Name: Interneuron 前体 Homochronic 移植早期小鼠脑的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学习从小鼠幼崽纹状体和海马体分离中间神经元前体并进行同时间移植的技术。该方法用于研究环境变化如何影响神经元的命运决定与成熟过程，为发育神经科学提供重要工具。

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本研究由美国国立卫生研究院（K99MH104595）和美国国立儿童健康与人类发展研究所的院内研究项目资助，资助对象为 T.J.P。我们感谢 Gord Fishell，本方法最初是在他的实验室中建立的。

所有实验操作均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）指南进行，并经国家儿童健康与人类发育研究所动物护理与使用委员会（NICHD Animal Care and Use Committee, ACUC）批准。下述方案利用Nkx2.1-CreC/+;Ai9+/-幼鼠获取由内侧神经节隆起（MGE）来源的中间神经元前体细胞，但该方法也可应用于任何所需的荧光报告小鼠品系。供体和受体组织均无差别地使用雄性和雌性出生后早期小鼠（P0-P2）。
1. 溶液配制
<ol>
	<li>根据以下配方配制蔗糖人工脑脊液（sACSF，单位为 mM）：87 NaCl，26 NaHCO3，2.5 KCl，1.25 NaH2PO4，0.5 CaCl2，7 MgCl2，10 葡萄糖，75 蔗糖，用 95% O2 和 5% CO2 混合气体饱和，pH = 7.4。</li>
	<li>根据最终所需体积（500 mL sACSF 可满足 1–2 窝动物使用），取 350 mL 纯 ddH2O 倒入烧杯中，加入磁力搅拌子，并将烧杯置于磁力搅拌器上。</li>
	<li>依次称取所有盐类（NaCl、NaHCO3、KCl、NaH2PO4、葡萄糖、蔗糖），并按照下表加入水中。根据最终所需体积可相应调整用量。
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
		<tbody>
			<tr>
				<td>试剂</td>
				<td>分子量 </td>
				<td>浓度 (mM)</td>
				<td>克/500 mL</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>氯化钠</td>
				<td>58.44</td>
				<td>87</td>
				<td>2.54</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>碳酸氢钠</td>
				<td>84.01</td>
				<td>26</td>
				<td>1.09</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>氯化钾</td>
				<td>74.55</td>
				<td>2.5</td>
				<td>0.09</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>磷酸二氢钠</td>
				<td>119.98</td>
				<td>1.25</td>
				<td>0.08</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>葡萄糖</td>
				<td>180.16</td>
				<td>10</td>
				<td>0.9</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>蔗糖</td>
				<td>342.3</td>
				<td>75</td>
				<td>12.84</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>在加入适量 CaCl2（配制 500 mL sACSF 时，加入 1 M 溶液 0.25 mL）和 MgCl2（配制 500 mL sACSF 时，加入 1 M 溶液 3.5 mL）之前，先用 95% O2 和 5% CO2 混合气体（碳合氧）对溶液持续通气至少 20–30 分钟。</li>
	<li>使用标准 pH 计检测 pH 值。若配制正确，溶液 pH 应为 7.4。</li>
	<li>将溶液转移至量筒中，用纯 ddH2O 定容至 500 mL。</li>
	<li>sACSF 可提前 1–2 天配制。使用前置于冰上，并在开始解剖前用碳合氧持续通气至少 15 分钟；整个解剖过程中应保持 sACSF 瓶持续通气。</li>
</ol>
2. 解剖准备
<ol>
	<li>以下工具应进行灭菌/高压灭菌处理：至少一把小型精细锋利的剪刀、两把精细镊子（型号 #5）、弯头精细镊子、脑切片模具以及若干刀片。可选择性准备一把小刮勺，用于从颅骨中取出脑组织。</li>
	<li>在解剖显微镜附近设置工作台，配备培养皿（直径 9 cm 和 4 cm）、50 mL 锥形塑料离心管（用于收集分离的脑区）以及大口径塑料移液管，所有器具均需置于冰上。准备多个装有通入碳酰气的冰冻 sACSF 的 50 mL 离心管。若需分离多个脑区，务必对收集管和转移&#160;移液管进行准确且清晰的标记，以避免交叉污染。</li>
	<li>另备一个冰桶，用于通过低温实现幼鼠的冰麻醉，并准备适当的危险废物袋以处理动物尸体。</li>
	<li>准备经火焰抛光的玻璃巴斯德移液管，用于组织吹打。使用本生灯对移液管尖端进行灭菌并塑形。准备几种不同口径的移液管：大口径（约 600 µm）、中口径（约 300 µm）和小口径（约 100 µm）。用水测试各尖端的液体流速，以确保获得不同的吹打速度。每种脑区分离过程中，每种规格的移液管至少需使用一根，但建议为每种口径多准备几根，以防尖端堵塞或破损。</li>
</ol>
3. 移植准备
<ol>
	<li>使用电极拉制仪制备尖端细小的玻璃微电极。将尖端折断或打磨，形成锐角尖端，尖端直径约为 ~20-40 &#181;m使用显微镜目视检查尖端，确保无灰尘或残留的玻璃颗粒堵塞孔口。</li>
	<li>使用细针注射器将矿物油完全注入玻璃微量移液管中。将微量移液管插入Nanoject装置（或其他显微注射设备）中。对于Nanoject III，设置以下程序：体积 = 60 nL，速率 = 30，循环次数 = 25，延迟时间 = 1 s。</li>
