Name: 2在 1: 一步亲和纯化为蛋白质蛋白质和蛋白质代谢物的平行的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习一步亲和纯化结合质谱技术，用于平行分析蛋白质与蛋白质及蛋白质与代谢物的相互作用。该方法适用于拟南芥细胞培养，可在四小时内完成，为研究分子互作提供高效方案。

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我们谨向 Lothar Willmitzer 教授表示诚挚的感谢，感谢他参与本项目、富有成效的讨论以及出色的指导。我们感谢 Daniel Veyel 博士在蛋白质组质谱检测方面的协助。我们感谢 Änne Michaelis 女士在液相色谱-质谱检测中提供的宝贵技术支持。此外，我们感谢 Monika Kosmacz 博士和 Ewelina Sokołowska 博士在原始稿件撰写工作中的帮助与参与，并感谢 Weronika Jasińska 提供的技术支持。

<ol><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+as+global+regulators%3A+A+new+view+of+protein+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li>
<li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li>
<li>Ramírez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson%27s+disease-associated+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161(2017).</li>
<li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules%3A+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pharmacal+Research%22%5BJournal%5D)">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li>
<li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li>
<li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li>
<li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li>
<li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li>
<li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397(2010).</li>
<li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21699588">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Transcription+Factors%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. -E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301(2016).</li>
<li>Hooper, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUBAcon%3A+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li>
<li>Katajamaa, M., Orešič, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STITCH+5%3A+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li>
<li>Tanaka, K. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN%3A+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Drug+Monitoring%22%5BJournal%5D)">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案可平行鉴定目标蛋白的PP和PM复合物。从克隆到获得最终结果，实验可在8至12周内完成。针对12至24个样本的一整套亲和纯化（AP）过程约需4至6小时，因此本方案适用于中等通量分析。
