Name: Calorespirometry: 一种功能强大、无创的研究细胞能量代谢的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学习热量呼吸测定法这一无创技术，通过同步测量耗氧量与产热量来分析细胞能量代谢。该方法可评估有氧与无氧代谢通路对能量流的贡献，为药物开发中的线粒体毒性研究提供关键数据。

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本工作部分由美国国家科学基金会资助，资助号为 CHE-160944，授予 Mary E. Konkle 和 Michael A. Menze。

1. 细胞培养
<ol>
	<li>在细胞培养箱（5% CO2、95% 空气、100% 湿度）中，于 37 °C 条件下，使用含 10% 胎牛血清（FBS）及额外底物（10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养人肝细胞癌（HepG2）细胞。 
	注意：在后续呼吸测定和量热测定步骤中，凡提及使用 DMEM 时，均应采用上述配方。</li>
	<li>将细胞以每 100 mm 培养皿 1 × 106 个细胞的密度接种，每 7 天传代一次，或在细胞融合度达到 90% 前进行传代，并每 3–4 天更换一次培养基。</li>
	<li>在细胞融合度为 60–80% 时进行实验。</li>
</ol>
2. 呼吸计和量热计的准备
<ol>
	<li>将2.2 mL DMEM移液至呼吸测定室中，完全插入塞子，并使用塞子间隔工具进行调整，以促进氧气从空气向培养基中的最佳扩散。</li>
	<li>在37 °C下持续搅拌，直至氧浓度（蓝色轨迹）和氧通量（红色轨迹）稳定。确保呼吸计的软件已设置为考虑实验所用培养基的氧溶解度。 
	注意：不同培养基的氧气溶解度系数不同（例如，DMEM = 0.92。</li>
	<li>在培养箱打开状态下，待DMEM中的氧浓度稳定后，选取氧浓度曲线的稳定部分，并将其校准为100%空气饱和度。</li>
	<li>在腔室内无氧气存在时，选择氧浓度轨迹中稳定的区段，校准0%氧气。此步骤可在加入20 µL 230 mM连二亚硫酸钠滴定后，或在实验结束时生物样品耗尽所有氧气后进行。</li>
	<li>呼吸计完成100%空气校准后，盖紧塞子，并确保 chamber 内无气泡存在。 
	注意：在密闭腔室中，由于极谱氧传感器（POS）在测定氧分压时会消耗氧气，因此将检测到氧通量的轻微下降。</li>
	<li>在塞子关闭约10分钟后，通过观察氧通量是否稳定来确认呼吸仪是否已准备好用于HepG2细胞。 
	注意：此处使用的量热计采用不锈钢安瓿瓶，且需要一个安瓿瓶作为参比。</li>
	<li>加入2.5 mL H2O (dH2O）向量热计的参比安瓿中加入与样品等体积的溶液（步骤4），必要时使用钳子拧紧瓶盖。用气流清洁密封的安瓿，并缓慢将其放入量热计参比通道的位置1。保持在此位置，直至生物样品制备完成。</li>
</ol>
3. 用于呼吸测定和量热法的 HepG2 细胞的制备
<ol>
	<li>确认呼吸计和量热计已准备并校准完毕。将DMEM和胰蛋白酶在水浴中预热至37 °C。</li>
	<li>向一个新的100-mm培养皿中加入DMEM，并放入培养箱中，使培养基的CO2和温度达到平衡。 
	注意：该培养基将用于量热实验，因此所需体积取决于将使用的安瓿数量。</li>
	<li>使用倒置光学显微镜确认细胞融合度达到60 - 80%，然后用10 mL室温磷酸盐缓冲液（PBS）清洗100-mm培养皿两次。</li>
	<li>向100-mm培养皿中加入3 mL 37 °C的胰蛋白酶，在细胞培养箱中37 °C孵育7 - 10分钟。加入3 mL 37 °C的DMEM中和胰蛋白酶，并用5 mL移液管轻轻吹打约20次以充分悬浮细胞。</li>
	<li>将6 mL含有DMEM和胰蛋白酶的重悬细胞转移至无菌15 mL锥形管中，在175 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>用约5 mL DMEM重悬细胞沉淀，并充分吹打，确保细胞充分解离。</li>
	<li>取约100 µL充分混匀的样品，使用血细胞计数板的全部8个计数区域进行彻底的细胞计数，以确定细胞总数。然后计算重悬体积，使每50 µL中含有约2 × 106个细胞。 