	<li>将Nanoject固定在连接于磁性底座的操纵器上，并调节操纵器，使Nanoject垂直向下，不沿x轴或y轴倾斜。</li>
	<li>在盖子顶部粘附一些粘性橡皮泥（P0-P2幼鼠使用约1-2 cm）&#160;培养皿形成一个抬高的表面，用于支撑幼鼠的头部。</li>
	<li>剪下长约6-8 cm的实验室胶带条，在中间剪出一个菱形孔。该胶带将在操作过程中用于固定幼鼠头部，同时拉伸皮肤，便于清晰观察解剖标志和目标区域。</li>
	<li>在注射工作站旁准备好加热垫，开始注射前将其调至“低”档。用一些纸巾或尿布垫覆盖在加热垫上。</li>
	<li>若需进行多种移植处理，应准备好小型剪刀，以便通过剪趾或剪尾标记接受不同注射的幼鼠。</li>
</ol>
4. P0-P2 小鼠脑组织的取出
<ol>
	<li>在开始操作前，将数个培养皿中装入冰冷的、充氧的sACSF。同时，在收集管中加入约25 mL sACSF。</li>
	<li>用Parafilm或手套包裹一只P0-P2日龄的幼鼠，并将其完全覆盖后置于冰上。设置计时器为5分钟并开始计时。计时结束后取出幼鼠，检查其对后肢足底夹捏无反应。</li>
	<li>将幼鼠断头，将头部放入盛有sACSF的培养皿中。沿中线切开皮肤以暴露颅骨。</li>
	<li>找到位于后脑/脊髓连接处的颅骨开口，将镊子一端沿颅骨背侧插入。轻轻夹住颅骨中线部位，向两侧“剥离”颅骨碎片以暴露脑组织，注意避免损伤脑组织。</li>
	<li>去除颅骨的背侧和侧部后，使用镊子或刮匙从脑腹面下方轻轻托起，将脑组织完整取出，注意避免任何区域受损。将脑组织放入另一个盛有充氧sACSF的培养皿中。 
	&#160; 
	注意：我们提供两种不同的方法用于分离海马、纹状体和皮层。第一种方法（步骤5.1-5.10）适用于任何小鼠品系；而第二种方法（步骤6.1-6.7）需要使用荧光报告小鼠，以便清晰区分纹状体与苍白球及其他脑区结构。若无需纹状体，则可忽略两种方法中针对纹状体的操作步骤</li>
</ol>
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57723/57723fig1.jpg" /> 
图 1：脑组织解剖的示意图与图像，方法 #1 
本图描述了步骤 5.1–5.10 中的解剖技术。若需获取纹状体组织，将 P1 期脑组织腹侧朝上置于脑切片模具中，将剃刀刀片插入模具槽内，从前脑方向切入，以获得穿过纹状体的冠状切面。从两侧半球中取出纹状体组织块，对所有位于海马体前方且包含纹状体的切片重复此操作。若无需纹状体组织，可直接将脑组织沿中线切为两半，将半脑内侧朝上放置于培养皿中，去除腹内侧脑结构（如丘脑、基底神经节等），以暴露海马体。使用镊子夹取海马体，随后将半脑翻转，再用镊子分离出一块皮层组织。示意图半脑中的垂直黑线表示切除纹状体组织时的切割位置。比例尺 = 500μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57723/57723fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 收集纹状体、海马和皮层，技术 #1
<ol>
	<li>将完整脑组织置于切片模具上，腹面朝上。将1片刀片穿过脑组织最前部（穿过前嗅束）。</li>
	<li>在第一片刀片后方紧邻处插入另一片刀片，以制备厚度为0.5 mm的脑片，并在该刀片后方再放置一片刀片。</li>
	<li>将这些脑片转移至含有碳氧饱和人工脑脊液（sACSF）的培养皿中，将剩余脑组织放入另一盛有sACSF的培养皿中。将纹状体脑片转移至解剖显微镜下以观察纹状体。这些脑片应包含大部分前纹状体区域，并不包含海马体。使用荧光解剖显微镜观察Nkx2.1-Cre+/-;Ai9+/-小鼠来源的脑片，以区分纹状体微弱的tdTomato荧光信号与苍白球强烈的tdTomato信号。</li>
	<li>无论是否使用荧光观察，均从所有切片的双侧半脑中夹取纹状体组织，并将纹状体组织块转移至标记正确的含sACSF的50 mL离心管中，置于冰上保存。</li>
	<li>使用镊子或刀片沿中线将脑组织纵向切开，将半脑组织放置成内侧面向上。</li>
	<li>用镊子夹除腹侧脑组织（丘脑、基底神经节等）。操作完成后，应清晰可见海马体（沿背侧皮层前后轴延伸的香肠状结构）以及皮层的脑室面。</li>
	<li>为分离海马体，将镊子尖端插入前部海马体前方，然后向后移动镊子并沿海马体-皮层边界轻轻夹取，从而将海马体与皮层分离。将分离出的海马体转移至标记正确的含sACSF的50 mL离心管中，置于冰上保存。</li>
	<li>为分离皮层组织，将半脑皮层内侧面朝下放置。然后用镊子夹除皮层最背侧、腹侧、前侧和后侧部分，保留一块约2 mm × 2 mm的内侧体感皮层组织块。翻转皮层使其内侧面朝上，必要时用镊子清除内侧面上残留的非皮层组织（如丘脑、基底神经节等）。将皮层组织块转移至标记正确的含sACSF的50 mL离心管中，置于冰上保存。</li>
	<li>对另一侧半脑重复上述操作，以收集双侧海马体和皮层组织。</li>
	<li>对所有幼鼠重复此操作，每次更换幼鼠时务必更换培养皿中的sACSF，以确保sACSF保持低温且新鲜。</li>
</ol>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57723/57723fig2.jpg" /> 
图2：脑组织解剖的示意图与图像，方法#2 
本图展示步骤6.1–6.7中描述的解剖技术。将脑组织背侧朝上固定于解剖皿中。向前剥离皮层后，可清晰观察到海马和纹状体，可将其取出；随后可按前述方法取下一部分皮层组织。根据转基因小鼠品系的不同，可进一步清理纹状体，去除苍白球及其他周围组织。在Nkx2.1Cre;Ai9小鼠品系中，苍白球的番茄荧光蛋白阳性（tomato+）细胞密度显著高于纹状体。比例尺 = 500 μm。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57723/57723fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
6. 收获纹状体、海马和皮层，技术 #2
<ol>
	<li>将脑腹侧朝下放置于含有sACSF的硅胶包被培养皿中，并通过小脑和前额叶皮层或嗅球用针固定。</li>
	<li>从一侧半球开始，使用弯头镊子轻轻分离后部皮层与其下方的海马及其他组织。将剥离的皮层轻轻展平于培养皿中。对另一侧半球重复此操作。在暴露的脑组织中，海马和纹状体应清晰可见。</li>