尽管该实验方案整体较为简单，但仍包含若干关键步骤。（i）足够的输入蛋白量和亲和 beads 用量对于实现代谢物检测的动态范围至关重要。因此，高效的细胞裂解是该实验流程中的关键步骤。蛋白得率过低可能是由于材料研磨不充分或裂解缓冲液与材料比例不理想所致。（ii）应确保所用试剂适合质谱检测。应避免使用强去污剂、甘油或过量盐类，因为它们会干扰质谱检测。（iii）在洗涤步骤中，琼脂糖 beads 不应过度干燥；当使用真空 manifold 时，应控制较低的流速，以避免破坏 beads 或影响复合物的稳定性。
对本方案存在一些重要的可能修改：（i）我们使用组成型 CaMV35S 启动子以最大化诱饵蛋白的表达量。尽管过表达非常有用，但可能对细胞稳态产生严重影响28，并导致形成无生理意义的相互作用。使用内源启动子表达带标签蛋白，并在可能的情况下于功能缺失背景下进行，被认为更有利于获得真实的生物学互作蛋白。对于在植物细胞培养中通常不表达的蛋白，可能需要使用植物整体背景以鉴定相关的互作蛋白。（ii）在处理膜蛋白时，裂解缓冲液需添加与质谱兼容的去垢剂。（iii）引入第二步亲和纯化步骤可提高真阳性与假阳性的比例，并消除对空载体对照（EV controls）的需求29。一种具有两个独立蛋白酶切割位点的新型串联标签，为 Maeda et al. 201411 所采用的尺寸排阻色谱步骤提供了一种更具吸引力的替代方案，后者既费力又耗时。
AP 最严重的缺点是假阳性率较高。原因多种多样。前文已提到组成型过表达的问题。另一个导致生理上无关相互作用的原因是，除非使用分离的细胞器，否则制备的全细胞裂解液会包含来自不同亚细胞区域的蛋白质和代谢物混合物。应利用亚细胞定位信息来筛选真实的相互作用蛋白。然而，大多数假阳性结果源于蛋白质与琼脂糖树脂之间的非特异性结合。如上所述引入第二步纯化是解决该问题的最佳方案，但会增加实验耗时并降低通量。此外，随着实验流程延长，较弱的相互作用可能会丢失。AP 的另一个局限性在于，尽管它能全面提供目标蛋白相互作用组的信息，却无法区分诱饵蛋白的直接作用靶点和间接作用靶点，因此需要通过靶向的双分子实验方法来验证相互作用。
采用亲和纯化（AP）结合基于质谱的代谢组学方法，用于研究酿酒酵母（S. cerevisiae）中的蛋白质复合物12。该研究与我们先前的观察结果13共同为本方案提供了概念基础，即类似于脂质，极性和中等极性化合物在从细胞裂解液中分离的蛋白质复合物上仍保持结合状态。本方案具有三个独特之处：（i）与先前在酵母中的研究12相比，本方案表明，亲和纯化不仅适用于获取疏水性蛋白配体，也适用于获取亲水性蛋白配体；（ii）通过引入一种“三合一”提取方案，可利用单次亲和纯化同时研究诱饵蛋白的相互作用蛋白和相互作用代谢物；（iii）我们将该方案优化并适配于植物细胞。
未来的研究将致力于构建一种具有两个独立蛋白酶切割位点的新型串联标签。我们还希望探索该方案在低丰度小分子（如植物激素）中的适用性。

本文所述方法旨在近似生理条件下鉴定目标蛋白的代谢物和蛋白质相互作用伙伴。体内 细胞裂解液条件。据推测，除目前已鉴定的代谢物外，还有更多代谢物具有重要的调控功能1代谢物可作为生物开关，改变其受体蛋白的活性、功能和/或定位2,3,4在过去的十年中，出现了几种突破性方法，能够确定死亡时间（PMI） 体内 或在近-体内 条件，已得到开发5现有方法可分为两类。第一类方法采用已知代谢物作为诱饵，以捕获新的蛋白质互作伙伴。相关技术包括亲和层析6药物亲和力响应靶标稳定性测定7，化学蛋白质组学8，以及热蛋白质组分析9第二组包含一种单一的方法，该方法从一个已知的蛋白质出发，以鉴定小分子配体10,11.
采用亲和纯化联合基于质谱的脂质组学方法分析了Saccharomyces cerevisiae12 中的蛋白质-脂质复合物。作为研究起点，作者使用了表达21种参与麦角固醇生物合成的酶以及103种激酶的酵母菌株，这些蛋白均与串联亲和纯化（TAP）标签融合。研究发现，70%的酶和20%的激酶能够结合不同的疏水性配体，揭示了复杂的蛋白质-脂质相互作用网络。
此前，我们已证明，与脂质类似，极性和中等极性化合物也仍结合在从细胞裂解液中分离出的蛋白质复合物上13根据这些研究结果，我们决定优化先前发表的AP方法10,11 用于植物细胞和亲水性化合物14为此，我们使用了Van Leene等人描述的TAP载体 等 2010年，成功应用于植物蛋白质相互作用研究15为了缩短获得转基因品系所需的时间，我们选择了拟南芥细胞培养体系。我们采用了一步法甲基化 叔（tert-）叔丁基醚（MTBE）/甲醇/水提取法，可用于表征蛋白质（沉淀）、脂质（有机相）和亲水性代谢物（水相）16 在一次亲和纯化实验中。引入了EV对照组以排除假阳性结果， 例如 仅与标签结合的蛋白质。作为概念验证，我们对拟南芥基因组中存在的五种核苷二磷酸激酶中的三种（NDPK1-NDPK3）进行了标记。除其他发现外，我们能够证明NDPK1与谷胱甘肽相互作用 S转移酶和谷胱甘肽。因此，我们能够证实NDPK1会发生谷胱甘肽化修饰14.
