Name: 成像 Ca2 +在志贺菌感染上皮细胞期间的响应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 了解志贺菌感染HeLa细胞期间钙离子响应的荧光显微成像方法。本研究利用化学探针表征非典型局部与全局Ca²⁺信号，揭示病原体诱导的细胞信号动力学特征。

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我们感谢Jenny-Lee Thomassin在修改手稿过程中提供的帮助。本研究工作得到了ANR项目MITOPATHO和PATHIMMUN、Labex Memolife和PSL IDEX Shigaforce资助项目的资助。孙春晖获得了中国国家留学基金管理委员会的博士生奖学金。Laurent Combettes和Guy Tran Van Nhieu获得了WBI-France交流Tournesol项目的资助。&#176;31268YG（比利时法语区国际关系署、科学研究中心基金、法国外交与欧洲事务部、法国高等教育与研究部，作为居里合作伙伴计划的一部分）。

1. 准备工作
<ol>
	<li>细菌准备
	<ol>
		<li>接种细菌——志贺氏菌 在含有0.01%刚果红（CR）的胰蛋白胨大豆（TCS）琼脂平板上接种表达AfaE黏附素的野生型菌株（M90T-AfaE），于37 °C培养18小时。 
		注意：为了提高其可重复性， 志贺氏菌 步骤1.1.1中获得的平板应保存在4 °C，且应在一周内使用，因为CR培养基上的所有菌落随时间推移最终都会变为红色。</li>
		<li>从划线平板上挑取3个红色菌落接种于TCS肉汤中进行预培养。 
		注意：接种3个菌落以限制挑取单个克隆时其毒力质粒发生遗传重组的概率。</li>
		<li>在37 °C、200 rpm条件下，于摇床培养箱中培养液体细菌培养物16小时。加入氨苄青霉素，使其终浓度为75 mg/mL。抗生素浓度不应超过最低抑菌浓度的3倍，因为过量抗生素可能导致大型毒力质粒的丢失。 
		注意：维持的 志贺氏菌 毒力质粒应通过将细菌培养物涂布于补充适当抗生素浓度的CR平板上来验证。白色菌落的出现表明质粒丢失。</li>
		<li>以1:100的稀释比例将细菌预培养物接种至TCS培养基中。在37 °C、200 rpm条件下，于摇床培养箱中培养2小时。确保在600 nm处的光密度（OD600 nm0.2 - 0.4</li>
		<li>在21 °C下以13,000 × g离心细菌培养物2分钟，并将沉淀重悬于等体积的EM培养基（120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂）中2，0.8 mM MgCl2，5 mM 葡萄糖，25 mM HEPES，pH = 7.3）。</li>
		<li>在 EM 缓冲液中稀释细菌悬液，使其终浓度 OD600 nm 0.1，立即使用，或在21 °C下保存，并于60分钟内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞制备
	<ol>
		<li>在含1 g/L葡萄糖的DMEM培养基中培养HeLa细胞，添加10%胎牛血清（FCS），于37 °C、10% CO₂条件下培养2在含有10%胎牛血清和非必需氨基酸、葡萄糖浓度为4.5 g/L的DMEM培养基中，于37 °C、含10% CO₂的培养箱中培养TC-7细胞2.</li>
		<li>为维持细胞生长，需定期传代细胞，以避免因融合状态导致的生长接触抑制；这对于维持高钙水平至关重要2+ 探针加载/转染效率</li>
		<li>将HeLa细胞以3 x 10⁵个/孔的密度接种于6孔板中的无菌25 mm直径圆形盖玻片上5 实验前一天将HeLa细胞以每孔细胞数接种。</li>
		<li>对于TC-7细胞，用胰蛋白酶消化并计数细胞。以4 × 10⁵个/孔的密度接种于6孔板中。5 细胞/孔，在37 °C、10% CO₂条件下培养5–7天2实验前将培养物置于培养箱中以使其极化。
		<ol>
			<li>每天更换细胞培养基，直至实验当天。 
			注意：也可使用直径35 mm的玻璃底一次性培养皿替代含盖玻片的孔板。若使用后者，则仅通过加热载物台或物镜进行温度控制并不足够，还需在显微镜载物台上安装恒温培养舱。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验当天，吸去培养基，用 1 mL EM 培养基在 21 °C 下洗涤细胞 3 次。</li>
	<li>用3 mM Fluo-4-AM负载细胞14 在21 °C下，于电镜缓冲液中孵育30分钟。 
	注意：虽然亚融合的HeLa细胞的负载不会引起主要问题，但极化的TC-7细胞的负载通常存在异质性且效率较低。对于这类细胞，我们发现，在含有Fluo-4-AM的EM中加入分散剂Pluronic酸（终浓度0.1%）和阴离子转运抑制剂溴磺酞（bromosulfophthalein，终浓度20 µM）可提高负载效率。需要双通道采集的比率型化学探针或基因编码的FRET探针的使用，与局部Ca成像所需的快速采集速度不兼容2+ 反应</li>