	<li>用镊子在中线处夹住一侧海马，向侧方轻轻剥离以取出。放入冰上预冷的收集管中，并对另一侧海马重复此操作。</li>
	<li>对于纹状体，先用工具轻轻刮除其周围边缘组织以松动纹状体，然后从下方夹取将其移除，并加入冰上预冷的收集管中。对另一侧纹状体重复此操作。</li>
	<li>皮层组织可按照步骤5.8所述方法进行采集。</li>
	<li>若使用转基因报告小鼠品系（例如 Nkx2.1-Cre;Ai9、Lhx6-GFP 等），将纹状体转移至含sACSF的培养皿中，在荧光解剖显微镜下观察。使用镊子去除纹状体上附着的非纹状体组织（在 Nkx2.1-Cre;Ai9 小鼠中，需去除所有“明亮”组织，因为苍白球来源于MGE的tdTomato+细胞密度显著高于纹状体）。对所有纹状体样本重复此步骤。</li>
	<li>对所有仔鼠重复此操作，每次更换仔鼠后需更换培养皿中的sACSF，以确保sACSF保持低温且新鲜。</li>
</ol>
7. 制备单细胞悬液
<ol>
	<li>解剖完成后，称取 10 mg Pronase，溶于 10 mL 碳酸化 sACSF 中，配制 1 mg/mL 的 Pronase 溶液。</li>
	<li>将组织从 50 mL 收集瓶转移至含有 2 mL Pronase-sACSF 溶液的 5 mL 圆底管中。室温孵育 20 分钟，在孵育过程中用手指轻摇或轻弹管壁 3–4 次，以混匀样品。</li>
	<li>在孵育期间，配制重建溶液：在 10 mL 碳酸化 sACSF 中加入 1% FBS（100 μL）和 DNAse（1 μL 的 1:10,000 储存液 DNAse）。</li>
	<li>20 分钟后，小心移除 Pronase 溶液，避免扰动底部的组织，并用 1–2 mL 重建溶液替代（总体积取决于起始组织量）。</li>
	<li>使用预先拉制并火焰抛光的巴斯德移液管通过吹打对组织进行机械解离。先用大口径（约 600 µm）移液管至少吹打 10 次，使组织充分分散。注意避免在溶液中引入气泡。随后依次使用中等口径和小口径移液管重复此操作。最终溶液应呈浑浊状，收集管中不应有可见的清晰组织块。</li>
	<li>将细胞裂解液通过 50 µm 滤膜转移至 5 mL 圆锥形管中，以去除任何细胞团块。所得单细胞悬液可直接用于流式细胞术分析（若无需分选，也可直接进行细胞计数）。</li>
</ol>
8. 准备用于移植的FACS纯化细胞悬液
<ol>
	<li>从流式细胞仪接收到细胞悬液后，将溶液转移至一个（或多个）1.5 mL离心管中，在4oC条件下以500 g离心5分钟。离心结束后，弃去上清液，保留约20–40 µL液体于管中。用剩余液体重悬细胞（若使用多个离心管，需合并所有溶液）。</li>
	<li>取一小块Parafilm，将2 µL细胞悬液、8 µL sACSF和10 µL台盼蓝染液混合均匀。用移液器吸取10 µL混合液加入血细胞计数板，并盖上盖玻片。</li>
	<li>使用标准实验室手动计数器，在血细胞计数板四个角的4×4方格区域内分别计数活细胞数量（死细胞因染色呈蓝色），取四个区域计数的平均值。将该平均值乘以100，得到每微升（µL）中的细胞数量。</li>
	<li>如需调整，将细胞浓度调节至重悬液中10,000–30,000个细胞/µL。最终浓度取决于细胞总量及所需移植次数。细胞在移植过程中应始终保持在冰上。</li>
</ol>
9. 移植至 P0-2 野生型幼鼠
<ol>
	<li>用石蜡膜或手套包裹一只野生型幼鼠，并将其完全覆盖后置于冰上。设置计时器为5分钟并开始计时。时间结束后取出幼鼠，检查其对后肢足垫的夹捏是否无反应。</li>
	<li>在幼鼠处于冰上期间，通过反复吹打细胞悬液数次以充分混匀细胞，确保在加样前细胞悬液均匀（每次注射前均需在加样前混匀细胞）。随后排空微量移液器中的石蜡油，并完全填充细胞悬液。</li>
	<li>将麻醉后的幼鼠放置于培养皿中，使其头部置于黏性橡皮泥上，以保证头部顶部相对平坦。将带有菱形孔的胶带覆盖在幼鼠头部，拉紧胶带，确保皮肤被拉平、头部稳固，同时保证小鼠舒适且呼吸顺畅。菱形孔下应能清晰看到人字缝（Lambda）位置。</li>
</ol>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57723/57723fig3.jpg" /> 
图3：移植的示意图与图像&#160; 
(A) 注射装置的照片。请注意，lambda点可通过幼鼠颅骨清晰可见，应以此作为微量移液管归零的参考点。比例尺 = 1 英寸。(B) 靶向海马体注射操作的示意图。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57723/57723fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>将固定好的幼鼠移至Nanoject下方，降低微量移液管，使其尖端正对λ点。记录操纵器上的x-y坐标。</li>
	<li>调节操纵器旋钮，将微量移液管移动至头部中线-侧线和前后轴上的目标坐标：S1皮层 → 前向1.0 mm，侧向1.0 mm；海马 → 前向0.75-1.0 mm，侧向1.0-1.2 mm；纹状体 → 前向2.0-2.2 mm，侧向1.5 mm。可根据幼鼠年龄（如P0与P2）或小鼠品系（如P2时CD1小鼠比C57/B6更大）对坐标进行微调。</li>
	<li>缓慢降低微量移液管，直至其在皮肤表面形成微小凹陷。然后牢固但轻柔地转动z轴操纵器旋钮，使移液管穿透皮肤和颅骨进入脑组织。当移液管进入脑内时，颅骨上的压力会释放，凹陷随之消失。</li>
	<li>轻微回撤微量移液管，直至其尖端被呈帐篷状的皮肤锥形包围。读取z轴坐标：此即z轴零点。</li>
	<li>将微量移液管降至目标深度：皮层 → 0.75-1.0 mm，海马 → 1.2-1.5 mm，纹状体 → 2.0-2.5 mm。可根据幼鼠年龄或品系对深度进行微调。</li>
	<li>使用上述Nanoject III程序注入细胞悬液。注射程序完成后，等待15-20秒，再缓慢回撤微量移液管，以尽量减少溶液从注射部位泄漏。</li>
	<li>若进行双侧注射，需重新在λ点上方将微量移液管归零，并移至对侧半球的正确坐标。或者，也可在同一半球的皮层进行两次注射，方法是将移液管向前移动1 mm至第一次注射位点前方。</li>
	<li>移植完成后，取下胶带，将幼鼠转移至加热垫上。如有需要，可通过剪尾或剪趾对幼鼠进行标记。待幼鼠恢复红润并开始活动后，将其放回母鼠所在的笼中。</li>
</ol>