总之，本方案是表征蛋白质-蛋白质及蛋白质-小分子相互作用网络的重要工具，相较于现有方法具有显著进步。

<table><tbody><tr><td>含最低限度有机物的Murashige和Skoog基础盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>1-萘乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>激动素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>卡尔·罗特</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV蛋白酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>罗蒂电泳&amp;nbsp;凝胶 30 (37.5:1)</td><td>卡尔·罗特</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>卡尔·罗特</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白标准品</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP标签抗体（SB19-C4）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/Lys-C 混合物，质谱级</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>硫脲</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>甲醇&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>甲酸&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 平板摇床</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>尼龙网筛（丝径 34 &amp;micro;M，厚度 55 &amp;micro;M，开放区域 14%</td><td>Prosepa</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>玻璃漏斗，47 mm，300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 0.2 微孔滤膜瓶顶过滤器 &amp;micro;M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Mill MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol “Classic” 带两种不同螺旋盖，不含滤器</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>过滤（小型）35 &amp;micro;M 型孔径，适用于 Mobicol M 1002、M1003、M1050 &amp;& M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>可变速度试管旋转仪 SB 3</td><td>卡尔·罗斯</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>用于旋转器的旋转盘 SB 3</td><td>卡尔·罗斯</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Resprep 24孔固相萃取装置</td><td>Restek&amp;nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/17% SPE 柱 100mg / 1ml</td><td>Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>自动进样器&amp;nbsp;小瓶</td><td>Klaus Trott 色谱法配件&amp;ouml;r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 液相色谱柱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 液相色谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus 混合四极杆-轨道阱质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC 