养至多四次&#160;传代，以实现持续研究。此外，我们使用高通量细胞外通量分析仪，在96孔板中直接评估分离得到的肾小管上皮细胞的线粒体呼吸，并提供了细胞密度和化合物浓度优化的建议。这些结果表明，该方案可用于肾小管 离体 采用一致且高度标准化的方法生产肾小管上皮细胞的研究。该方案未来可更广泛地应用于研究与肾脏疾病相关的线粒体功能障碍，以服务于药物发现或药物表征的目的。

肾脏灌注与消化可获得高活力的肾小管上皮细胞： 
小鼠肾小管上皮细胞的分离按照上述方案中第1至第3节所述步骤进行。
消化后，将直径小于70 µm的肾脏细胞异质群体、未完全消化的小管片段及其他组织碎片在分离当天接种至培养皿中。通常预期在分离后第0天至第1天之间，仅可见细胞贴壁情况发生变化，而不会出现细胞生长。在漂浮的异质细胞群中，第1天仅有少量小管细胞贴壁（图1A）。在第1天重新收集细胞，经离心和再次接种，有助于去除轻度碎片，并使小管片段沉降以利于小管细胞进一步释放。从第1天到第3天，不仅细胞贴壁情况改善，细胞生长速率也显著提高，细胞密度较第1天增加至约三倍（图1A）。在初始生长阶段，细胞形成多个克隆集落，并在集落周围扩展增殖。自此以后，分离的细胞已完全恢复，表现出健康的增殖状态。至第5天，在60 mm的培养皿中，细胞融合度达到80–90%，细胞之间及集落之间仍留有部分间隙（图1A）。
分离肾小管细胞的传代培养与鉴定： 
分离得到的肾小管上皮细胞按照上述方案第4节所述步骤进行传代培养，以用于后续鉴定。
从第5天起，细胞完全恢复了分离后的状态，并开始旺盛增殖。分离一周后，细胞在60 mm培养皿中生长至汇合。在第0代培养一周后，细胞即可进行传代，进入第1代，并随后再连续传代2次。第1代和第2代细胞表现出相似的生长模式。通常情况下，第1代和第2代细胞在不到一周的时间内即可生长至汇合，以进行后续的传代培养。图1B)。从第0代到第2代连续培养的融合细胞表现出广泛的穹顶样结构形成23,24 (图1B），表明分离的细胞保持了良好的状态，能够分泌类似于 体内 该状态导致细胞单层从培养板上脱离，但仍通过紧密连接相互连结。
为鉴定培养细胞的特性，我们对第1至第4代培养的细胞以及对照细胞系——人近端肾小管上皮HK-2细胞进行了免疫荧光染色。近端小管标志物水通道蛋白1（AQP1）25 以及血管紧张素原（AGT）9远端小管标志物 E-cadherin25，上皮标志物平滑肌肌动蛋白（SMA）26,27,28，巨噬细胞标记物 F4/8029 和 CD6830以及系膜标记物胸腺细胞分化抗原1（Thy1/CD90）9 用于表征研究。近端小管蛋白 AQP1 和 AGT 在第 1 代至第 4 代分离的小管细胞以及阳性对照 HK-2 近端上皮细胞中均持续高表达（图2A）。远端小管蛋白 E-cadherin 在分离的小管细胞中传代至第 4 代时仍有表达，HK-2 细胞中也观察到该蛋白的表达。图 2A）。SMA 在分离的肾小管细胞和对照 HK-2 细胞中均大量表达，与已发表的报道一致26,27. 另一方面，系膜细胞蛋白Thy1和巨噬细胞蛋白F4/80在分离的肾小管细胞及对照HK-2细胞中均未检出（图 2A）。CD68 在 HK-2 细胞及第1代和第2代分离的肾小管细胞中表达极低，自第3代至第4代其表达则无法检测到（图 2A）。结果表明，按照本方案分离的细胞是近端和远端小管细胞的混合物。为比较这些标志物蛋白的表达水平 体内，我们在冷冻的肾脏组织中进行了染色。在野生型健康小鼠的肾脏中，肾小管标志物 AQP1、AGT 和 E-cadherin 以及系膜细胞蛋白 Thy1 均呈现高表达（图2B。在野生型肾脏中观察到 F4/80 和 CD68 表达水平较低，但在 Col4a3 敲除小鼠分离的肾脏中则广泛表达-/- 出现巨噬细胞浸润并发生肾功能衰竭的小鼠20,31 (图2C).