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<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案的一个关键方面是最大限度地提高细胞的存活率。必须确保组织和细胞始终处于冰上预冷并通入碳酰气的sACSF溶液中，以促进细胞存活。这需要采用高效的解剖和分离策略，以尽量缩短细胞在各种溶液中以及脱离脑内环境的时间。根据所解剖和移植的脑区数量，由合作者协助完成解剖和/或移植步骤可能有助于缩短实验时长。&#160;为确保幼鼠的健康与存活，还必须尽量缩短冰麻醉时间（&#60; 4 min），并在移植过程中使用光源保持幼鼠体温。
移植后的大脑可能存在显著差异，有些大脑中可能不含任何移植物细胞，而另一些则可能含有数千个细胞。将多个P0-P2日龄的整窝幼鼠合并进行解剖，可增加收获的细胞数量，从而允许提高移植细胞密度和/或增加接受移植的幼鼠数量，这两者均可提高移植成功的可能性。为了准确靶向目标脑区，关键在于固定幼鼠头部，确保在将微移液管插入大脑过程中头部不发生移动。头部的任何位移或微移液管杆的弯曲都可能导致靶向错误和注射不准确（例如细胞丢失至侧脑室）。此外，每只幼鼠进行多个注射位点（单侧或双侧）操作，可在某一注射位点出现靶向偏差时提高成功率。未来，开发一种更高效的立体定位策略以稳定幼鼠并实现更精...

