2在 1: 一步亲和纯化为蛋白质蛋白质和蛋白质代谢物的平行的分析
August 6th, 2018
蛋白质和蛋白质代谢物相互作用对所有细胞功能都至关重要。在这里, 我们描述了一个协议, 允许并行分析这些交互与蛋白质的选择。我们的协议优化了植物细胞培养, 并结合亲和纯化与质谱为基础的蛋白质和代谢物检测。
该方法不仅可以用于解决基础研究中的关键问题，还可以通过描绘必需蛋白质的新型小分子配体，为医学、制药和生物技术领域做出贡献。该技术的主要优点是，它能够在紧密体内条件下对蛋白质和所选蛋白质的代谢伴侣进行平行分析。这种方法有助于找出相互作用的分子，而不局限于预先选择的配体。
虽然这种方法是为植物开发的，但它也可以应用于其他系统，例如 HeLa 细胞、大肠杆菌和酿酒酵母。首先，制备 MSMO 培养基，并用 1 摩尔氢氧化钾将 pH 值调节至 5.7。然后，在 121 摄氏度下将溶液高压灭菌 15 分钟。
在实验开始前将补充剂添加到培养基中。现在，在 100 毫升烧瓶中的 50 毫升 MSMO 培养基中培养转基因 PSBL 拟南芥细胞培养物。然后，将培养瓶放在轨道平台摇床上，并在 20 摄氏度下在 20 摄氏度下以 130 rpm 的速度轻轻搅拌细胞。
每 7 天，在 1 至 10 种溶液的新鲜培养基中对细胞进行传代培养。接下来，使用安装在锥形瓶上的带有尼龙网的玻璃漏斗，连接到真空泵，在对数生长期收获细胞。然后，将干燥的细胞包裹在铝箔中，并在液氮中冷冻。
使用预冷混合型研磨仪，振动频率设置为 20 赫兹。将收获和冷冻的植物细胞材料均质化成细粉 2 分钟。接下来，使用液氮、预冷设备将每个样品中 3 克研磨粉末分装，以防止其解冻。
然后，使用预冷的液氮研钵，用 3 毫升冰冷的裂解缓冲液研磨研磨粉末，直至其解冻。立即将解冻的样品分成两毫升微量离心管。将样品在 4 摄氏度下以 20， 817 g 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。
离心样品时，每个样品分装 100 μL IgG 琼脂糖珠。加入 1 mL 裂解缓冲液，涡旋重新悬浮珠子。以 2， 000 g 的浓度快速离心 3 秒，然后丢弃裂解缓冲液。
最后，将磁珠重悬于 400 μL 裂解缓冲液中。离心后，将 3 毫升透明植物裂解物转移到 15 毫升锥形离心管中。将预先平衡的珠子添加到植物裂解物中，并在 4 摄氏度下在旋转轮上孵育混合物 1 小时。
将混合物转移到注射器中，注射器连接到离心柱上的诱饵锁定盖上，真空歧管顶部有一个 35 微米孔径的过滤器。通过打开真空泵，轻轻按压，使裂解液通过装置，以避免对微珠造成伤害。未结合的裂解物被排入位于歧管底部的地方，与磁珠结合的蛋白质复合物保留在过滤器上。
将注射器从细胞裂解物中排空后，加入 10 mL 洗涤缓冲液以洗涤微珠。然后，加入毫升洗脱缓冲液进行第二个洗涤步骤。现在，取下注射器和诱饵锁帽。
盖上色谱柱的底盖，向磁珠中加入 400 微升洗脱缓冲液，其中含有 50 单位的增强型烟草蚀刻病毒蛋白酶。将色谱柱放在台式摇床上，在 16 摄氏度下以 1， 000 rpm 的速度放置 30 分钟。然后，向柱中再加入 50 单位的蛋白酶，并像上一步一样在摇床上孵育混合物。
接下来，取下底盖，将色谱柱更换到 2 mL 微量离心管中。以 20， 817 g 离心 1 分钟以收集洗脱液并继续提取蛋白质和代谢物。开始萃取时，向洗脱液中加入 1 毫升 3：1 的 MTBE 甲醇水溶剂。
倒置试管以混合到样品中。接下来，向混合物中加入 0.4 毫升 1 至 3 甲醇水溶液，倒置试管以混合样品。然后，在室温下以 20， 817 g 离心样品 2 分钟，以允许相分离。
使用 1 mL 手动液体处理移液器，去除含有脂质的上层相。然后，加入 0.2 mL甲醇，倒置试管以混合样品。在室温下以 20， 817 g 离心 2 分钟，并将极性相收集在新试管中用于代谢物测量。
在试管底部留下大约 50 μL 的极性相，以避免蛋白质沉淀脱落。接下来，在离心蒸发器中干燥含有极性相的试管过夜。将蛋白沉淀管干燥 30 至 60 分钟，以避免过度干燥。
使用一步亲和纯化，结合质谱法，已经确定了转基因拟南芥细胞培养物中的蛋白质-蛋白质和蛋白质-代谢物相互作用。与空载体、NDPK2 和 NDPK3 样品相比，表达 NDPK1 的细胞培养物在缬氨酸-亮氨酸、异亮氨酸谷氨酸、亮氨酸异亮氨酸和异亮氨酸苯丙氨酸中显示出显著富集。为了寻找已知的蛋白质 - 蛋白质和蛋白质 - 代谢物相互作用，根据缝合数据库对 13 种与 NDPK1 共洗脱的蛋白质和 4 种二肽进行了酷儿研究。
APX1 直系同源物与醛脱氢酶家族以及翻译起始因子 FBR12 与翻译起始因子两个亚基 α 同源物之间存在主要关联。鉴定的二肽显示没有报道的蛋白质伴侣。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。
在尝试此程序时，在整个实验过程中保持样品、设备和试剂的低温非常重要。按照此程序，可以进行其他方法，如显微镜热泳或活性测定，以确定分子之间的直接相互作用或它们的配体对蛋白质活性的推断。观看本视频后，您应该对如何在整个过程中处理样品有很好的了解，以获得可靠的结果并识别所选蛋白质的配体。
不要忘记，使用甲醇和 MTBE 溶液可能非常危险。应穿戴适当的个人防护装备，并在执行此程序时始终采取预防措施，例如在通风橱下工作。
概述
本文介绍了一种针对植物细胞培养优化的蛋白质-蛋白质和蛋白质-代谢物相互作用的并行分析协议。该方法结合了亲和纯化和质谱分析，以识别体内相互作用的分子。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 细胞生物学
- 植物科学
背景
- 蛋白质相互作用对细胞功能至关重要。
- 了解这些相互作用可以推进各个领域的研究。
- 该方法适用于不同的生物系统。
- 它允许发现对关键蛋白质的新配体。
研究目的
- 开发一种分析蛋白质和代谢物相互作用的方法。
- 增强对植物细胞代谢机制的理解。
- 提供一个可以应用于其他系统的协议，不仅限于植物。
使用的方法
- 准备MSMO培养基和转基因拟南芥细胞培养的生长。
- 收获和使植物细胞材料均质化。
- 使用IgG琼脂糖珠进行亲和纯化。
- 用于蛋白质和代谢物检测的质谱分析。
主要结果
- 在表达NDPK1的细胞中识别出显著的蛋白质-代谢物相互作用。
- 使用stitch数据库发现共洗脱的蛋白质和二肽。
- 特定蛋白质和代谢化合物之间的显著关联。
- 该方法可以在大约四小时内完成。
结论
- 该协议能够高效分析蛋白质相互作用。
- 它可以在各种生物学研究环境中使用。
- 保持冷条件对样本完整性至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables parallel identification of protein-protein and protein-metabolite interactions in near-physiological conditions, supporting target validation and ligand discovery in early discovery workflows. By capturing endogenous complexes without pre-selection bias, it enhances predictive confidence in lead identification and reduces mechanistic ambiguity in drug target assessment. The approach is adaptable across biological systems, offering a scalable tool for de-risking therapeutic hypotheses in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping endogenous protein and metabolite interaction networks.