	<li>用EM缓冲液将样品洗涤3次，随后在1 mL EM缓冲液中于21 °C继续孵育，以使AM基团发生水解。Fluo-4负载的细胞应立即使用，或在接下来的90分钟内使用（保持在21 °C）。</li>
</ol>
2. 局部Ca2+反应的感染与图像采集
<ol>
	<li>将载有 Fluo-4 负载细胞的盖玻片放入成像室或玻璃底培养皿中。用 EM 缓冲液在成像室或一次性玻璃底培养皿中洗涤样品 3 次，以去除可能由细胞裂解释放的化合物。加入 1 mL EM 缓冲液。</li>
	<li>将培养皿置于倒置荧光显微镜的载物台上，并将温度维持在 33 °C。 
	注意：该温度是在 Shigella 侵袭过程所需的最佳温度与减缓 Ca2+ 反应速度以观察局部反应之间的一种折中选择。我们使用配备相差环的 63 倍油浸物镜（NA = 1.25）。</li>
	<li>选择一个显微视野，并设置采集参数（包括曝光时间和必要时的像素合并），以优化 Fluo-4 的荧光信号。 
	注意：局部 Ca2+ 成像的主要挑战在于反应幅度低且持续时间短，因此需要至少每 30 毫秒采集一次图像。目前市面上一些背照式 EM-CCD 或 C-MOS 相机具备足够的灵敏度，可利用 Fluo-4 检测局部 Ca2+ 反应。检测灵敏度还关系到减少光损伤或因高频激发 Fluo-4 而引发的自发性反应等伪影。在此实验中，采用 470 nm LED 光源，配备 480 ± 40 nm 带通激发滤光片、505 nm 二向色镜和 527 ± 30 nm 带通发射滤光片，光照强度设置为最大强度的 5%，并结合 1.0 中性密度滤光片，以在有限时长的连续采集过程中最大限度减少上述问题。通常对每段持续 120 秒的图像流进行局部 Ca2+ 信号分析。在此低照度条件下，2 分钟的连续采集过程中未观察到荧光探针的光漂白现象。只要更换不同的视野，即可对同一样品进行多次连续采集。一般情况下，首先在无细菌刺激的对照视野中进行一次初始采集，以确认无自发性反应发生。若观察到自发性反应，则需用 EM 缓冲液反复洗涤样品，直至不再出现此类反应。</li>
	<li>向样品中添加细菌时，从培养皿中移除 500 µL EM 缓冲液，并加入 500 µL 步骤 1.1.6 中制备的细菌悬液，使终浓度 OD600nm 达到 0.05。操作过程中需特别注意避免移动已选定的显微视野；该体积可确保细菌充分混合并均匀分布在细胞样品表面。</li>
	<li>在加入细菌后立即开始图像采集。或者，也可在加菌后 10 分钟开始采集，此时间对应于细菌在实验条件下沉降到细胞表面所需的时间。采集结束后，获取所选视野的相差图像，以观察与细胞接触的细菌以及与细菌侵袭位点相关的膜皱褶结构。</li>
	<li>按照步骤 2.5 的方法重复图像采集过程，采集间隔应根据图像采集时长、文件保存时间和新视野选择的需要合理安排，以覆盖整个侵袭过程。 
	注意：对于 Shigella，我们发现，在细菌沉降 10 分钟后，每隔 5 分钟进行一次持续 20 分钟的采集流，即可覆盖大多数侵袭事件。</li>
	<li>完成图像采集程序后，向样品中加入终浓度为 2 µM 的 Ca2+ 离子载体离子霉素（ionomycin），以测定 Ca2+ 信号的最大振幅。每 3–5 秒采集一次图像，直至信号稳定，通常不超过 10 分钟。</li>
	<li>随后加入终浓度为 10 mM 的 Ca2+ 螯合剂 EGTA，以测定无 Ca2+ 条件下的荧光信号水平。每 3–5 秒采集一次图像，直至信号稳定，通常不超过 10 分钟。 
	注意：由于整体 Ca2+ 变化的动力学相对较慢，因此这些采集可每 3–5 秒进行一次（非连续流模式），以便在连续处理过程中对同一显微视野进行 Ca2+ 成像。</li>
</ol>
3. 分析
<ol>
	<li>以 ΔF/F0 的百分比形式表示随时间变化的胞质 Ca2+ 水平变化，其中 ΔF 代表感兴趣区域（ROI）平均荧光强度的变化值，F0 代表同一 ROI 的基础荧光强度，该基础值需减去视野中无细胞区域的非相关背景荧光。
	<ol>
		<li>去除不同视野中各细胞的基础荧光水平，即对应的基础值；由于在特定时间序列成像中局部 Ca2+ 反应频率较低且持续时间相对较短，这些基础水平可明确确定。 
		注意：应量化与所研究问题及致病模型相关的反应特征。通常，在分析 Ca2+ 信号时需考虑多个参数，包括表现出局部或全局 Ca2+ 反应的细胞频率，以及这些反应的持续时间、幅度和频率。在 Shigella 感染及局部反应的情况下，分析的另一个重要方面是反应与细菌入侵位点之间的空间关联性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为量化表现出全局或局部反应的细胞百分比，需在对应 Fluo-4 荧光强度变化的时间序列图像中，对细胞绘制 ROI。
