Name: 从刺客臭虫和其他 Heteropteran 昆虫身上采集毒液毒素 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习从刺客臭虫及其他半翅目昆虫采集毒液毒素的方法，包括电刺激、骚扰刺激和腺体解剖技术。这些方案为神经科学和昆虫学研究提供了基础，有助于揭示未充分研究的昆虫毒液成分及其潜在应用价值。

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我们感谢澳大利亚研究理事会（G.F.K. 获资助项目 DP130103813 和 LP140100832，EABU 获 DECRA 资深研究员项目 DE160101142）、澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（G.F.K. 获主要研究员基金 APP1044414）以及昆士兰大学（A.A.W. 获博士后研究员基金）提供的经费支持。

本方案符合昆士兰大学所制定的政策 教学与科研中动物的负责任照护与使用 （PPL 4.20.11）以及国家卫生与医学研究理事会的 澳大利亚科学实验动物护理与使用规范 (8th 2013年版
注意：处理猎蝽时需小心，避免被其毒液伤害。处理具有防御性喷射毒液能力的物种时，应注意保护眼睛。在整个操作过程中需注意避免损伤实验动物，包括监测橡胶带等固定装置的压力，确保吻部未受损伤。
注意：在目标1-3中采集毒液前，可选择通过将动物暴露于CO2中0.5-2分钟，或将其冷却至4-10 °C进行麻醉，以方便安全转移和固定。麻醉并非必需步骤，但可能有助于更安全地固定敏捷或强壮的个体。然而，动物必须保持清醒状态，以便进行毒液采集。在决定是否添加蛋白酶抑制剂时，需考虑后续应用的需求。
1. 通过电刺激采集毒液毒素
<ol>
	<li>获取活体样本以采集毒素。</li>
	<li>使用预先制备的塑料镊子，其两端分别装有正负电极。将通电镊子连接至电刺激器或可调节电压的恒压电源。
	<ol>
		<li>对于小型（约 10 mm）和大型（约 25 mm）的猎蝽，分别使用 15 V 和 25 V 的峰值电压。</li>
		<li>对于较大的异翅亚目昆虫（如大田鳖），可使用高达 40 V 的电压。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用橡皮筋固定在胸部，将活虫固定于平台之上以进行约束。</li>
	<li>将口器末端置于合适的收集尖端中。对于猎蝽，使用 P200 移液器吸头；对于大田鳖，剪去 P200 吸头的末端以增大开口尺寸。
	<ol>
		<li>用一对洁净的闭合镊子轻轻抬起口器，并将收集吸头的开口端套在口器末端。</li>
		<li>如有需要，可在将口器置入收集吸头前，先吸入约 5 µL 超纯水。此举可减少毒液残留在吸头内部的损失，但所采集的毒液会被稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>施加电刺激。将刺激电极浸入导电凝胶中（例如 2.5 M NaCl/50% 甘油）。将电极置于胸部；对于大田鳖科昆虫，将两个电极置于头部背侧后部表面。</li>
	<li>储存毒液以防止自降解。毒液排出后，应迅速转移至 -20 °C 或 -60 °C 的离心管中，或含有蛋白酶抑制剂混合物的离心管中。</li>
	<li>重复步骤 1.5 和 1.6，直至获得足够的毒液，或不再有新的毒液排出为止。</li>
</ol>
2. 通过刺激采集毒液毒素
<ol>
	<li>按照第1.1节和第1.3–1.4节所述，准备动物以采集毒液，并将吻部尖端置于收集室中。</li>
	<li>若毒液自发排出，则进入步骤2.3；否则，用镊子轻轻触碰动物的腿部、腹部和触角进行刺激，直至产生毒液。</li>