	注意：这将确保向呼吸计的每个腔室加入2 × 106个细胞时，培养基体积变化最小。</li>
	<li>在175 × g条件下离心细胞5分钟。用步骤3.7中计算出的DMEM体积重悬细胞沉淀。</li>
	<li>进行细胞计数，确定向呼吸计每个腔室注入2 × 106个细胞所需的体积（应约为50 µL）。将用于呼吸测定的细胞置于冰上保存，直至使用。</li>
	<li>在浓缩的细胞样本置于冰上的同时，计算为量热实验制备浓度为1 × 105个细胞/mL所需的稀释比例。</li>
	<li>充分混匀样本，并用DMEM制备每支安瓿约3 mL、浓度为1 × 105个细胞/mL的细胞悬液。 
	注意：用于样本稀释的DMEM应为步骤3.3中预先平衡好的培养基。</li>
</ol>
4. 量热法
<ol>
	<li>确保量热仪已连接至计算机，且以 µW 为单位的量热信号可被观察并保持稳定。</li>
	<li>向每支安瓿中加入 2.5 mL 浓度为 1 × 105 个细胞/mL 的细胞悬液（约 2.5 × 105 个细胞），并确保安瓿盖与培养基之间留有足够空间，以利于气体扩散。</li>
	<li>立即拧紧瓶盖，必要时可使用钳子。用气流清洁密封后的安瓿外表面，去除任何外部杂质，然后缓慢将安瓿放入量热仪的位置 1。记录安瓿放入位置 1 的时间。</li>
	<li>让安瓿在位置 1 静置 15 分钟。 
	注意：在此 15 分钟期间，应将细胞注入呼吸仪（步骤 5），以确保在测定 CR 比值时，热量产生和氧气消耗所使用的时间间隔相同。</li>
	<li>在位置 1 静置 15 分钟后，缓慢将参比安瓿和样品安瓿同时移至位置 2。记录安瓿移至位置 2 的时间，并至少连续测量 30 分钟。</li>
</ol>
5. 呼吸测量法
<ol>
	<li>在安瓿瓶置于量热计位置1的15分钟间隔内，开始进行呼吸测定研究。</li>
	<li>用移液器反复吹打细胞样品，确保形成均匀的悬液，然后注入 &#60;将50 µL细胞样品加入呼吸仪的每个腔室中，最终浓度约为 ~2 x 106 细胞/腔室。记录细胞注入呼吸仪的时间。</li>
	<li>注射后，将HepG2细胞在37 °C下持续搅拌。等待至少20 - 30分钟，直至氧通量稳定并出现持续的氧浓度下降。</li>
	<li>选择 O2 每伏特通量 点击屏幕右侧的标签，标出氧通量的稳定部分。选择“标记”，然后选择“统计”并记录氧通量相关数据2 每伏特通量。该记录将用于计算CR比值。 
	注意：步骤 5.5 和 5.6 为可选步骤。通过寡霉素和FCCP的滴定，可揭示泄漏呼吸和最大非耦联呼吸。</li>
	<li>向每个腔室注入 1 µL 浓度为 4 mg/mL 的寡霉素，并等待约 10 分钟，使氧通量达到稳定。通过执行步骤 5.4 中的操作，选取寡霉素加入后氧通量轨迹中稳定的区段，记录稳定的质子漏呼吸速率。</li>
	<li>每次向各反应室中注入 2 µL 0.2 mM FCCP，每次注射后等待氧气通量稳定。持续进行滴定，直至达到最大通量，此时后续的FCCP滴定将显示通量略有下降。记录最大通量期间稳定的呼吸速率。</li>
</ol>
6. 计算热量呼吸商
<ol>
	<li>对制备的样品进行最终细胞计数，浓度约为 1 x 105 使用血细胞计数板的全部8个计数区域测定加入安瓿瓶（2.5 mL）中的细胞总数，单位为个细胞/mL。</li>
	<li>确定一个时间，同时从量热计和呼吸计上记录测量数据&#160;稳定的信号&#160;在相同时间点进行。参考安瓿瓶降至位置2时记录的时间以及将细胞注入呼吸计时的时间。</li>
	<li>通过将光标置于步骤中确定时间点的相应安瓿瓶热输出曲线处，记录产热情况，并以µW/百万细胞表示。收集耗氧量数据，并确保其以pmol O₂表示。2 x&#160;s-1&#160;x&#160;百万细胞</li>
	<li>为计算 CR 比值，首先将 µW 转换为 kJ/s，然后用 kJ/s 除以 O 的摩尔数2/秒，以获得以 kJ/mol O 表示的 CR 比值2. 注意：CR 比值以 kJ/mol O 表示2. 
	（参见&#160;<a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">补充文件1</a>)</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