正常的大脑皮层功能依赖于兴奋性投射神经元与抑制性GABA能中间神经元之间的平衡，后者是一类高度异质性的细胞群体，具有不同的形态学特征、电生理特性、连接方式以及神经化学标记。中间神经元（以及特定的中间神经元亚群）发育和功能的异常已被证实与精神疾病（如精神分裂症、自闭症和癫痫）的发病机制相关1,2,3。此外，许多与这些脑部疾病相关的基因在年轻的中间神经元中显著富集4。因此，深入理解调控中间神经元命运决定和成熟过程的分子机制，对于阐明正常脑发育过程以及多种脑部疾病的潜在病因至关重要。
前脑中间神经元主要起源于两个短暂存在的胚胎结构，即内侧和尾侧神经节隆起（MGE 和 CGE）。这些有丝分裂后的细胞（中间神经元前体）随后经历一个漫长的切向迁移阶段，扩散至端脑各区域，并整合到多种神经环路中。MGE 来源的中间神经元主要包括三个在神经化学特性上基本不重叠的亚群：快速放电型小清蛋白（PV+) 中间神经元，非快速放电的生长抑素（SST+）中间神经元，以及晚期放电的神经元型一氧化氮合酶（nNOS）+）构成海马神经胶质细胞和常春藤细胞的中间神经元。多个实验室已鉴定出位于MGE内调控PV初始命运决定的多种机制+ 或SST+中间神经元，包括形态发生素的空间梯度、中间神经元前体的出生时间以及神经发生性分裂方式5,6,7,8,9,10有研究提出，中间神经元最初分化为“基数类别”，随后在与环境相互作用的过程中逐步成熟为“确定类别”。11最近的证据表明，某些成熟的中间神经元亚型可能在神经节隆起中成为有丝分裂后细胞时即已由基因决定，提示早期确定的内在遗传程序可能比以往认为的发挥更大作用12,13然而，内在遗传程序如何与环境信号相互作用以驱动分化为不同类型的中间神经元，这一关键问题在很大程度上仍未被探索。
大量研究已将胚胎期MGE细胞直接移植到多种脑区，普遍结果表明，移植的细胞能够成熟并释放GABA，从而广泛抑制局部内源性神经环路14,15,16,17,18,19。这些令人鼓舞的观察结果激发了人们利用人诱导多能干细胞（hIPSC）来源的中间神经元治疗多种脑部疾病的浓厚兴趣。然而，极少有研究评估这些移植细胞是否成熟为预期类型的成熟中间神经元，而在考虑转化应用时，这一点至关重要。
为了研究环境如何影响中间神经元的分化与成熟，研究人员设计了一种策略，即将未成熟的中间神经元前体细胞移植到新的脑环境中，以检测移植的中间神经元是获得宿主环境的特征，还是保留供体环境的特征20。MGE移植不适合用于回答这一问题，因为MGE包含混合的中间神经元和GABA能投射细胞，这些细胞会分散到多个脑区21。由于无法确定这些MGE细胞原本的迁移路径，因此难以全面评估脑环境对这些移植细胞的影响。通过在出生后早期时间点获取中间神经元前体细胞，可以避开这一问题，获得已完成迁移并到达目标脑区但与环境相互作用极少的未成熟细胞。通过聚焦于在不同脑区间差异表达的中间神经元特定特征，即可确定宿主环境如何改变中间神经元的特性。本方案中概述的通用方法适用于任何希望研究年轻神经元在新环境中受到挑战时行为特征的研究人员。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>脑切片矩阵</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>仅在分离纹状体时需要</td></tr><tr><td>精细尖头杜蒙镊</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>手动操作器（带支架）</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 圆底塑料管</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>ThermoFisher</td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 μm 滤膜</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