	<li>迅速将毒液转移至置于-20 °C或-60 °C的离心管中，或根据需要转移至含有蛋白酶抑制剂混合物的离心管中。</li>
</ol>
3. 通过刺激毒液获取毒液毒素 &#34;吐液&#34; 物种
<ol>
	<li>在将昆虫从饲养容器中取出之前，应将其麻醉或部分麻醉，以防止其提前喷射毒液。</li>
	<li>诱发毒液喷射行为。使用标准90 × 16 mm培养皿的深盖进行限制并重新定位昆虫。将皿盖置于昆虫后方稍远处，距离其上方1–4 cm，以防止其飞行。大多数昆虫会多次喷射毒液，通常连续快速喷射。确保所有毒液均收集在培养皿盖的内表面。</li>
	<li>用10 µL超纯水冲洗培养皿内表面以收集毒液，并迅速转移至置于-20 °C或-60 °C的离心管中，或转移至含有蛋白酶抑制剂混合物的离心管中。</li>
</ol>
4. 通过腺体解剖采集毒液毒素
<ol>
	<li>处死动物。使用高浓度麻醉剂或通过暴露于 CO2 超过 &#62;5 分钟的方式处死动物。将纯 CO2 直接通入动物饲养容器的通气孔中。</li>
	<li>将昆虫固定于解剖托盘上。对猎蝽类昆虫，通过腹面进行解剖（4.3）。对大水蝽类昆虫，通过背面进行解剖（4.4）。</li>
	<li>腹面解剖
	<ol>
		<li>在腹部后端插入三枚大头针，以固定昆虫，注意避免刺穿毒腺。</li>
		<li>使用微型手术刀在腹部腹面中线处做一小切口。用微型剪刀从中线切口向前延伸至头部，注意仅切割外骨骼，避免损伤内部结构。</li>
		<li>为暴露内部结构，从中线切口向两侧做多个横向切口。然后将腹面外骨骼的每一侧瓣向后固定，以显露内部结构。</li>
		<li>对于体型较大的猎蝽，分别在腹部中段、腹部前段、第一与第二对足之间，以及第一对足前方做四个横向切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>背面解剖
	<ol>
		<li>在基部附近移除翅膀。在腹部后端插入三枚大头针，以固定昆虫，注意避免刺穿毒腺。</li>
		<li>使用微型剪刀和手术刀从头部至腹部做一条中线切口，注意仅切割外骨骼，避免损伤内部结构。</li>
		<li>用力将昆虫的两半分开。沿昆虫体长方向在两侧放置数枚大头针，使内部体腔保持暴露状态。</li>
		<li>使用镊子移除飞行肌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>淹没解剖托盘。加入 PBS 至淹没昆虫，使内部结构浮起，便于观察。</li>
	<li>使用镊子和显微剪刀小心移除结缔组织、神经组织和气管。毒腺呈细长、半透明状结构，沿消化道两侧延伸。
	<ol>
		<li>根据其典型形态识别主腺体，包括前叶和后叶，以及在门部汇合的两条导管。</li>
		<li>如需识别副腺体，可沿门部导管进行追踪。切断从门部发出的两条导管，以游离主腺体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集所需腺体腔内容物。将腺体转移至含有 30 µL PBS 或含蛋白酶抑制剂混合物的 PBS 的微量离心管中，置于冰上。用洁净锋利的大头针刺破腺体。
	<ol>
		<li>涡旋振荡 10 秒，离心（1 分钟，5,000 × g，4 °C），以排空腺体腔内容物。用镊子移除腺体组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>澄清毒素提取物。离心（5 分钟，17,000 × g，4°C）以去除任何固体颗粒，保留上清液，弃去沉淀。储存于 -20°C 或 -60°C，以防止自溶性降解。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