热量呼吸测定法的目的是定量评估有氧和无氧途径对代谢活动的贡献，并获得细胞能量通量的综合视图。该目标通过同时测量热耗散和氧通量，随后将计算得到的呼吸商（CR）比值与理论上的氧热当量进行比较来实现。为获得可重复且可靠的数据，必须注意若干关键步骤。无菌且健康的细胞培养体系的维持至关重要。细菌或真菌污染可能导致热产生或耗氧量的错误归因，从而使CR比值失去意义。此外，细胞计数不准确、样品混合不充分或细胞成团聚集，也可能导致CR比值不准确。关于呼吸仪使用的一个关键步骤是正确的样品制备，以确保加样体积低于50 µL。该体积可最大限度减少反应室中培养基的置换量，从而准确将耗氧量归因于2 × 106个细胞。当观察到基础呼吸稳定后，本方案还可兼容后续两次滴定（寡霉素和FCCP），以分别揭示线粒体的泄漏呼吸和电子传递链（ETS）容量。在此应用中，过量添加FCCP可能抑制呼吸并阻碍&#160;最大非耦合呼吸通量的实现；因此，应进行至少3至5次梯度滴定，以达到最大非耦合呼吸状态。
呼吸计和量热计的维护与正确校准对于热-呼吸联合测定至关重要。强烈推荐采用逐步滴定连二亚硫酸盐的方法进行背景...