	<ol>
		<li>设定严格参数以识别局部 Ca2+ 反应，例如反应幅度需高于背景荧光波动的三倍以上，或持续时间至少达 200 ms，以避免假阳性结果。 
		注意：一般而言，即使微小的局部 Ca2+ 反应也可通过其信号轮廓与背景噪声区分开来。ROI 应足够大，以整合足够的荧光信号，从而能够检测到局部变化。根据 Fluo-4 检测信号的强度，这些 ROI 可能对应直径为 2–5 mM 的圆形区域。</li>
		<li>在同一细胞的不同区域测量两处平均 Fluo-4 荧光强度的变化，以判断反应为局部性或全局性。 
		注意：使用可实时显示所选区域平均荧光强度随时间变化的成像软件，有助于对大量细胞进行分析。市面上的商业成像软件通常具备此功能，也可使用免费软件 Icy 中的 ROI Intensity Evolution 插件实现。</li>
		<li>确定表现出局部反应的细胞百分比。 
		注意：该百分比基于显微镜视野中分析的细胞总数计算得出，细胞数量应足够多，以便采用非参数检验进行具有统计学意义的分析。</li>
		<li>确定局部反应的持续时间。 
		注意：局部 Ca2+ 反应可根据其持续时间范围（即 小于 500 ms、5 至 10 s 之间，或超过 10 s）及其与 Shigella 入侵位点的关联性进一步区分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>量化反应的幅度。首先，根据步骤 2.1.7 中的方法校准每个细胞的最大 Ca2+ 信号和细胞背景水平。由于每个细胞的 Fluo-4 负载量可能不同，应在视野中对单个细胞分别进行校准。
	<ol>
		<li>将反应幅度表示为最大反应的相对百分比。</li>
		<li>进行统计学检验：先进行正态性检验，随后采用参数检验分析不同样本间反应幅度的潜在差异。</li>
		<li>通过比对相应相差图像中细菌诱导的细胞膜皱褶结构的定位，确定这些反应与细菌入侵位点之间的空间关联性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li>
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<li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567(2013).</li>
<li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+PtdIns%284%2C5%29P%282%29+into+PtdIns%285%29P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li>
<li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li>
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<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fluorescent+Ca2%2B+indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li>
<li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2%2B+signals+during+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li>
<li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes%2C+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本文描述了我们设计的实验方案，用于在Shigella侵袭过程中相对较短的动力学阶段监测局部Ca2+信号，以及在Shigella较长动力学过程中监测全局Ca2+反应。以下列出了为优化Ca2+信号检测并最大限度减少对生物过程干扰所需解决的关键问题。
化学 与 基因编码的 Ca2+ 探针：
为了成像局部 Ca2+ 的变化，我们采用了 Fluo-4 化学探针，因其具有较高的量子产率和快速的响应动力学。由于成像所需的速度较快，无法使用比率型探针，因为无法实现双波长同步采集。然而，病原微生物的使用可能会干扰基于 Ca2+ 化学探针的标准操作流程。例如，志贺氏菌（Shigella）持续感染细胞超过 60 分钟会阻碍细胞对化学探针的负载，这可能是由于病原体诱导的宿主细胞质膜结构改变所致。与此一致的是，在长时间感染过程中，可观察到细胞相关 Fluo-...