收集猎蝽毒液最关键的步骤是根据研究目的选择合适的方法。文中介绍的三种收集异翅亚目昆虫毒液的方法，各有其优缺点，具体选择需根据后续应用而定。
诱导臭虫从其吻部排出毒液（方案1-3）可避免毒液被腺体组织污染。此外，这些方法为非致死性，可在臭虫的生命周期内多次重复使用。根据多项研究，电刺激通常能获得最大量的毒液，并且所得毒液对猎物昆虫具有强效毒性5,8。激发防御反应是另一种促使吻部释放毒液的方法，且该方法所获得的毒液蛋白质组成可能与电刺激所得毒液不同8。然而，电刺激和诱发防御反应并不适用于许多物种，且在缺乏对毒腺分泌物输出进行平行研究的情况下，尚不清楚当前采集的是哪一个腺腔（或哪些腺腔的组合）中的分泌物。
通过解剖采集毒液（方案4）在许多方面具有互补性。解剖法可直接获取储存的毒液，并能对毒腺的各个区室分别采集或混合收集。即，从而避免了采集到“错误”毒液...

异翅亚目昆虫的毒液是具有强生物活性的物质1。例如，以血液为食的异翅亚目昆虫（如锥蝽（Triatominae）和臭虫（Cimicidae））所分泌的毒液或唾液可通过干扰止血过程来促进取食2。这些毒液中的毒素可作用于多个生理通路，包括凝血、血小板聚集和血管收缩，同时也影响疼痛和瘙痒相关通路。大多数其他异翅亚目物种的毒液则适应于捕食而非吸血。当注入无脊椎动物体内时，其毒液可导致麻痹、死亡和组织液化3,4。当注入脊椎动物体内时，其毒液也可能产生严重效应。例如，刺蝽Holotrichius innesi的毒液注入脊椎动物后可引起疼痛、肌肉麻痹和出血；被该昆虫毒害的小鼠会因呼吸麻痹而迅速死亡5。
转录组学和蛋白质组学研究已揭示了部分异翅亚目昆虫毒液的蛋白质组成。捕食性物种的毒液富含蛋白酶、其他酶类以及结构和功能未知的多肽和蛋白质6,7,8。锥蝽毒液富含 triabin 蛋白家族成员，该家族成员对凝血、血小板聚集和血管收缩具有显著影响2,9。然而，大多数毒液生物活性背后的毒素成分尚不清楚。例如，已报道锥蝽 Triatoma infestans 的毒液具有镇痛作用并可抑制钠离子通道10，但其有效成分仍有待阐明。同样，猎蝽毒液中引起麻痹或疼痛的具体成分亦不清楚。要鉴定介导特定毒液生物活性的毒素，并对新型毒液毒素的结构与功能进行表征，前提是能够获取毒液。
已通过电刺激5,6,7,8,11,12,13、诱发防御反应4,8、机械挤压胸部12,14,15,16、解剖分离毒腺8,17,18,19,20,21,22，以及应用毒蕈碱型乙酰胆碱受体激动剂23等方法从异翅亚目昆虫中获取毒液。由于异翅亚目昆虫毒腺具有特殊的形态结构，评估任一采集方法的潜在优缺点均较为复杂。其毒腺由一个主腺体和两个独立腔室——前主腺（AMG）与后主腺（PMG）——以及一个附属腺（AG）组成。这些不同的腺体区室可产生不同的蛋白质分泌物，可能分别特化于捕食、防御和胞外消化等不同生物学功能8,17。在猎蝽科的Peiratinae亚科和Ectrichodiinae亚科昆虫中，AMG被认为与捕食相关，而PMG则与胞外消化相关17。然而，在猎蝽科Harpactorinae亚科的Pristhesancus plagipennis中，PMG特化用于捕食和消化，而AMG则被推测分泌防御性毒液8。附属腺（AG）在猎蝽中被认为分泌功能较弱8，而在大田鳖中则被描述为主要的蛋白酶储存部位23。显然，仍需进一步研究以明确各类异翅亚目昆虫不同腺体区室的功能，并确定大多数毒液毒素的具体作用。本报告中，我们描述了为实现上述目标而从异翅亚目昆虫中采集毒液毒素的实验方案。

<table><tbody><tr><td>电刺激器</td><td>Grass Technologies</td><td>S48 Square Pulse Stimulator</td><td>用于实现脉冲式电刺激的电刺激设备</td></tr><tr><td>轻质镊子</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E122B</td><td>用于操作活体有毒昆虫</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>4693124001</td><td>用于防止毒液发生自溶性降解</td></tr><tr><td>解剖器械</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E152Micro</td><td>用于精细解剖操作</td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E162</td><td>用于精细解剖操作</td></tr></tbody></table>