同龄期中间神经元前体细胞移植至出生后早期小鼠大脑

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

神经元命运的决定与成熟过程需要遗传程序与环境信号之间复杂的相互作用。然而，解析调控这一分化过程的内在机制与外在机制各自所起的作用，是所有发育神经生物学家面临的一大难题。这一问题在GABA能中间神经元中尤为突出，这类细胞群体具有极高的异质性，起源于短暂存在的胚胎结构，并经历漫长的迁移阶段，最终分布于端脑各区域。为了探究不同脑区环境如何影响中间神经元的命运与成熟，我们建立了一种从小鼠出生后早期（P0-P2）特定脑区获取荧光标记的未成熟中间神经元前体细胞的实验方案。在该发育阶段，中间神经元的迁移基本完成，这些细胞已到达其最终定位的脑区环境，且突触整合程度相对较低。通过流式细胞术获得单细胞悬液后，将这些中间神经元前体细胞移植至出生后P0-P2期的野生型幼鼠脑内。通过实施同位移植（例如皮层到皮层）或异位移植（例如皮层到海马），研究人员可评估将未成熟中间神经元置于新的脑环境后，其命运决定、成熟过程及神经环路整合能力所受到的影响。成年小鼠脑组织可被采集，并对移植细胞进行多种后续分析，包括免疫组织化学、电生理记录以及转录组学分析。该通用策略为研究者提供了一种有效手段，用以检测不同脑区环境如何影响神经元发育的多个方面，并判断特定神经元特性主要由固有的遗传程序决定，还是受环境信号主导。

本方案展示了如何从早期出生后脑组织中分离特定脑区（图1-2），获取中间神经元前体细胞的单细胞悬液，并将这些细胞移植到未处理的野生型出生后幼鼠的不同脑区（图3）。对于移植后的分析，于P30-35期间获取接受中间神经元前体细胞移植的脑组织，以表征细胞形态、神经化学标志物及电生理特性。此类分析通常在正常小鼠P21-P30阶段进行，但由于解剖和解离操作可能导致移植细胞的成熟略有延迟，因此建议额外等待5-10天，以补偿这种成熟延迟。所进行分析的类型将决定脑组织采集的适当策略。值得注意的是，我们未观察到特定中间神经元亚群出现选择性细胞死亡，从而不会对某些亚型产生偏向性20。
进行免疫组织化学分析时，用4%多聚甲醛灌注小鼠并取出脑组织。通过目标脑区制备50 μm的振动...

在新的脑区中对年轻神经元进行挑战，可以揭示环境如何塑造神经元命运和成熟过程的重要见解。本方案描述了一种从特定脑区分离中间神经元前体细胞，并将其同位或异位移植到出生后幼鼠脑内的实验方法。