Ca2+ 调控所有已知的细胞过程，包括细胞骨架重组、炎症反应以及与宿主-病原体相互作用相关的细胞死亡通路1,2,3。在生理条件下，细胞质基础 Ca2+ 浓度较低，处于数百 nM 范围内，但在激动剂刺激下可发生短暂升高。这些变化通常通过质膜和内质网膜上的泵和通道作用呈现出振荡行为。这些振荡的特征由 Ca2+ 升高的周期、持续时间和幅度决定，并被细胞解码，从而触发特定的细胞反应，这一机制被称为 Ca2+ 编码4,5。在病理条件下，细胞质 Ca2+ 浓度持续升高可能导致细胞死亡，其机制与线粒体膜通透性增加以及促凋亡或坏死因子的释放有关6,7。
Shigella 是细菌性痢疾的致病菌，通过III型分泌系统（T3SS）将效应蛋白注入宿主细胞，从而侵入上皮细胞8,9。Shigella 对宿主细胞的侵袭会引发局部和全局性的 Ca2+ 信号，这些信号由 T3SS 所介导。与孔形成毒素类似，T3SS 转位子插入宿主细胞膜并介导效应蛋白的注入，很可能也负责激活磷脂酶C（PLC）以及肌醇-1,4,5-三磷酸（InsP3）依赖的 Ca2+ 释放。局部 PLC 的激活与 Shigella 侵袭位点处聚合肌动蛋白的积累共同导致异常持久的 InsP3 依赖性 Ca2+ 释放10。III型效应蛋白 IpgD 是一种磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）-4-磷酸酶，可减少局部 PIP2 含量，从而调控 PLC 可用的底物量以生成 InsP3，这有助于将细菌侵袭位点的局部 Ca2+ 反应限制在局部范围11,12。这些局部 Ca2+ 反应可能促进 Shigella 侵袭位点处的肌动蛋白聚合10。然而，Shigella 引发的全局性 Ca2+ 反应虽非细菌侵袭过程所必需，却可触发细胞膜上连接蛋白半通道的开放，并导致 ATP 释放至胞外空间。释放的 ATP 以旁分泌方式作用，继而刺激邻近未感染细胞产生 Ca2+ 振荡反应。IpgD 还参与将全局性 Ca2+ 反应塑造成动力学缓慢、随机且孤立的响应模式。最终，在持续较长时间的细菌感染后，IpgD 会导致 InsP3 介导的 Ca2+ 信号被抑制。通过干扰 Ca2+ 信号通路，IpgD 延缓了 Ca2+ 依赖性钙蛋白酶的活化，从而抑制了黏着斑结构的解聚以及感染细胞的过早脱落13。
尽管Ca2+信号参与了致病过程中的关键环节，但使用微生物会带来一系列在经典激动剂研究中未曾遇到的技术挑战。本文所述方案采用了一种常用的荧光Ca2+化学指示剂Fluo-4，我们对其进行了优化，用于表征志贺氏菌（Shigella）感染过程中局部的Ca2+信号。文中讨论了检测这些信号的关键步骤，以及为定量分析所采用的操作流程，此类分析对于阐明细菌效应蛋白在Ca2+信号传导中的作用至关重要。