从猎蝽及其他异翅亚目昆虫中采集毒液毒素

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

异翅亚目昆虫，如猎蝽（Reduviidae）和大水蝽（Belostomatidae），源自一个共同的捕食性且具毒性的祖先，现存大多数异翅亚目昆虫仍保留这种营养策略。部分异翅亚目昆虫已转为取食脊椎动物血液（例如锥蝽亚科的接吻虫，Triatominae；以及臭虫科的床虱，Cimicidae），而另一些则重新回归植食性（大多数盾蝽总科昆虫，Pentatomomorpha）。然而，与蜘蛛、蝎子和蛇类的毒液相比，除接吻虫在吸血过程中利用唾液辅助取食外，人们对异翅亚目昆虫毒液的了解仍然十分有限。
对异翅亚目昆虫毒液毒素进行表征的一个障碍在于其毒腺/下唇腺的结构与功能，这些腺体不仅形态复杂，还承担多种生物学功能（防御、捕食和胞外消化）。本文中，我们介绍了三种已成功用于采集异翅亚目昆虫毒液的方法。首先，我们提出电刺激是一种便捷的毒液采集方式，所获得的毒液在注入猎物体内时常具有致死性，且可避免腺体组织的污染。其次，我们发现对动物进行轻度骚扰足以促使某些类群的异翅亚目昆虫从吻部排出毒液，甚至喷射毒液。第三，我们描述了通过解剖麻醉后的昆虫以获取毒腺来收集毒液毒素的方法。该方法是对其他方法的补充，可用于那些电刺激和骚扰方法无效的分类群的毒素采集。这些实验方案将有助于研究人员从异翅亚目昆虫中获取毒素，用于结构与功能的表征研究，并探索其在医学和农业中的潜在应用。

一些异翅亚目物种，例如猎蝽亚科 P. plagipennis 以及猎蝽亚科 Platymeris rhadamanthus，可稳定获得大量（5-20 µL) 对电刺激产生的毒液量 (表1）。通常情况下，大多数刺蝽亚科、猎蝽亚科和矛蝽亚科的蝽类对此方法可产生毒液。在细足蝽亚科蝽类中，电刺激可诱导其分泌毒液 Oncocephalus sp. 但不是 Thodelmus sp. 采集的Holoptilinae和Emesinae亚科蝽类未获得显著量的毒液例如 足以通过质谱分析进行检测）以响应电刺激。电刺激也可用于从大田鳖科昆虫和捕食性蝽类中采集毒液。然而，对水蝎（Nepidae）进行电刺激仅诱导头部腺体内容物的释放，而非来自吻部的毒液。某些物种无法通过电刺激成功采集毒液，最可能的原因在于其毒腺结构的形态复杂性以及控制毒液释放的生理机制。8.
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尽管半翅目异翅亚目（Heteroptera，属于昆虫纲半翅目）中的许多昆虫具有毒性，但它们毒液的成分及其毒素功能在很大程度上仍不清楚。本实验方案描述了利用电刺激、扰动刺激以及毒腺解剖等方法采集异翅亚目昆虫毒液，以供进一步表征研究。