分离原代肾小管细胞的线粒体生物能量学检测： 
线粒体呼吸检测的步骤已在上述方案的第5部分中概述。
通过不同铺板密度下的细胞外通量分析法测定分离的原代肾小管细胞的线粒体呼吸作用，以检测氧耗率（OCR）。为确定最佳铺板密度，于细胞外通量检测前一天（约20小时前）将每孔20,000、30,000和40,000个原代肾小管上皮细胞（TECs）接种至96孔XF96微孔板中（图3A）。完成细胞外通量分析后，通过Hoechst染色定量细胞数量，将OCR测量值标准化。以每孔20,000、30,000或40,000个细胞铺板时，平均基础OCR分别为25、45或50 pmol/min（图3A）。此外，显微镜图像显示，与其它铺板密度相比，每孔40,000个细胞能更充分地覆盖微孔板孔底的整个表面（图3B）。尽管使用40,000个细胞时的最大OCR并未较30,000个细胞的密度进一步增加，我们仍推荐使用约40,000个细胞/孔的密度，以实现细胞与化合物之间的最佳相互作用。
此外，在我们的实验中，抑制剂/解偶联化合物的最佳浓度显示为 1 µM 寡霉素， 1 µM FCCP，以及 2 µM 鱼藤酮/抗霉素A（细胞外通量测定及进样端注射的实验方案列于 表1；优化实验未展示。然而，建议所有使用者对这些化合物进行初步测试，浓度范围应涵盖发表值的较低与较高水平，以确保获得最佳结果。
细胞外通量检测可提供多个重要参数，用于评估肾小管上皮细胞（TEC）的生物能量状态。例如，由于脂肪酸氧化在TEC中被证实存在特异性缺陷，因此使用含有脂肪酸底物（棕榈酸盐）并联合糖酵解抑制剂（2DG）的培养基，可作为直接评估第1代和第2代TEC中脂肪酸氧化能力的有效工具（图3C）。在肾纤维化的情况下，即使基于葡萄糖的培养基可能未显示出任何差异，细胞的整体呼吸能力仍预期低于健康肾脏细胞。
综上所述，细胞外通量分析（尤其用于评估脂肪酸氧化能力）可作为一种有效的检测手段，用于评价肾小管上皮细胞的能量状态，其中影响生物能量谱的病理改变在肾纤维化及进展为肾功能衰竭过程中起着重要作用。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>时间（分钟）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>校准</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平衡：</td>
			<td>00:12:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量 1</td>
			<td>3 次循环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>注入端口 A（1 μM 寡霉素）</td>
			<td>2 次循环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>注入端口 B（1 μM FCCP）</td>
			<td>2 次循环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>注入端口 C（2 μM 鱼藤酮/抗霉素）</td>
			<td>2 次循环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于原代肾小管细胞最佳OCR测量的标准细胞外通量分析运行方案。