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 版本 7.7</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolLED 照明系统 pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 高底培养皿&amp;nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤（TCS broth）</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>TCS 琼脂</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>刚果红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>&lt;em&gt;Shigella flexneri&lt;/em&gt; 血清型 V，表达 AfaE 黏附素</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;ipgD&lt;/em&gt;-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>表达 AfaE 黏附素的同基因 ipgD 突变株</td><td></td></tr></tbody></table>

成像 ca2+ 反应期间 志贺氏菌 上皮细胞感染

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ 是一种普遍存在的离子，参与所有已知的细胞过程。虽然全局性的 Ca2+ 反应可能影响细胞命运，但细胞质中游离 Ca2+ 浓度的局部变化——与细胞内储存库的释放或质膜通道介导的内流相关——调控着细胞皮层区域的细胞活动。黏附或侵入宿主细胞的病原体会引发宿主质膜下方肌动蛋白细胞骨架的重组，这可能同时影响全局性和局部性的 Ca2+ 信号传导。由于这些事件可能以较低频率、近似随机的方式在较长时间的动力学过程中发生，因此对病原体诱导的 Ca2+ 信号进行分析带来了重大的技术挑战，亟需解决。
在此，我们报告了用于检测全局和局部 Ca2+ 信号在……时出现 志贺氏菌 上皮细胞感染。在这些方案中，与长时间暴露以及与钙离子荧光探针激发相关的光损伤所导致的假象2+ 通过在特定时间段内严格控制采集参数来对荧光探针进行故障排查 志贺氏菌 侵袭。通过严格的操作程序分析全细胞质钙离子的振幅和频率2+ 使用化学探针 Fluo-4 在延长的感染动力学过程中检测信号。

志贺氏菌侵袭与非典型的持久性局部 Ca2+ 反应相关：
按照上述方案，用 Fluo-4 负载的 HeLa 细胞经野生型（WT）处理 志贺氏菌 并进行连续采集以分析 Ca2+ 信号。一个代表性实验如图所示。 图1，包含单个细胞在感兴趣区域内的Fluo-4探针荧光强度平均值的时间序列延时图像，以及相应的相差图像图1A，左侧面板）。 志贺氏菌 侵袭位点的特征是相差图像中检测到的细胞膜皱褶（图1A，箭头）。游离胞质 Ca 的非典型局部增加2+ 在...处观察到 志贺氏菌 侵袭位点的振幅变化，持续时间范围为 2.5 - 5 s（图1A</s...

本文介绍了可视化由志贺氏菌（Shigella）感染HeLa细胞所引发的钙离子（Ca2+）反应的实验方案。通过优化细菌感染参数并结合Ca2+荧光探针进行成像，可表征细菌在较宽感染动力学范围内诱导产生的非典型全局性和局部性Ca2+信号。