系统&amp;nbsp;</td><td>沃特斯&amp;nbsp;</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 色谱柱，100Å，1.8 μm &amp;micro;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/包</td><td>沃特斯&amp;nbsp;</td><td>186003533</td><td></td></tr><tr><td>用于水基清洗溶液的高功率超声波清洗仪</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Expressionist</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 软件</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

细胞过程由蛋白质、代谢物和核酸等生物分子之间的相互作用进行调控。尽管蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的研究已非新颖，但旨在表征内源性蛋白质-代谢物相互作用（PMI）的实验方法则是近年来才发展起来的。本文中，我们介绍一种可同时表征目标蛋白（称为“诱饵蛋白”）的PPI与PMI的实验方案。该方案针对拟南芥细胞培养体系优化，结合了亲和纯化（AP）与基于质谱（MS）的蛋白质和代谢物检测技术。简言之，首先裂解表达带有亲和标签融合诱饵蛋白的转基因拟南芥细胞系，以获得天然细胞提取物；利用抗标签抗体下拉与诱饵蛋白相互作用的蛋白质及代谢物伙伴；随后采用一步甲醇提取法对亲和纯化所得复合物进行提取 叔丁基叔丁基醚（MTBE）/甲醇/水法。代谢物分别进入极性相或疏水相，而蛋白质则存在于沉淀中。随后，采用超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS 或 UPLC-MS/MS）对代谢物和蛋白质进行分析。实验中使用空载体（EV）对照组以排除假阳性结果。本方案的主要优势在于可在接近生理条件（细胞裂解液）下，平行鉴定目标蛋白的蛋白质和代谢物互作伙伴。该方法操作简便、快速，且可轻松适用于植物细胞培养以外的其他生物体系。

在原始研究中，三个 A. thaliana NDPK 基因在组成型 35S 启动子的调控下于 PSB-L 细胞悬浮培养物中过表达14（图 1）。将串联亲和标签融合至诱饵蛋白的羧基端或氨基端。亲和纯化的复合物经 MTBE/甲醇/水提取16。使用质谱法鉴定亲和捕获的蛋白质和小分子（表 S2 和 S3）。
为校正假阳性结果，使用空白样品排除来自化学试剂和实验室耗材的小分子污染物。此外，通过使用空载体（EV）对照组，排除了仅与亲和标签或树脂结合的代谢物和蛋白质。为获得真实阳性结果，采用双尾非配对 Student's t 检验并结合 Benjamini &amp; Hochberg 错误发现率（FDR）校正方法，鉴定在 NDPKs 免疫沉淀实验（N 端和 C 端标记的 NDPKs）中相对于空载体对照组显著富集的代谢物（表 S4）和蛋白质（表 S5）（FDR &lt; 0.1）。需要注意的是，在先前的研究中，我们采用存在/缺失标准来界定蛋白质和小分子相互作用物。
以NDPK1为例给出了代表性结果，而代谢物数据则聚焦于二肽，这是本研究小组研究的一类新型小分子调节剂。蛋白质组学分析鉴定出26种NDPK1的潜在蛋白互作伙伴。通过进一步筛选与NDPK1共定位于相同亚细胞区室（细胞质）的蛋白质，候选列表缩小至13种潜在的蛋白相互作用分子。所鉴定出的蛋白质包括谷胱甘肽S-转移酶、两种延伸起始因子、微管蛋白和乌头酸水合酶。代谢组学分析发现四种二肽Val-Leu、Ile-Glu、Leu-Ile和Ile-Phe能够特异性地与NDPK1共洗脱（图2）。值得注意的是，这四种二肽的N端均含有一个疏水性残基，提示其具有共同的结合特异性。
为了寻找已知的蛋白质-蛋白质和蛋白质-代谢物复合物，我们将13种已鉴定的蛋白质和4种二肽与Stitch数据库进行比对。25 (图3）。可以得出以下几点观察结果：（i）NDPK1 之前未见报道有任何上述互作蛋白。（ii）APX1 的直系同源物曾被报道与醛脱氢酶家族成员 ALDH7B4 相互作用，而翻译起始因子 FBR12 则与由基因 AT2G40290 编码的另一翻译起始因子相互作用。（iii）所鉴定出的二肽此前未见任何已知的蛋白质互作伙伴。共洗脱的二肽此前也未见报道与任何所获得的植物蛋白相关联。然而，它们在其他生物体中具有重要作用：Leu-Ile， 例如在人源细胞系中具有激活神经营养因子的作用26请注意，该实验无法确定系统的精确拓扑结构。例如，二肽可能直接与NDPK1相互作用，但也可能与任何共纯化的蛋白质相关。
综上所述，我们的结果表明，采用免疫共沉淀联合质谱技术的既定方法有助于鉴定蛋白质-蛋白质和蛋白质-小分子相互作用物，并能够获取目标蛋白质相互作用组的大量信息。