<img alt="原代肾小管细胞培养第1至第5天，传代0至2，10X-40X显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 分离的原代肾小管细胞培养。（A）分离的原代肾小管细胞在第1天即开始贴壁，并从第3天至第5天旺盛生长。图像在10X和20X物镜下拍摄。（B）该图展示了从传代0至传代3的原代肾小管细胞亚培养情况。细胞穹顶的图像在10X和20X物镜下拍摄，而不同传代过程中形态学变化的图像则在40X物镜下拍摄。比例尺 = 100 µm。<a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示AQP1、AGT、E-钙黏蛋白的肾细胞免疫荧光显微镜图像；蛋白质定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 分离的原代肾小管细胞的表征。（A）使用针对近端小管蛋白（AQP1、AGT）、远端小管蛋白（E-cadherin）、上皮细胞蛋白（SMA）、系膜细胞蛋白（Thy1）以及巨噬细胞蛋白（F4/80、CD68）的抗体进行免疫染色，结果显示所分离的原代肾小管细胞及其后续传代培养物为纯化的近端和远端肾小管细胞。（B）本图显示来自健康野生型小鼠肾组织中近端小管、远端小管及系膜蛋白的染色结果，作为阳性对照，以及无一抗的阴性对照。（C）本图显示来自Col4a3-/-小鼠肾组织中巨噬细胞蛋白F4/80和CD68的染色结果，作为阳性对照。比例尺 = 20 µm。DAPI染色显示为蓝色，标记蛋白显示为绿色。<a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原代肾小管细胞OCR图及细胞图像。使用FCCP和Rot/AA进行的代谢呼吸分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 不同接种密度下分离的原代肾小管细胞的细胞外通量检测。（A）在第3代细胞中检测发现，随着细胞接种密度的增加，原代肾小管细胞的基础呼吸水平增强。（B）本图展示了接种于XF96微孔板中、密度分别为每孔20,000、30,000和40,000个细胞的原代肾小管细胞的显微图像。比例尺 = 100 µm。（C）本图展示了第2代和第1代原代肾小管细胞中以脂肪酸或葡萄糖为基础的细胞外通量检测结果。数据表示为均值 ± 标准误。<a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案提供了一种经济有效的方法，用于分离和鉴定小鼠原代肾小管细胞，随后可对这些细胞进行传代培养，以评估肾脏生物学功能 离体，包括线粒体生物能量学。

肾小管上皮细胞（TECs）中的线粒体功能障碍可导致肾纤维化，这是慢性肾脏病（CKD）的主要病因之一。

该方法有助于解答有关肾脏代谢的关键问题，例如脂肪酸氧化，其与肾纤维化及多种其他肾病的发生密切相关。该技术的主要优势在于利用高通量平台筛选能够调节肾小管上皮细胞线粒体生物能量的化合物。该技术的应用前景延伸至肾脏代谢性疾病的治疗，因为它能够对调节肾上皮细胞线粒体代谢的化合物进行高通量筛选。为制备胶原包被的60毫米培养皿，向每个培养皿中加入2毫升预过滤的20毫摩尔醋酸溶液，随后加入35微升I型胶原溶液。然后在室温下孵育1小时，风干，并进行紫外照射。接着用PBS冲洗去除醋酸残留，重复冲洗三次。然后，将培养皿置于37摄氏度、无二氧化碳的细胞培养箱中。在准备小鼠手术时，使用脱毛膏去除胸部和腹部的毛发。接着，用碘液对皮肤进行消毒，并擦去残留的碘液。接下来，切开腹腔以暴露心脏和肾脏。然后，将灌注泵设置为每分钟32毫升，并在开始灌注前清除管路中的所有气泡。在管路末端使用27号针头。操作时，将针头从心脏心尖处插入左心室。当灌注缓冲液充满心脏后，立即在右心房上刺一个小孔，以提供灌注缓冲液的流出通道。随后，切换为消化缓冲液，并将泵速略微调低至每分钟30毫升，以进行消化。灌注20毫升消化缓冲液后，取出双侧肾脏用于肾小管细胞的分离。处理收获的肾脏时，首先去除肾包膜和髓质。然后将双侧肾脏切成微小碎片，加入10毫升消化缓冲液，在37摄氏度摇床中孵育5分钟。消化完成后，将缓冲液通过70微米滤膜以去除未消化的组织。收集消化后的组织后，加入10毫升培养基以终止消化反应。