在生物系统中，代谢过程中释放的热量或焓变通常通过直接方式监测（通过 直接量热法）或通过 O2 消耗和/或 CO2 产热（通过呼吸测定法）。遗憾的是，当这些技术单独使用时，一些关键信息会丢失，例如无氧途径对细胞代谢的贡献。量热呼吸联合测定法（calorespirometry）是一种强大的技术，依赖于对热耗散和呼吸作用的同步测量。早期的量热呼吸联合测定研究揭示了在完全氧合的哺乳动物细胞中存在无氧代谢，并证明即使在充分供氧的环境中，转化细胞的能量稳态仍同时依赖于有氧和无氧代谢途径的共同贡献1此后，热-呼吸测量法已被应用于多种生物学问题的研究，例如低氧条件下动物能量学的研究、除草剂和雌激素对双壳类动物鳃部的影响、陆生生物的代谢，以及微生物对土壤有机质的分解作用2,3,4,5,6此外，量热呼吸测定法揭示了冻存前的代谢预处理如何改善哺乳动物细胞的冷冻保存效果7每种方法，无论是量热法还是呼吸测定法，都独立地增进了我们对细胞和有机体生物能量学的认识。然而，通过热量-呼吸联合测定法（calorespirometry）所能回答的基本生物学问题仍相对未被充分探索。
赫斯定律指出，反应的总焓变与初始状态和最终状态之间的路径无关。例如，一条生物化学途径的总焓变等于该途径中所有反应焓变的总和。量热法提供了一种实时测量细胞产热的方法，可无差别地检测有氧和无氧途径。这&#160;基于这样一个前提：系统中除了通过实验安瓿的壁面进行能量交换外，不与其他外界发生能量交换8热量散失的变化等于安瓿中所有代谢反应释放的焓变。因此，负的焓变表示系统热量的损失。过去四十年的深入研究已对分解代谢和合成代谢的热力学图景进行了表征。这体现在以相关术语检索到的研究论文数量持续增长 &#34;生物学的&#34; 和 &#34;量热法&#34; 由美国国立卫生研究院国家医学图书馆（NLM）（PubMed）索引的文献显示，1970年之前，共有27篇出版物提及生物量热法；而仅在2016年，就有546篇出版物应用了该技术。
量热法已广泛用于测定热量产生。然而，在测定呼吸计量值方面则具有更大的灵活性。呼吸计量测量可包括 O2, CO2或两者兼有2 和 CO2。此外，氧消耗量的测定2 或 CO2 可通过多种技术实现，包括光导电极、克拉克型电极和可调谐二极管激光吸收光谱法7,9,10,11. 尽管 CO2 生产是一种&#160;在许多呼吸测定研究中，培养细胞的培养基通常使用碳酸氢盐缓冲系统来控制pH，这是一个重要的指标12,13为避免CO相关并发症2 在碳酸氢盐体系中的测量，以下用于培养细胞的量热呼吸测定方案利用了O2 作为唯一的呼吸测量参数。
在测量氧通量的同时，某些呼吸仪（参见材料表）可用于对线粒体功能进行详细评估。底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）方案已得到充分建立，并可与旨在测量膜电位或活性氧（ROS）生成的实验兼容14。本文所述的完整细胞量热呼吸测定方案，适用于引入化学解偶联剂（如羰基氰化对三氟甲氧基苯腙（FCCP））以及F0F1-ATP合酶抑制剂寡霉素。通过添加FCCP，可将氧气消耗与ATP生成解偶联，从而有助于评估&#160;潜在治疗手段对线粒体功能的影响15。此外，添加寡霉素可揭示质子漏呼吸的程度。因此，在量热呼吸测定过程中进行的呼吸测定，可与多种深入解析线粒体生理学的实验方案相兼容。
同时测量热耗散和氧通量可计算出热呼吸商（CR比值）。随后将该比值与Thornton常数或理论氧热当量（范围为-430至-480 kJ/mol）进行比较。-1 取决于目标细胞系或组织以及添加的碳源底物1,16因此，更负的呼吸商（CR）比值表明厌氧途径对整体代谢活动的贡献增加。例如，静息状态下肌肉组织呼吸的CR比值范围为-448至-468 kJ mol-1，该数值处于理论氧热当量的范围内。17,18与此同时，培养在高葡萄糖培养基中的哺乳动物癌细胞在糖酵解后表现出增强的乳酸发酵，而线粒体活性相对较低。19该表型导致的CR比值范围为-490至-800 kJ/mol。-1，表明厌氧代谢途径在细胞代谢中的参与程度增加，这由更负的CR比值所指示1,7,16,20.
目前，商业性和非营利性的细胞与组织供应商均提供来自超过150个物种的细胞系，其中近4000种细胞系来源于人类。永生化细胞系是快速评估潜在治疗药物毒性的便捷工具，其中许多药物可能直接或间接干扰线粒体功能。在药物筛选过程中使用转化细胞可能具有有限的预测价值，部分原因在于瓦伯格效应（Warburg effect），这是多种癌症的典型特征。通常情况下，癌细胞通过底物水平磷酸化生成ATP，并通过乳酸的产生维持氧化还原平衡，而在有氧条件下并未充分启用线粒体功能19。药物研发以高成本和低效率著称，大约每9个进入人体临床试验的化合物中仅有1个能获得上市批准21。尽管某些潜在治疗药物可能因在细胞系中表现出较低的细胞毒性而通过初步筛选，但其中部分化合物仍可能存在线粒体毒性。若缺乏适当的方法来检测这些毒素如何影响不表现瓦伯格效应的原代细胞中的能量平衡，关键信息往往会被忽视，从而在早期阶段阻碍治疗药物的开发。
热量-呼吸联合测定法是一种实用且无创的方法，可用于分析多种生物样本（包括细胞和组织）的代谢活性。本方案的核心部分适用于多种应用场景。然而，已发现一个复杂因素：为了增强细胞对潜在线粒体毒素的敏感性，永生化细胞通常在无葡萄糖、添加半乳糖的培养基中培养，以提高氧化磷酸化（OXPHOS）在能量生成中的贡献22,23。这种代谢重编程在将样本置于热量计所用的不锈钢安瓿瓶中时，似乎会干扰分析15。在葡萄糖培养基中培养的细胞在数小时内仍保持较高的代谢活性；而半乳糖培养基中培养的细胞在放入安瓿瓶后30分钟内即出现产热下降，导致测量仅限于早期实验时间点。这一现象遗憾地阻碍了对其细胞增殖能力的评估。尽管存在这一特定限制，大多数应用仍适用于热量-呼吸联合分析，且可通过该方法获得详细的代谢信息。

