一种用于评估轻度脊髓损伤小鼠模型中内源性神经干细胞激活的神经球形成实验

该方法有助于回答与神经前体细胞在再生医学中作用相关的问题。具体而言，我们可以探究损伤如何影响神经前体细胞的行为。该技术的主要优势在于，它提供了一种研究脊髓损伤对内源性神经前体细胞动力学影响的方法。

这些技术的可视化演示至关重要。由于手术和解剖步骤需要精确操作，学习起来可能较为困难，但通过练习可以逐步掌握。在开始操作前，使用毛发推剪去除麻醉小鼠从背部中段至颈部及耳部区域的毛发。

将小鼠固定于立体定位仪后，在其腹部下方放置四到五块卷好的纱布，同时轻轻牵拉尾根部以伸直身体和脊柱。将位于小鼠腹部的胸部纱布卷从腹部向前推至胸部上部，以支撑胸椎。使用实验室胶带以星状方向固定尾部和四肢。

用70%乙醇和聚维酮碘棉签依次消毒暴露的皮肤后，使用10号手术刀片沿动物体长轴方向做一垂直切口，切口位置从双侧肩胛骨中点延伸至胸椎弯曲处。牵开皮肤以暴露软组织及脊柱轮廓，并确定肩胛上脂肪垫的下缘边界。

然后，使用手术刀沿胸椎T5至T8及第九根肋骨两侧仔细而有力地切割，以分离背部肌肉肌腱与脊柱。重新放置牵开器，使牵开器的齿部插入脊柱两侧的切口处。并逐个扩张牵开器以调节术野暴露程度，直至脊柱充分抬高，同时避免对牵开的肌肉层造成过大张力。

在手术显微镜下，仔细清除覆盖在脊柱上的残留肌肉和其他软组织，以暴露椎体骨。用有齿镊夹住椎骨的棘突，并轻微上下移动镊子以确认将要切除的椎骨。接着，将一对弯头钝头剪刀的一侧尖端插入暴露的椎间孔两侧，位于待切除椎板的尾侧。

双侧切断连接的椎间关节。然后将椎板向上抬起，切断椎板的上端附着处，以分离并移除骨质。在剪除和移除椎板时，务必始终将剪刀尖端朝上倾斜，以免损伤下方的脊髓。

以背侧中线静脉作为解剖标志，将30号针头弯曲45度的针 shaft 以斜面朝上的方向，插入脊髓背外侧表面约1毫米深度处，位置大约在中线两侧0.5毫米处。从尾侧向头侧方向移动针头约2毫米，使针头斜面的整个长度均插入脊髓内。

然后，沿穿刺路径反向退出针头。缝合伤口时，先撤去拉钩，使用6-0可吸收缝线沿中线对合损伤部位两侧的背侧肌肉，再用4-0丝线缝合表层皮肤。

为了分离神经球，沿背部全长在皮肤上做一条正中切口，以暴露肌肉和椎骨轮廓。提起每侧肩胛骨的内侧部分，用剪刀剪除肩胛骨与椎骨之间的软组织。当下方的脊柱暴露后，将剪刀插入上胸段的开口，沿脊柱的曲度剪开，切除附着的肋骨、肌肉和内脏器官，从而分离出脊柱。

将剪刀插入尾部椎体的椎管内，剪断椎板两侧的椎间关节，注意不要损伤完整的脊髓。当暴露出足够长度的脊髓后，在将脊髓组织转移至盛有常规人工脑脊液并置于冰上的培养皿之前，小心剪断从脊髓向两侧延伸的脊神经。在解剖显微镜下，将脊髓组织截取为包含损伤部位头侧和尾侧各约两毫米的节段，并使用两对精细镊子沿背侧和腹侧裂隙轻轻将脊髓纵向分离为两半。

使用显微剪刀切除受损的背外侧白质，并将受损组织放入一个15毫升的锥形管中。用镊子夹住半侧脊髓，沿脊髓的头尾方向，用两对镊子分离并去除未受损的白质，以分离出相应的室管膜周围区域。

以相同方法从脊髓的另一半分离出受损的白质及相关的室管膜下区域后，将室管膜下组织碎片分别放入各自的15毫升锥形管中。使用显微剪刀在管壁上轻轻剪切组织。待组织消化步骤完成后，获得单细胞悬液，随后通过向每种细胞条件对应的25毫升组织培养瓶中加入10毫升适当培养基，建立神经球培养体系。

将分离的神经干细胞以每微升10个细胞的克隆密度加入，用于细胞培养箱中的培养。24小时后，轻轻摇动培养瓶，将内容物倒入各自的15毫升锥形管中进行离心。用1至2毫升新鲜神经基础培养基重悬细胞沉淀，用于计数。

按每种条件，以单克隆密度将细胞接种至一个24孔组织培养板中，每孔加入500 µL相应添加有丝分裂原的适宜培养基。随后，将神经球在细胞培养箱中培养7天。在最小脊髓损伤后第5天，确定的神经干细胞来源的神经球数量多于原始神经干细胞来源的神经球数量。

确定性神经球具有较大的直径和较大的深色中心，而原始神经球体积较小且结构更为致密。与损伤水平以上中央管区域神经球数量相对适度的增加相比，轻微脊髓损伤可显著增加损伤水平中央管来源的神经球数量。

确定性神经球也可以从损伤水平的病变白质中产生，而仅进行椎板切除术的动物中，该区域不含能形成神经球的细胞。损伤后原始神经干细胞数量同样增加，但损伤部位白质中的原始神经球除外。

一旦掌握，该手术技术可在40分钟内完成。若操作得当，组织解剖与分离可在30分钟内完成。手术完成后，根据动物品系的不同，可采用免疫组织化学和电击刺激等附加方法，进一步研究损伤后神经前体细胞的增殖动力学及其自我命运等科学问题。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用神经球形成实验来评估脊髓损伤后神经干细胞的激活情况。