量热-呼吸联合测定法：一种研究细胞能量代谢的强大非侵入性方法

本实验的总体目标是分析生物样本的代谢活性，并确定无氧代谢途径在样本细胞能量生成过程中所起作用的程度。该方法有助于回答药物研发领域中的关键问题，例如药物开发过程中线粒体毒性的程度。该技术的主要优势在于能够同时测量目标细胞样本的耗氧量和产热量。

因此，该方法可为药物研发过程中的治疗方案设计提供参考。它也可应用于其他领域，例如低温生物学，可用于评估代谢预处理对冷冻保存效果的影响。准备呼吸测定仪时，首先向每个呼吸测定仪腔室中加入2.2 mL的DMEM，并完全插入密封塞。

使用塞子间距工具调整塞子，以使氧气充分扩散到培养基中，并将腔室设置为在37摄氏度下以750 rpm持续搅拌样品，直至氧浓度和氧通量稳定。确认呼吸计软件已编程以考虑实验所用培养基的氧溶解度。然后选择氧浓度曲线中稳定的片段，并将该片段校准为100%空气饱和度。

现在，关闭旋塞，注意确保腔室内无气泡存在。大约10分钟后，应观察到稳定的氧气通量。为准备量热实验，首先向参比安瓿中加入2.5 mL去离子水，然后拧紧瓶盖。

使用气泵清除安瓿瓶外部的碎屑，然后缓慢将安瓿瓶放入微量热仪参考通道中的位置一。安瓿瓶将保持在位置一，直至细胞样品安瓿瓶制备完成。用于微量热分析的DMEM应置于37摄氏度、加湿并含有5%CO2的培养箱中平衡。

实验开始时，为每个将要使用的比色安瓿瓶向100毫升培养皿中加入3毫升DMEM，并将培养皿放入培养箱中，直至样品准备好进行量热分析。在培养基平衡的同时，使用倒置显微镜选择一皿 HepG2 细胞，其融合度应在60%至80%之间，且分布均匀。首先，移除细胞培养基，并用10毫升PBS洗涤细胞两次。

加入 3 毫升预热至 37 摄氏度的胰蛋白酶，并将培养板置于 37 摄氏度孵育。孵育 7 至 10 分钟后，加入 3 毫升 37 摄氏度的 DMEM 中和酶反应，然后使用 5 毫升移液管轻轻吹打使细胞解离成单细胞悬液。将细胞转移至无菌的 15 毫升锥形离心管中进行离心，并用约 5 毫升新鲜 DMEM 重悬细胞沉淀。

用移液器充分吹打细胞，以分散任何细胞团块，计数后将细胞浓缩至每50微升培养基约含两百万个细胞。该方法的可重复性依赖于一致且准确的细胞计数。确保样本均一，且在分析过程中的任何阶段细胞均未发生聚团，这一点至关重要。

然后将细胞置于冰上保存，直至准备进行呼吸测定和量热测定。在进行量热测定前，确认量热仪已连接至计算机，且量热信号稳定并以微瓦为单位显示。将细胞用已置于培养箱中平衡的培养基稀释至每毫升100,000个细胞。

然后向每支安瓿瓶中加入2.5 mL细胞溶液，确保瓶盖与培养基之间留有足够体积的空气，以利于气体扩散。立即拧紧瓶盖，并用空气清洁密封的安瓿瓶，去除外部杂质。随后，缓慢将装有细胞样品的密封安瓿瓶放入量热计中，定位至指定位置。

充分混匀样品以确保溶液均匀，然后在持续搅拌条件下，将两百万个细胞注入呼吸计的每个密闭腔室中。在量热计位置一处放置15分钟后，缓慢将参比安瓿和含有细胞的安瓿同时降至位置二，并记录下降时间。细胞注入呼吸计后10至15分钟，应观察到氧通量趋于稳定，并且氧浓度呈现稳定下降。

为测定泄漏呼吸，向每个腔室中加入一微升浓度为每毫升四毫克的寡霉素，并让氧通量稳定约10分钟，记录如前所述的稳定泄漏呼吸速率。随后，为测定最大通量，向腔室中加入两微升浓度为零点二毫摩尔的FCCP，每次注射后待氧通量稳定，持续进行滴定直至达到最大通量。记录最大通量期间的稳定呼吸速率。

在样品测量之前，当呼吸室处于运行状态时，氧气浓度和氧气通量曲线均应保持稳定。在安瓿瓶降至位置二后，可观察到一个热输出稳定的时段，同时可确定氧气通量也稳定的相应时段，从而可用于计算热-呼吸比。若HepG2细胞在无葡萄糖培养条件下培养，并添加半乳糖以增强线粒体参与，这些细胞在量热仪内不会增殖，反而在安瓿瓶中约30分钟后其代谢活性开始下降，因此热-呼吸比的计算仅限于热耗散首次测得的最早时间点。

记录细胞被移液至安瓿瓶中的时间至关重要，以确保热产生和氧气消耗的测量值在相同的时间点采集，因为氧通量需要大约15分钟才能稳定，且氧浓度会持续下降。在计算热呼吸商时，细胞稳定的氧通量可作为氧气消耗的替代指标，因此可进一步进行滴定以评估泄漏呼吸（表现为氧通量下降）和最大解偶联呼吸（表现为连续加入FCCP后呼吸未增加）。一旦掌握该技术，若操作得当，可在四小时内完成。

在进行该实验操作时，需要注意不同细胞系可能具有不同的代谢特性。因此，每一种新的细胞系都必须分别优化其量热和呼吸测量条件。观看本视频后，您应能够充分掌握如何准备HepG2细胞以进行量热呼吸联合测定，确保仪器校准正确，并能够规范地开展量热呼吸联合测定实验。