<table><tbody><tr><td>HepG2 细胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>HB-8065</td><td>用于热量-呼吸联合测定的细胞</td></tr><tr><td>O2k-呼吸仪</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10022-02</td><td>呼吸仪</td></tr><tr><td>LKB 2277 热活性监测仪 (TAM)</td><td>Thermometric AB</td><td></td><td>Thermometric 已被 TA Instruments 收购</td></tr><tr><td>丙酮酸钠 (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td>添加至 DMEM 培养基中的 100 倍浓缩液</td></tr><tr><td>胎牛血清 - Premium Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>添加至 DMEM 培养基中至终浓度 10%</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200072</td><td>细胞解离试剂</td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Streptomyces diastatochromogenes&lt;/em&gt; 的寡霉素</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>O4876</td><td>线粒体抑制剂</td></tr><tr><td>羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>线粒体解偶联剂</td></tr><tr><td>Corning 100 mm 经组织培养处理的培养皿</td><td>Corning Corporation</td><td>430167</td><td>组织培养皿</td></tr><tr><td>葡萄糖，粉末</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15023021</td><td>用于 DMEM 培养基的葡萄糖</td></tr><tr><td>半乳糖，粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656500</td><td>用于 DMEM 培养基的半乳糖</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>用于 DMEM 培养基的谷氨酰胺</td></tr><tr><td>无葡萄糖 DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11966025</td><td>细胞培养基</td></tr></tbody></table>

量热-呼吸联合测定法：一种研究细胞能量代谢的强大非侵入性方法

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

在基础生物学和生物医学研究中，许多细胞系通过有氧呼吸和无氧呼吸相结合的方式来维持能量稳态。然而，这两种代谢途径在细胞能量生成中的具体贡献程度却常常被忽视。在葡萄糖饱和条件下培养的转化细胞通常表现出对氧化磷酸化产生ATP的依赖性降低，这一缺陷通过底物水平磷酸化的增强得以补偿。这种代谢平衡的改变使得细胞即使在存在线粒体毒素的情况下仍能增殖。若忽略转化细胞代谢平衡的改变，则药物筛选实验的结果可能被误读，因为在高葡萄糖浓度下培养的模型细胞系可能无法检测到潜在的线粒体毒性作用。本实验方案描述了两种强大技术——呼吸测定法和量热法的联合应用，可实现对细胞ATP生成过程中有氧和无氧贡献的定量、非侵入性评估。有氧呼吸和无氧呼吸均会产生热量，这一过程可被监测 通过 量热法。同时，通过测量氧气消耗速率可评估有氧呼吸的程度。当热量散失和氧气消耗同时被测量时，便可确定热量呼吸商。将实验获得的数值与理论氧热当量进行比较，即可判断无氧呼吸的程度。因此，热量呼吸联合测定法提供了一种独特的方法，可用于分析多种生物学问题，包括药物开发、微生物生长以及常氧和低氧条件下的基础生物能量学研究。