猎蝽科（Reduviidae）和田鳖科（Belostomatidae）等异翅亚目昆虫源自一个共同的捕食性且具毒性的祖先，……

猎蝽是一类利用毒液使猎物麻痹并进行体外消化的昆虫。然而，尽管动物毒液因其在新型药物、杀虫剂和科研工具方面的潜力而备受关注，猎蝽所产生的毒素却几乎未被充分表征。造成这一现状的原因之一在于，与蜘蛛和蝎子等广为人知的有毒节肢动物相比，猎蝽的知名度较低。另一个原因是，直到最近，关于如何采集其毒素的信息仍然十分有限。在本视频中，我们将介绍使研究人员能够成功从猎蝽中采集毒液毒素的方法，以及相关昆虫（例如可杀死鱼类的大型水生蝽类）的毒素采集方法。方案一描述了通过电刺激采集毒液的方法。首先，采集合适的昆虫。成虫和较大的若虫最容易操作。建议在昆虫吸血后两到七天内使用，以确保昆虫已积累足够的毒液储备，同时不会因饥饿而影响状态。准备一对尖端带有电极的镊子，并将其连接到电源。理想情况下，该电源应为能够以5赫兹频率输出5毫秒脉冲的电刺激器。对于小型或大型昆虫，分别使用15至25伏的峰值电压。若无电刺激器，可使用5至12伏的恒定电压。用橡皮筋和泡沫平台固定昆虫。将昆虫的喙放入收集管中。对于大多数猎蝽而言，P200 移液枪吸头是理想的选择。可选步骤：在采集前可在吸头尖端加入少量水，以确保毒液回收率最大化。在电极上涂抹导电凝胶，打开电源，将通电的镊子施加于昆虫体上。在监测吻部毒液排出情况的同时，尝试多种接触点。将毒液储存在冷冻温度下，以避免自溶性降解。使用新的移液管重复电刺激，直至不再有毒液排出为止。方案二描述了通过激发防御反应来采集毒液的方法。按照上述方法准备并固定臭虫，将喙插入收集尖端。轻轻骚扰臭虫以激发其防御反应，但不得伤害该动物。有时，仅通过固定动物或将其吻部插入收集管即可引发防御反应，伴随吻部排出毒液。若未发生此反应，可轻柔触碰动物的胸部、腿部、腹部，尤其是触角，以诱导其排出毒液。在本文的第三种方案中，我们还描述了如何采集具有防御性喷射毒液行为的物种的毒液。方案四描述了如何通过解剖直接从毒腺中采集毒液。将动物暴露于二氧化碳中10分钟以进行麻醉。在腹部后段插入三枚大头针以固定昆虫，注意不要刺破毒腺。使用微型手术刀在腹部腹侧做一条短的正中切口。用微型剪刀将正中切口向前延伸至头部，注意仅切割外骨骼，避免损伤内部结构。为暴露内部结构，从正中切口向昆虫体侧做多个横向切口。每两个切口之间的腹侧外骨骼随后可以向后固定，以暴露内部结构。用生理盐水充满解剖托盘，直至虫体完全浸没，使内部结构浮起，更易于观察。毒腺表现为半透明的细长结构，位于消化道两侧并由此向外延伸。使用镊子和显微剪仔细去除结缔组织、神经组织和气管，注意不要破坏消化道或毒腺。主腺因其特有的结构而易于识别，具有前叶和后叶，以及在门部汇合的两条导管。对于猎蝽以及其他可能的异翅亚目昆虫，几乎所有毒素都储存在主腺两个叶腔的管腔内。因此，在将主腺体从气管和结缔组织中游离后，可切断从门部发出的两条导管，收集主毒腺。若需同时获取副腺体，通常其紧贴肠道，可通过追踪门部发出的导管明确辨认。无论何种情况，均需注意避免过早破坏腺体，导致毒液泄漏至周围生理盐水中。若需分离主腺体的叶部，应在将其从生理盐水中取出后立即进行，并立即按照书面稿件中步骤4.6和4.7所述方法采集腺腔内容物。实验结果会因所使用的具体子方案和昆虫种类而异。本视频中介绍的第一和第二子方案分别展示了通过电刺激和扰动刺激采集毒液毒素的方法。这两种方法通常都能获得浓度约为每毫升含 50 至 250 毫克蛋白质的液体，其中包含 100 多种基于蛋白质的组分，包括酶、成孔毒素和多肽。这两种方案的主要优点是操作快速、对生物体无致命伤害，且毒液未被腺体组织污染。通过电刺激或刺激诱导采集毒液的最大缺点是，所获得毒液的腺体来源不明确，且采集到的毒液蛋白质含量可能因操作方案的不同而存在差异。此外，并非所有异翅亚目捕食性物种都对电刺激和骚扰产生有效反应。在最后一个子方案中，我们展示了如何解剖吸血膨胀的毒腺以直接采集毒素。该技术同样可获得多种蛋白质的混合物，但在本情况下，毒液毒素可能受到一定程度的腺体组织污染。然而，从解剖的腺体中采集毒素的一个优势在于能够准确知晓毒素来源的腺体区室。总之，我们建议研究人员根据其研究问题选择合适的采集方法。例如，针对物种内毒液使用生物学的研究，采用多种采集技术将更有助益。对于生物勘探研究而言，根据具体的实验设计，采用单一方法从多个物种中采集毒液可能更具经济性。我们希望本视频及随附的书面文章能够帮助研究人员从猎蝽及其他异翅亚目昆虫中采集毒液，这是了解其成分、生物活性及进化过程的前提条件。

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Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

从刺客臭虫和其他 Heteropteran 昆虫身上采集毒液毒素

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从猎蝽及其他异翅亚目昆虫中采集毒液毒素

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