神经元命运决定与成熟过程需要遗传程序与环境信号之间复杂的相互作用。然而，解析……

本实验的总体目标是从出生后小鼠幼崽的不同脑区分离出中间神经元前体细胞，并将这些细胞移植到年龄相匹配的受体动物中，以评估环境变化如何影响中间神经元的命运和成熟过程。该方法有助于解答发育神经科学领域中的关键问题，即内在遗传程序与外部环境信号如何相互作用，共同调控神经细胞命运的形成。该技术的主要优势在于，可在中间神经元前体细胞被过继移植至新的脑环境后，对其命运决定和成熟过程的改变进行分析。细胞收获和移植步骤的可视化演示至关重要，因为技术上的微小误差都可能导致移植实验效率低下甚至失败。首先，将一片刀片穿过出生后第一天幼鼠脑的前额叶，再将其他刀片插入第一片刀片后方的切口中，以制备两片厚度为0.5毫米的脑片。将纹状体脑片转移至含有通氧蔗糖人工脑脊液（sACSF）的培养皿中，同时将剩余的脑组织置于另一含有sACSF并置于冰上的培养皿中。将脑片置于解剖显微镜下，用镊子从两侧半球夹取纹状体，并在收获过程中将纹状体组织块放入盛有冰上sACSF的50毫升离心管中。若脑组织来自荧光报告小鼠，请使用荧光显微镜区分纹状体的td-tomato信号与苍白球更强的荧光信号。为分离海马体，用镊子沿中线将脑组织纵向切开，取一侧半球置于解剖显微镜下，使内侧面向上。使用镊子去除腹侧脑组织，并识别呈香肠状、沿皮层背侧和脑室侧前后走向延伸的海马体。将镊子尖端置于前部海马体前方，边夹住海马体与皮层的边界，边向后推进镊子，轻柔地将海马体从皮层分离。将分离的组织置于盛有冰上 sACSF 的 50 毫升离心管中，并对对侧半球重复进行海马体采集操作。然后将半切的皮层内侧朝下放置，用镊子去除皮层最背侧、腹侧、前侧和后侧的部分。将剩余的内侧皮层方块转移至含有冰上预冷的sACSF的50毫升离心管中。取出脑组织后，通过小脑和前皮层或嗅球将脑腹侧朝下固定。使用弯头镊子，轻轻将每个半球的后部皮层与下方的海马及其他组织分离。然后将背侧皮层向前剥离，以暴露下方结构。用镊子在中线处夹住一侧半球的海马，并通过向外侧剥离的方式将其从脑组织上移除。将海马体放入盛有冰上sACSF的50毫升离心管中，并以相同方式采集对侧海马体。接下来，轻轻刮除纹状体周围的边缘，使其与周围组织分离。然后轻轻夹住纹状体下方，以采集纹状体组织。在如前所述从两个半球收获大脑皮层后，将纹状体转移至荧光解剖显微镜下。使用镊子去除每个纹状体中亮红色的 td-tomato 阳性苍白球组织。当所有组织均收获完毕后，将组织转移至一个 5 毫米圆底管中，并将每个收集管中的 sACSF 替换为 2 毫升新配制的蛋白酶- sACSF 溶液，在室温下孵育 20 分钟，期间偶尔轻弹管体。孵育结束后，小心地将蛋白酶-人工脑脊液替换为一到两毫升的重悬液，并使用火焰抛光的巴斯德移液管机械解离组织。当溶液呈浑浊状且无可见组织块时，通过50微米滤膜将细胞悬液过滤至新的5毫升圆底试管中，以在进行荧光激活细胞分选前去除任何细胞团块。从流式细胞仪获得细胞后，将细胞悬液转移至1.5毫升锥形管中进行离心。离心后，从每根离心管中吸除上清液，仅保留最后20微升，并将沉淀重悬以进行细胞计数。如有必要，用sACSF将细胞悬液稀释至每微升1×10⁵到3×10⁵个细胞的浓度。用矿物油填充一支细尖微量移液器。将微移液管连接至纳升注射仪，并将纳升注射装置固定在连接于磁性底座的操纵器上。在第一只幼鼠于冰上麻醉的同时，反复吹打细胞悬液数次，以确保细胞分布均匀。排出石蜡油，并用单细胞悬液完全充满移液管。在确认幼鼠对脚趾夹捏无反应后，将其放置于培养皿盖上，头部置于黏性橡皮泥上，使头顶部相对平坦。用带菱形孔的实验室胶带覆盖头部，将胶带拉紧直至皮肤伸展，确保头部被牢固固定，并可通过孔洞清晰看到人字缝。将固定好的幼鼠移至纳升注射仪下，降低微移液管，使管尖正对人字缝上方。观察操纵器上的 X、Y 坐标，并调节操纵器旋钮，直至微移液管位于头部内侧、外侧以及前后轴的适当坐标位置。降低微移液管，使其尖端在皮肤表面形成微小凹陷，然后牢固而轻柔地转动 Z 轴操纵器旋钮，将微移液管推入皮肤和颅骨，进入脑组织。轻微回撤微移液管，直至其尖端被呈帐篷状的皮肤锥形包绕。观察沿 z 轴的坐标，然后将微量移液器降至适当的实验深度并注入细胞。细胞注入后等待 15 秒，再撤回微量移液器；如需在第二个位置重复注射，可重复上述操作。将幼鼠置于加热垫上，并在转回饲养笼前持续监测直至完全恢复。移植的细胞迁移至目标脑区，细胞存活率存在差异，范围从数十个到数千个不等。移植细胞定位于相应区域，其中许多细胞表现出中间神经元的形态特征，并表达明确的中间神经元神经化学标志物。即使通过异位移植将供体细胞移植到新的环境中，这些细胞仍能存活并成熟。对移植细胞进行的电生理学分析显示，其具有类似成年细胞的生理特性以及明确的放电模式，代表了定义明确的中间神经元亚型，这表明移植的中间神经元能够在宿主环境中正常成熟。移植的细胞还表现出自发性兴奋性突触后电流。记录表达通道视紫红质-2的移植中间神经元邻近的锥体细胞，可检测到这些内源性锥体细胞中由蓝光诱发的突触后GABA能电流。在进行此操作时，重要的是将细胞保持在冰上，并使用巴斯德移液管轻柔地吹打细胞，以尽量减少细胞死亡。完成此操作后，可对移植物中的细胞进行其他方法分析，例如单细胞测序，以更全面地阐明环境变化如何影响细胞的转录组。观看本视频后，您应能够从新生幼鼠的不同脑区分离出中间神经元前体细胞，并将这些细胞移植到同龄幼鼠的多个脑区中。

