流式细胞仪测定缺氧/复氧后心肌细胞线粒体膜电位的实验研究

该方法可以帮助测量缺氧/复氧对线粒体膜电位细胞的影响，并可用于评估药物是否具有损伤保护作用。该测定的主要优点是它检测到的 MMP 是在线粒体大小等因素的情况下。此外，它对材料和光泽的要求较低。

从六孔板中 70% 汇合的人心肌细胞开始。用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞后，在两毫升不含血清和葡萄糖的 DMEM 中加入药物或载体。在缺氧前，在含有 5% CO2 和 95% 空气的细胞培养箱中，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

30 分钟后，将人心肌细胞培养皿放入 2.5 升密封的低氧罐中。配有催化剂以清除游离氧，以及厌氧指示剂以测量介质中的氧张力。将罐子放入组织培养箱中。

厌氧指示剂的颜色从常氧环境中的浅蓝色变为低氧条件下的淡白色。从罐中取出六孔板并将其放在培养箱架上 2 小时，对人心肌细胞进行再充氧。再氧化后，用 1 毫升预热的 PBS 冲洗细胞，并沿孔壁加入 0.5 毫升预热的 25% 胰蛋白酶。

在 37 摄氏度下孵育约 1 分钟，直到所有人类心肌细胞几乎分离。然后向孔中加入 1 mL DMEM 完全培养基以中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移至 15 mL离心管中，在室温下以 500 倍 G 离心 3 分钟，使 HCM 沉淀。

离心后，小心吸出上清液，不要干扰沉淀。然后向每管中加入 5 毫升人心肌细胞完全培养基和 5 毫升 JC-1 工作溶液。通过上下移液重悬 HCM。

用铝箔覆盖试管以防止荧光指示剂漂白，并在正常条件下孵育细胞 20 分钟。在预冷至 4 摄氏度的离心机中以 500 倍 G 离心 3 分钟沉淀人心肌细胞后，用 2 毫升冰冷的 JC-1 染色缓冲液冲洗细胞两次。第二次冲洗后，将人心肌细胞重悬于 300 μL 冰冷染色缓冲液中。

并将样品过滤到相应的样品管中。在 30 分钟内通过流式细胞术分析细胞。启动流式细胞仪并确保软件已连接。

执行流体启动。启动流，并设置中断。在流式细胞术软件中打开两个点图窗口。

在第一个点图中选择 X 轴上的前向散射光，在 Y 轴上选择侧向散射光。分别用大小和粒度来表示单元格的特征。选择 Y 轴的 PE 检测通道。

X 轴为 FITC，在第二个点图中使用对数刻度，用于测量细胞中 JC-1 染料的荧光强度。单击卸载以放出试管支撑臂，并放置包含未用 JC-1 染色的人心肌细胞的空白样品管。单击加载将支撑臂返回到其工作位置。

单击记录以从空白样品管中的悬浮液中收集颗粒。并在第二个点图中调整荧光通道的电压。在第一个点图中对细胞群进行门控以进行进一步分析。

接下来，分析人类心肌细胞。显示每个样品管的统计数据，并通过将红色荧光强度的比值除以绿色荧光强度的比率来计算每个样品的 MMP。与通过 Annexin PI 比率测量的正常细胞相比，缺氧和复氧显着诱导人心肌细胞凋亡。

一种具有心脏保护作用的中药，可防止缺氧/复氧后 HCMs 的细胞凋亡。如此处所示，用线粒体 CCP 处理后的 JC-1 红/绿比值几乎为零。与 apporsis 检测的结果一致。

与正常组相比，H/R 处理组的红/绿比显著降低。并逆转了这样的比率变化。在尝试此过程时，请务必记住在冰冷的静置缓冲液中启动加载 JC-1 的细胞，因为温度对线粒体膜电位的稳定性有相当大的影响。

按照这个程序，可以执行其他方法，如基因作来回答其他问题，比如 MMP 的减少是否是由于 MPTP 的开放造成的。