接着，将滤过的组织悬液在50 ×g下离心5分钟，使肾小管细胞沉淀。然后，将上清液转移至新管中，加入5 mL培养基，并重复离心以收集残留的管状细胞。接着，将第一次获得的沉淀重悬于20 mL培养基中，在50 ×g条件下离心5分钟，以进一步纯化收集的细胞。弃去上清液。然后，将两个沉淀均重悬于10毫升培养基中。接着，使用台盼蓝染色法计数活细胞。随后，将最多1000万个细胞接种至60毫米的胶原蛋白包被培养皿中，静置过夜使管状细胞贴壁。首先，将 P1 小管细胞以每孔 40,000 个细胞的密度接种至新制备的、经胶原蛋白包被的 96 孔微孔板中。每孔加入 100 µL 培养基。在细胞外通量检测中，细胞密度和化合物浓度的优化是实验成功的关键。我们建议先进行预实验以确定最佳的细胞密度和化合物浓度。接下来，水合传感器 cartridge。首先，抬起传感器 cartridge，向每孔中加入 200 µL 校准液。然后，重新放置 cartridge 以浸没传感器，并在 37 摄氏度下孵育装置过夜。第二天，吸除旧的培养基，加入 175 µL 葡萄糖或脂肪酸检测试剂。随后，在无二氧化碳条件下继续孵育 1 小时。在细胞孵育过程中，向微孔板的A孔加入25微升寡霉素，B孔加入FCCP，C孔加入鱼藤酮/抗霉素A，D孔及所有其他孔加入水。随后，将微孔板置于无二氧化碳的孵箱中，直至仪器准备就绪进行校准。接着，打开细胞外通量分析仪和控制器。接下来，打开分析软件，选择一个标准检测方法，然后点击“检测向导”选项。接着，在“化合物”选项卡下，将化合物分配至相应的端口。在“背景校正”选项卡下，选择不含细胞的孔。接下来，使用“分组与标签”选项卡为实验组别添加标签。然后，在“实验方案”选项卡下，利用可用命令设置适当的混匀和检测循环次数。这些设置在文本版实验方案中已有说明，输入完成后，请保存该模板以供将来使用。现在，按“结束向导”继续。然后，按“开始”以启动校准。分析仪将弹出板架，并提示插入盒式板。此校准过程需要 20 至 25 分钟才能完成。系统校准后，按下提示命令，将校准板更换为细胞板，然后继续运行。运行完成后，保存 OCR 数据，并从分析仪中取出板。现在，向每个检测孔中加入 Hoechst 染料，在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。然后使用 355 纳米激发光和 460 纳米发射光检测细胞数量，并将 OCR 数据归一化至细胞数。在本方案中，将包含异质性肾细胞、未完全消化的小管以及其他组织碎片的混合物接种于胶原包被的培养板上进行培养。分离后的第二天，将培养基离心以去除碎片，并将小管细胞重新接种。随后，细胞更易贴壁，培养至第五天时，细胞融合度达到80%至90%。然后对肾小管上皮细胞进行传代培养，一周内即可生长至融合。在随后的两次传代中也观察到类似的生长情况。细胞单层形成穹顶状结构，从培养板上隆起，并通过紧密连接保持附着。采用已描述的细胞外通量分析法，在不同接种密度下测定分离得到的原代胸腺上皮细胞（TECs）的线粒体呼吸耗氧率（OCR）。细胞接种密度越高，OCR 值也相应增加。每孔接种 40,000 个细胞时，细胞对培养板表面的覆盖效果优于其他任何接种密度，因此是检测细胞与化合物相互作用的最佳浓度。例如，在传代一至二代的 TEC 中加入含脂肪酸底物的培养基以及糖酵解抑制剂 2DG，可直接评估 TEC 中的脂肪酸氧化情况。在进行该实验操作时，务必准确记录每个孔中的精确体积和浓度。组分的最终浓度发生变化可能导致整个实验失败。该技术建立后，将为肾脏病学领域的研究人员探索肾小管脂肪酸代谢在多种肾病发病机制中的作用提供新的途径。

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生物学

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