成像 Ca2+ 反应期间 志贺氏菌 上皮细胞感染

Ca2+ 是一种普遍存在的离子，参与所有已知的细胞过程。虽然全局性的 Ca2+ 反应可能影响细胞命运，但游离 Ca2+ 的局部变化……

本研究采用化学探针进行荧光显微分析，其总体目标是分析致病性志贺菌感染宿主细胞过程中引发的局部及全局钙离子响应。该方法有助于解答细胞微生物学领域的一些关键问题，例如病原体诱导的信号转导如何导致细胞骨架重排或细胞死亡。该技术的主要优势在于，通过使用化学探针，可追踪与病原体干扰的局部过程相关的局部钙信号。初学者通常会因参数设置不当而遇到困难，这些参数需既能用于追踪局部钙信号，又能保持生物样本的完整性。首先，将表达AfaE黏附素的野生型志贺氏菌接种于含有0.01%刚果红的胰蛋白胨大豆琼脂或TCS琼脂平板上，于37°C培养18小时。从划线平板上挑取三个红色菌落，接种至含有75 µg/mL氨苄青霉素的TCS液体培养基中，制备预培养物。将液体培养物置于37摄氏度、200 rpm的摇床培养箱中培养16小时。随后，按1:100的稀释比例将细菌预培养物接种至TCS培养基中。将培养物置于37摄氏度、200 rpm的摇床培养箱中继续培养2小时。确保在600纳米处的光密度值为0.2至0.4。在13,000 ×g、21°C条件下离心培养物2分钟，并将沉淀重悬于等体积的EM培养基中。用EM缓冲液稀释细菌悬液，使其终浓度OD600为0.1，并立即使用，或在21°C下保存并在60分钟内使用。在含1克/升葡萄糖的DMEM培养基中加入10%胎牛血清（FCS），于37摄氏度、10%CO2条件下培养HeLa细胞。在含4.5克/升葡萄糖的DMEM培养基中加入10%FCS和非必需氨基酸，于37摄氏度、10%CO2条件下培养TC7细胞。为维持细胞生长，需定期传代细胞，以避免因融合状态导致的生长接触抑制。这对于高钙探针的负载和转染效率至关重要。用胰蛋白酶消化并计数TC7细胞。在进行HeLa细胞实验的前一天，将细胞以每孔3 × 10⁵个细胞的密度接种于六孔板中的无菌25毫米直径圆形盖玻片上。随后，为使细胞在实验前充分极化，以每孔4 × 10⁵个细胞的密度接种，并培养5至7天，每天更换培养基。实验当天，吸除培养基，用1 mL EM培养基洗涤细胞3次。加入含3 μM Fluo-4 AM的EM缓冲液对细胞进行负载，并将培养板置于21°C孵育30分钟。用EM缓冲液洗涤样品三次，然后加入1毫升EM缓冲液，在21摄氏度下孵育细胞，以促进AM基团的水解。将含有Fluo-4负载细胞的盖玻片放入成像室或玻璃底培养皿中。用EM缓冲液洗涤样品三次，以去除可能由细胞裂解产生的化合物。然后加入 1 毫升 EM 缓冲液。将样品室置于倒置荧光显微镜载物台上，温度维持在 33 摄氏度。选择一个显微视野，并设置采集参数，包括曝光时间以及必要时的像素合并，以优化 Fluo-4 荧光信号。向样品中添加细菌时，小心地从腔室中移除 500 微升 EM 缓冲液，并加入 500 微升细菌悬液，使最终 OD 600 达到 0.05。立即开始采集图像，或等待 10 分钟，使细菌沉降到细胞上。在采集过程结束时，对选定视野获取相差图像，以观察与细胞接触的细菌以及与细菌侵袭位点相关的细胞膜皱褶。根据图像采集、文件保存以及选择新视野所需的时间间隔，重复采集过程，以覆盖整个实验流程。在采集过程结束时，向样品中加入 2 µM 钙离子载体离子霉素（ionomycin），以确定钙信号的最大振幅。每 3 至 5 秒采集一次图像，直至信号稳定，通常不超过 10 分钟。随后加入钙螯合剂EGTA，使其终浓度为10毫摩尔，以测定无钙条件下的荧光信号。每3至5秒采集一次图像，直至信号稳定，通常不超过10分钟。按照文本方案进行图像分析。在本实验中，将野生型志贺氏菌作用于负载 Fluo-4 的 HeLa 细胞，并进行连续图像采集以分析钙信号。对单个细胞在感兴趣区域内的 Fluo-4 探针荧光强度进行时间序列成像并取平均值，同时展示相应的相差图像。在志贺氏菌侵染位点处，观察到游离胞质钙离子浓度出现非典型的局部升高，其幅度各异，持续时间介于 2.5 至 5 秒之间，随后出现感染细胞内的全局性升高。在此示例中，一种等基因突变菌株因缺乏III型效应蛋白IpgD（一种磷脂酰-4,5-二磷酸磷酸酶）而诱导出更广泛的全局性反应，且局部非典型反应较少，持续时间较长，与野生型志贺氏菌株相比表现不同。如本实验所示，对感染动力学延长期间的全局钙反应进行成像，显示在用野生型志贺氏菌攻击30分钟后，钙反应频率下降。最后，对细胞对钙离子激动剂组胺的剂量依赖性反应进行定量分析，表明在志贺氏菌感染的晚期阶段，肌醇三磷酸依赖性的钙释放受到抑制。按照此操作步骤，可同时结合使用相容的流体和成像方法，以研究钙信号在特定过程中的作用。切记，操作病原体可能具有极高危险性，在执行该操作时，必须始终采取相应的预防措施，例如妥善处理废弃物、清洁被污染的表面或设备等。

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科研

JoVE Journal

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