<img alt="转基因细胞处理、TAP标签蛋白纯化、柱层析、LC-MS/MS分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. AP-MS工作流程示意图。（A） 从植物细胞培养物中制备天然可溶性组分。（B） AP实验的后续步骤。将样品上样至层析柱后，与TAP标签融合的目标蛋白（POI）会结合到固定在琼脂糖微珠上的IgG抗体。通过洗涤层析柱可去除未结合的蛋白质和代谢物。经AcTEV酶切后，洗脱出POI蛋白-代谢物复合物。（C） 将复合物分离为蛋白质组分和代谢物组分，随后进行半定量质谱分析。本图部分内容改编自Luzarowski et al. 201714。<a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质强度比较图；柱状图 A-D；NDPK 在载体中的表达；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 与NDPK1特异性共洗脱的二肽。 在亲和纯化实验中检测到的四种二肽Val-Leu (A)、Ile-Glu (B)、Leu-Ile (C) 和 Ile-Phe (D) 的平均强度被绘制成图。与空载体对照组相比，所有四种二肽在NDPK1样品中均显示出显著富集（星号表示FDR &lt; 0.1）。误差条表示6次测量值的标准误差（包括N端和C端标签蛋白各3个重复）。 <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示分子结构的蛋白质相互作用图；节点标注蛋白质编号和配体。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3. 所有与NDPK1共洗脱的分子与STITCH数据库比对得到的相互作用网络，仅考虑先前的实验和数据库证据（置信度 &gt; 0.2）。 置信度越高，表示发生相互作用的可能性越大，其数值基于已存数据计算得出。 <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
表 S1. MaxQuant 输出文件“parameters.txt”。该表格包含用于鉴定和定量的阈值，以及所用数据库的相关信息。<a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">请点击此处下载该文件。</a>
表 S2. 来自 MaxQuant 输出表格“proteinGroups.txt”的信息。该表格包含所有已鉴定蛋白质组的列表、强度值以及额外信息，例如唯一肽段数量和评分。<a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">请点击此处下载该文件。</a>
表 S3. 含极性代谢物分析结果的输出文件。该表格包含所有已鉴定的质量特征列表，每个特征由特定的质荷比（m/z）、保留时间（RT）和强度表征。<a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">请点击此处下载该文件。</a>
表 S4. 使用 NDPK1、NDPK2 或 NDPK3 作为诱饵时在 AP 样本中发现的二肽。 空白样本中存在的二肽已从列表中排除。每种 NDPK 分别构建了两个独立的标签株（N 端或 C 端标记），并进行三重复实验。采用 Student t 检验，并通过 Benjamini &amp; Hochberg 方法对 p 值进行进一步校正，以确定与 NDPK 显著富集的相互作用蛋白伙伴（FDR &lt; 0.1）。表中给出的 ΔRT 是相对于参考化合物计算的结果，Δppm 是相对于 Metlin27 提供的单一同位素质量计算的结果。<a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">请点击此处下载该文件。</a>
表 S5. 与 NDPK1 共纯化的蛋白质。 每种 NDPK 分别构建了两个独立的株系（N 端或 C 端标记），每组实验均进行三次重复。采用 Student t 检验，并通过 Benjamini &amp; Hochberg 方法对 p 值进行进一步校正，以确定与 NDPKs 显著富集的相互作用蛋白（FDR &lt; 0.1）。<a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">请点击此处下载该文件。</a>

蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-代谢物相互作用对所有细胞功能至关重要。本文介绍了一种可对目标蛋白质的这些相互作用进行并行分析的实验方案。该方案针对植物细胞培养体系进行了优化，结合了亲和纯化与基于质谱的蛋白质及代谢物检测技术。

细胞过程由蛋白质、代谢物和核酸等生物分子之间的相互作用进行调控。尽管对……的研究