homochronic-transplantation-interneuron-precursors-into-early

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

Interneuron 前体 Homochronic 移植早期小鼠脑的研究

来源： Weber, R. Z., 等脑内移植与 在体实验 小鼠脑内人神经前体细胞的生物发光示踪 视频实验杂志...

人源神经前体细胞在小鼠脑内的移植

本视频介绍了一种从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞的方法。该方案包括在含有特定小分子抑制剂的培养基中培养干细胞，以促进干细胞的增殖并聚集形成拟胚体（EB）。随后，使用酶消化法将拟胚体解离，并接种至包被有黏附蛋白的培养板孔中，以促进其向皮层中间神经元前体细胞分化。...

从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞

来源：Quattrocolo, G., et al. 将中间神经元前体细胞同源移植至出生后早期小鼠大脑。J. Vis. Exp.

将中间神经元前体细胞移植到小鼠幼崽脑内

来源：Gonzalez-Ramos, A., 等. 将人干细胞来源的GABA能神经元移植至出生后早期小鼠海马以缓解神经发育障碍。J. Vis. Exp.

将人源性中间神经元前体细胞移植至幼鼠海马区

来源：Denaxa, M., et al.，化学遗传学改造的皮层中间神经元前体移植至出生后早期小鼠大脑。J. Vis. Exp.

琼脂糖包埋电穿孔辅助的基因转移技术在小鼠皮层中间神经元前体细胞中的应用

本方案描述了一种利用改良的拟胚体转单层法从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞及有丝分裂后中间神经元前体的方法。这些前体细胞可用于 体外...

小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

基于体外慢病毒工程技术对神经前体细胞进行改造，并将其共移植到野生型大脑中，结合对“实验”和“对照”衍生细胞的配对形态测量学分析，该方法能够以简单且经济的方式精确模拟体内基因对新皮层神经元形态的调控。...

用于体内神经结构研究的工程化神经前体细胞脑室内移植

本文介绍了一种实验方案，旨在利用化学遗传学工具调控移植到新生期小鼠大脑皮层中的皮层中间神经元前体细胞的活性。...

化学遗传学改造的皮层中间神经元前体细胞移植至新生小鼠脑内

通过神经元编程方法获得的人多能干细胞来源的GABA能神经元移植，可能成为治疗神经发育障碍的一种潜在治疗策略。本方案描述了将人干细胞来源的GABA能神经前体细胞生成并移植至新生小鼠脑内的方法，可用于对移植物神经元进行长期研究，并评估其治疗潜力。...

将人干细胞来源的GABA能神经元移植至出生后早期小鼠海马以缓解神经发育障碍

介绍了一种在出生后大脑中测试基因功能的体内方法。将表达Cre和/或荧光蛋白的重组AAV注射到新生小鼠大脑中。通过实现基因的嵌合失活和稀疏神经元标记，可快速分析基因在神经环路发育关键过程中所发挥的功能。...

利用基于病毒的Cre重组技术对小鼠出生后脑发育中基因功能进行嵌合体分析

学习从小鼠幼崽纹状体和海马体分离中间神经元前体并进行同时间移植的技术。该方法用于研究环境变化如何影响神经元的命运决定与成熟过程，为发育神经科学提供重要工具。

同龄期中间神经元前体细胞移植至出生后早期小鼠大脑

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