一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

该方法不仅可用于解答基础研究中的关键问题，还能通过鉴定重要蛋白质的新型小分子配体，为医学、制药和生物技术领域做出贡献。该技术的主要优势在于，能够在接近体内条件的情况下，对目标蛋白质及其代谢相关分子进行并行分析。该方法有助于筛选出相互作用的分子，而无需局限于预先选定的配体。

尽管该方法是为植物开发的，但也可应用于其他体系，如HeLa细胞、E.coli和S.Cerevisiae。首先，制备MSMO培养基，并用1摩尔氢氧化钾将pH值调节至5.7。然后，在121摄氏度下高压灭菌15分钟。

在实验开始前，将补充剂加入培养基中。现在，将转基因PSBL拟南芥细胞培养物在100毫升锥形瓶中的50毫升MSMO培养基中进行培养。然后，将锥形瓶置于旋转振荡摇床上，在光照条件下于20摄氏度以130 rpm的速度轻轻振荡培养细胞。

每七天将细胞以1:10的比例传代至新鲜培养基中。随后，使用装有尼龙滤网的玻璃漏斗置于锥形瓶上，并连接真空泵，于对数生长期收集细胞。然后将细胞沉淀用铝箔包裹，于液氮中速冻。

使用预冷的混合研磨仪，设定振动频率为 20 赫兹。将收获并冷冻的植物细胞材料研磨成细粉，持续两分钟。随后，在液氮环境中使用预冷设备，将研磨后的粉末每份分装三克，以防止样品解冻。

然后，使用液氮预冷的研钵，将研磨好的粉末与三毫升预冷的裂解缓冲液一起研磨，直至样品解冻。立即将解冻后的样品分装到若干个两毫升的微量离心管中。在四摄氏度条件下，以 20,817 g 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。

在样品离心的同时，每份样品分装 100 微升 IgG Sepharose 珠。加入 1 毫升裂解缓冲液，通过涡旋重悬珠子。在 2,000 ×g 下瞬时离心 3 秒，弃去裂解缓冲液。

最后，将珠子重悬于400 µL裂解缓冲液中。离心后，取3 mL澄清的植物裂解液转移至15 mL锥形离心管中。将预平衡的珠子加入植物裂解液中，并在4 °C下于旋转仪上孵育混合物1小时。

将混合物转移至连接在离心柱上的注射器中，该离心柱顶部装有35微米孔径的滤膜，并通过诱饵锁定盖固定于真空 manifold 上。开启真空泵，施加轻柔压力使裂解液通过装置，避免对磁珠造成损伤。未结合的裂解液被吸入 manifold 底部的废液站，而与磁珠结合的蛋白质复合物则保留在滤膜上。

将细胞裂解液完全从注射器中排出后，加入10毫升洗涤缓冲液以洗涤磁珠。然后，加入1毫升洗脱缓冲液进行第二次洗涤步骤。现在，取下注射器和锁紧帽。

关闭柱子的底盖，并向珠子中加入400微升含有50单位增强型烟草蚀刻病毒蛋白酶的洗脱缓冲液。将柱子置于摇床上，在16摄氏度下以1,000 rpm振荡30分钟。然后，向柱子中再加入50单位蛋白酶，并在与前一步骤相同的摇床条件下孵育混合物。

接下来，取下底部盖帽，将层析柱放入一个 2 毫升的微量离心管中。在 20,817 g 离心 1 分钟以收集洗脱液，并继续进行蛋白质和代谢物的提取。开始提取时，向洗脱液中加入 1 毫升 3:1:1 的甲基叔丁基醚-甲醇-水溶剂。

将试管倒置以混匀样品。随后，向混合物中加入 0.4 毫升一种甲醇-水溶液（比例为一至三），再倒置试管以混匀样品。然后，在室温下以 20,817 ×g 离心两分钟，使相分离。

使用1毫升手动液体移液器，移除含有脂质的上层相。然后加入0.2毫升甲醇，倒置离心管以混匀样品。在室温下以20,817 ×g离心2分钟，收集极性相至新管中，用于代谢物检测。

在离心管底部保留约 50 微升的极性相，以避免扰动蛋白质沉淀。接下来，将含有极性相的离心管置于离心浓缩仪中过夜干燥。将含有蛋白质沉淀的离心管干燥 30 至 60 分钟，以防止过度干燥。

通过一步亲和纯化结合质谱技术，已鉴定出转基因拟南芥细胞培养物中的蛋白质-蛋白质及蛋白质-代谢物相互作用。与空载体、NDPK2 和 NDPK3 样品相比，表达 NDPK1 的细胞培养物在缬氨酸-亮氨酸、异亮氨酸-谷氨酸、亮氨酸-异亮氨酸以及异亮氨酸-苯丙氨酸中显示出显著富集。为了寻找已知的蛋白质-蛋白质和蛋白质-代谢物相互作用，将与 NDPK1 共洗脱的 13 种蛋白质和 4 种二肽在 STITCH 数据库中进行查询。

主要的相互作用存在于APX1同源蛋白与醛脱氢酶家族之间，以及翻译起始因子FBR12与翻译起始因子2亚基α同源蛋白之间。所鉴定出的二肽目前尚未见报道有任何蛋白质互作伙伴。若操作得当，掌握该技术后可在四小时内完成实验。

在进行该实验操作时，必须始终保持样品、仪器和试剂处于低温状态。完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法，如显微镜热泳法或活性测定，以确定分子间的直接相互作用，或推断其配体对蛋白质活性的影响。观看本视频后，您应能够充分掌握在整个实验过程中正确处理样品的方法，从而获得可靠的结果，并鉴定出目标蛋白质的配体。

请注意，操作甲醇和甲基叔丁基醚（MTBE）溶液时可能具有极高危险性。应穿戴适当的个人防护装备，并始终采取预防措施，例如在通风橱内进行操作。