量热-呼吸联合测量的可重复性取决于正确且一致的样品制备。若培养皿中细胞过度生长，则不应使用由此制备的样品，因为细胞聚集会导致细胞计数不准确。此外，聚集的细胞可能导致底物扩散受限，从而降低热流量。因此，在使用贴壁细胞时，关键是要选择细胞融合度在60%至80%之间的培养皿，并在实验前24小时更换培养基。
正确的仪器校准和维护对于获得具有信息性和可重复性的量热-呼吸测量结果也至关重要。应遵循呼吸仪制造商规定的清洗方案，使用乙醇进行充分清洗，以确保清除残留的疏水性解偶联剂和抑制剂，避免其对线粒体产生部分抑制或解偶联作用，从而影响测量结果。在呼吸仪样品测量开始前，氧浓度和氧通量曲线均应保持稳定，如图1所示。若POS（氧传感器）需要维护，氧通量将无法稳定，如图2所示。当POS未得到适当维护时，不应进行测量。此外，量热仪中使用的安瓿瓶在使用前应进行清洗、灭菌和干燥，因为生物污染可能干扰样品的产热。
在完成呼吸计和量热计的适...

本方案描述了量热呼吸法，即对热量耗散和呼吸作用进行直接且同步的测量，该方法可无创地评估能量代谢。通过监测细胞总能量流，该技术可用于评估有氧和无氧途径在能量利用中的各自贡献。