- Operational Value: Provides functional target validation data under near-native conditions, reducing false positives through empty-vector controls.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying co-eluting metabolites and proteins that inform target engagement and pathway context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares affinity-purified complexes for downstream MS analysis, generating quantitative interaction profiles.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via one-step extraction, improving reproducibility across runs.
- Screening Readiness: Outputs compatible with UPLC-MS/MS enable scalable compound screening against identified ligands.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase interaction data to preclinical validation by identifying disease-relevant metabolites and proteins.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct target modulation or off-target metabolic effects.
- Biomarker Alignment: Detected metabolites (e.g., valine-leucine, isoleucine glutamate) may serve as translational biomarkers when correlated with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to lead identification, delivering interaction data that informs hit-to-lead progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing unbiased protein and metabolite partners of bait proteins in cellular lysates.
- Screening: Generates metabolite and protein readouts that can be used to assess compound interference or stabilization of complexes.
- Analytics: Delivers quantitative UPLC-MS/MS outputs enabling comparison of interaction strength across conditions or genetic backgrounds.
- Translational Research: Links molecular interactions to metabolic pathways, supporting biomarker-driven advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Protocol can be standardized across model systems (e.g., HeLa, E. coli, yeast) for cross-project consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by validating interactions in near-vivo conditions, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: One-step MTBE/methanol/water extraction simplifies workflow, enhancing reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by identifying metabolic liabilities or co-factors that modulate target activity.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on interaction network robustness and ligand diversity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in affinity purification, metabolite extraction, and mass spectrometry-based proteomics and metabolomics.
- Depends on access to UPLC-MS/MS systems and centrifugation equipment capable of 20,817 g.
- Necessitates cross-team standardization of lysis, wash, and elution conditions to ensure reproducibility across laboratories.
- Adaptation to non-plant systems requires validation of lysis buffer compatibility and tag accessibility in mammalian or microbial lysates.
- Practical limitations include metabolite volatility during extraction and potential interference from abundant cellular proteins or lipids.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Preparation of Plant Cell Material
1:55
Tandem Affinity Purification (TAP)
4:59
Metabolite and Protein Extraction
6:15
Results: Simultaneous Characterization of Protein-Protein and Protein-Metabolite Interactions Employing a Single-Step Tandem Affinity Purification Coupled with Mass Spectrometry
7:23
Conclusion