该方法不仅可用于解答基础研究中的关键问题，还能通过鉴定重要蛋白质的新型小分子配体，为医学、制药和生物技术领域做出贡献。该技术的主要优势在于，能够在接近体内条件的情况下，对目标蛋白质及其代谢相关分子进行并行分析。该方法有助于筛选出相互作用的分子，而无需局限于预先选定的配体。尽管该方法是为植物开发的，但也可应用于其他体系，如HeLa细胞、E.coli和S.Cerevisiae。首先，制备MSMO培养基，并用1摩尔氢氧化钾将pH值调节至5.7。然后，在121摄氏度下高压灭菌15分钟。在实验开始前，将补充剂加入培养基中。现在，将转基因PSBL拟南芥细胞培养物在100毫升锥形瓶中的50毫升MSMO培养基中进行培养。然后，将锥形瓶置于旋转振荡摇床上，在光照条件下于20摄氏度以130 rpm的速度轻轻振荡培养细胞。每七天将细胞以1:10的比例传代至新鲜培养基中。随后，使用装有尼龙滤网的玻璃漏斗置于锥形瓶上，并连接真空泵，于对数生长期收集细胞。然后将细胞沉淀用铝箔包裹，于液氮中速冻。使用预冷的混合研磨仪，设定振动频率为 20 赫兹。将收获并冷冻的植物细胞材料研磨成细粉，持续两分钟。随后，在液氮环境中使用预冷设备，将研磨后的粉末每份分装三克，以防止样品解冻。然后，使用液氮预冷的研钵，将研磨好的粉末与三毫升预冷的裂解缓冲液一起研磨，直至样品解冻。立即将解冻后的样品分装到若干个两毫升的微量离心管中。在四摄氏度条件下，以 20,817 g 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。在样品离心的同时，每份样品分装 100 微升 IgG Sepharose 珠。加入 1 毫升裂解缓冲液，通过涡旋重悬珠子。在 2,000 ×g 下瞬时离心 3 秒，弃去裂解缓冲液。最后，将珠子重悬于400 µL裂解缓冲液中。离心后，取3 mL澄清的植物裂解液转移至15 mL锥形离心管中。将预平衡的珠子加入植物裂解液中，并在4 °C下于旋转仪上孵育混合物1小时。将混合物转移至连接在离心柱上的注射器中，该离心柱顶部装有35微米孔径的滤膜，并通过诱饵锁定盖固定于真空 manifold 上。开启真空泵，施加轻柔压力使裂解液通过装置，避免对磁珠造成损伤。未结合的裂解液被吸入 manifold 底部的废液站，而与磁珠结合的蛋白质复合物则保留在滤膜上。将细胞裂解液完全从注射器中排出后，加入10毫升洗涤缓冲液以洗涤磁珠。然后，加入1毫升洗脱缓冲液进行第二次洗涤步骤。现在，取下注射器和锁紧帽。关闭柱子的底盖，并向珠子中加入400微升含有50单位增强型烟草蚀刻病毒蛋白酶的洗脱缓冲液。将柱子置于摇床上，在16摄氏度下以1,000 rpm振荡30分钟。然后，向柱子中再加入50单位蛋白酶，并在与前一步骤相同的摇床条件下孵育混合物。接下来，取下底部盖帽，将层析柱放入一个 2 毫升的微量离心管中。在 20,817 g 离心 1 分钟以收集洗脱液，并继续进行蛋白质和代谢物的提取。开始提取时，向洗脱液中加入 1 毫升 3:1:1 的甲基叔丁基醚-甲醇-水溶剂。将试管倒置以混匀样品。随后，向混合物中加入 0.4 毫升一种甲醇-水溶液（比例为一至三），再倒置试管以混匀样品。然后，在室温下以 20,817 ×g 离心两分钟，使相分离。使用1毫升手动液体移液器，移除含有脂质的上层相。然后加入0.2毫升甲醇，倒置离心管以混匀样品。在室温下以20,817 ×g离心2分钟，收集极性相至新管中，用于代谢物检测。在离心管底部保留约 50 微升的极性相，以避免扰动蛋白质沉淀。接下来，将含有极性相的离心管置于离心浓缩仪中过夜干燥。将含有蛋白质沉淀的离心管干燥 30 至 60 分钟，以防止过度干燥。通过一步亲和纯化结合质谱技术，已鉴定出转基因拟南芥细胞培养物中的蛋白质-蛋白质及蛋白质-代谢物相互作用。与空载体、NDPK2 和 NDPK3 样品相比，表达 NDPK1 的细胞培养物在缬氨酸-亮氨酸、异亮氨酸-谷氨酸、亮氨酸-异亮氨酸以及异亮氨酸-苯丙氨酸中显示出显著富集。为了寻找已知的蛋白质-蛋白质和蛋白质-代谢物相互作用，将与 NDPK1 共洗脱的 13 种蛋白质和 4 种二肽在 STITCH 数据库中进行查询。主要的相互作用存在于APX1同源蛋白与醛脱氢酶家族之间，以及翻译起始因子FBR12与翻译起始因子2亚基α同源蛋白之间。所鉴定出的二肽目前尚未见报道有任何蛋白质互作伙伴。若操作得当，掌握该技术后可在四小时内完成实验。在进行该实验操作时，必须始终保持样品、仪器和试剂处于低温状态。完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法，如显微镜热泳法或活性测定，以确定分子间的直接相互作用，或推断其配体对蛋白质活性的影响。观看本视频后，您应能够充分掌握在整个实验过程中正确处理样品的方法，从而获得可靠的结果，并鉴定出目标蛋白质的配体。请注意，操作甲醇和甲基叔丁基醚（MTBE）溶液时可能具有极高危险性。应穿戴适当的个人防护装备，并始终采取预防措施，例如在通风橱内进行操作。

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