在基础生物学和生物医学研究中使用的许多细胞系通过有氧和无氧……相结合的方式维持能量稳态。

本实验的总体目标是分析生物样本的代谢活性，并确定无氧代谢途径在样本细胞能量生成过程中所起作用的程度。该方法有助于回答药物研发领域中的关键问题，例如药物开发过程中线粒体毒性的程度。该技术的主要优势在于能够同时测量目标细胞样本的耗氧量和产热量。因此，该方法可为药物研发过程中的治疗方案设计提供参考。它也可应用于其他领域，例如低温生物学，可用于评估代谢预处理对冷冻保存效果的影响。准备呼吸测定仪时，首先向每个呼吸测定仪腔室中加入2.2 mL的DMEM，并完全插入密封塞。使用塞子间距工具调整塞子，以使氧气充分扩散到培养基中，并将腔室设置为在37摄氏度下以750 rpm持续搅拌样品，直至氧浓度和氧通量稳定。确认呼吸计软件已编程以考虑实验所用培养基的氧溶解度。然后选择氧浓度曲线中稳定的片段，并将该片段校准为100%空气饱和度。现在，关闭旋塞，注意确保腔室内无气泡存在。大约10分钟后，应观察到稳定的氧气通量。为准备量热实验，首先向参比安瓿中加入2.5 mL去离子水，然后拧紧瓶盖。使用气泵清除安瓿瓶外部的碎屑，然后缓慢将安瓿瓶放入微量热仪参考通道中的位置一。安瓿瓶将保持在位置一，直至细胞样品安瓿瓶制备完成。用于微量热分析的DMEM应置于37摄氏度、加湿并含有5%CO2的培养箱中平衡。实验开始时，为每个将要使用的比色安瓿瓶向100毫升培养皿中加入3毫升DMEM，并将培养皿放入培养箱中，直至样品准备好进行量热分析。在培养基平衡的同时，使用倒置显微镜选择一皿 HepG2 细胞，其融合度应在60%至80%之间，且分布均匀。首先，移除细胞培养基，并用10毫升PBS洗涤细胞两次。加入 3 毫升预热至 37 摄氏度的胰蛋白酶，并将培养板置于 37 摄氏度孵育。孵育 7 至 10 分钟后，加入 3 毫升 37 摄氏度的 DMEM 中和酶反应，然后使用 5 毫升移液管轻轻吹打使细胞解离成单细胞悬液。将细胞转移至无菌的 15 毫升锥形离心管中进行离心，并用约 5 毫升新鲜 DMEM 重悬细胞沉淀。用移液器充分吹打细胞，以分散任何细胞团块，计数后将细胞浓缩至每50微升培养基约含两百万个细胞。该方法的可重复性依赖于一致且准确的细胞计数。确保样本均一，且在分析过程中的任何阶段细胞均未发生聚团，这一点至关重要。然后将细胞置于冰上保存，直至准备进行呼吸测定和量热测定。在进行量热测定前，确认量热仪已连接至计算机，且量热信号稳定并以微瓦为单位显示。将细胞用已置于培养箱中平衡的培养基稀释至每毫升100,000个细胞。然后向每支安瓿瓶中加入2.5 mL细胞溶液，确保瓶盖与培养基之间留有足够体积的空气，以利于气体扩散。立即拧紧瓶盖，并用空气清洁密封的安瓿瓶，去除外部杂质。随后，缓慢将装有细胞样品的密封安瓿瓶放入量热计中，定位至指定位置。充分混匀样品以确保溶液均匀，然后在持续搅拌条件下，将两百万个细胞注入呼吸计的每个密闭腔室中。在量热计位置一处放置15分钟后，缓慢将参比安瓿和含有细胞的安瓿同时降至位置二，并记录下降时间。细胞注入呼吸计后10至15分钟，应观察到氧通量趋于稳定，并且氧浓度呈现稳定下降。为测定泄漏呼吸，向每个腔室中加入一微升浓度为每毫升四毫克的寡霉素，并让氧通量稳定约10分钟，记录如前所述的稳定泄漏呼吸速率。随后，为测定最大通量，向腔室中加入两微升浓度为零点二毫摩尔的FCCP，每次注射后待氧通量稳定，持续进行滴定直至达到最大通量。记录最大通量期间的稳定呼吸速率。在样品测量之前，当呼吸室处于运行状态时，氧气浓度和氧气通量曲线均应保持稳定。在安瓿瓶降至位置二后，可观察到一个热输出稳定的时段，同时可确定氧气通量也稳定的相应时段，从而可用于计算热-呼吸比。若HepG2细胞在无葡萄糖培养条件下培养，并添加半乳糖以增强线粒体参与，这些细胞在量热仪内不会增殖，反而在安瓿瓶中约30分钟后其代谢活性开始下降，因此热-呼吸比的计算仅限于热耗散首次测得的最早时间点。记录细胞被移液至安瓿瓶中的时间至关重要，以确保热产生和氧气消耗的测量值在相同的时间点采集，因为氧通量需要大约15分钟才能稳定，且氧浓度会持续下降。在计算热呼吸商时，细胞稳定的氧通量可作为氧气消耗的替代指标，因此可进一步进行滴定以评估泄漏呼吸（表现为氧通量下降）和最大解偶联呼吸（表现为连续加入FCCP后呼吸未增加）。一旦掌握该技术，若操作得当，可在四小时内完成。在进行该实验操作时，需要注意不同细胞系可能具有不同的代谢特性。因此，每一种新的细胞系都必须分别优化其量热和呼吸测量条件。观看本视频后，您应能够充分掌握如何准备HepG2细胞以进行量热呼吸联合测定，确保仪器校准正确，并能够规范地开展量热呼吸联合测定实验。

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