Name: 全基因组对真核生物转录误差的监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解全基因组监测真核生物转录误差的方法，通过RNA环化和滚环反转录技术精确测量内源性转录错误。该方法结合生物信息学分析，为研究转录保真度和转录诱变机制提供可靠工具。

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本出版物的完成得益于以下资助：C. Fritsch 获得的 T32ES019851 项目资助、R01AG054641 项目资助，以及 M. Vermulst 获得的 AFAR 青年研究者资助。

<ol><li>Kireeva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reversal+of+RNA+polymerase+II+active+site+closing+controls+fidelity+of+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation.</a> Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).</li>
<li>Walmacq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rpb9+subunit+controls+transcription+fidelity+by+delaying+NTP+sequestration+in+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).</li>
<li>Strathern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fidelity+of+transcription%3A+RPB1+%28RPO21%29+mutations+that+increase+transcriptional+slippage+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).</li>
<li>Irvin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+assay+for+transcription+errors+reveals+multilayer+control+of+RNA+polymerase+II+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity.</a> PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).</li>
<li>Gout, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+transcription+errors+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The landscape of transcription errors in eukaryotic cells.</a> Science Advances. 3, e1701484(2017).</li>
<li>Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+detection+of+in+vivo+transcription+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Large-scale detection of in vivo transcription errors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).</li>
<li>Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+change+caused+by+transcriptional+bypass+of+uracil+in+nondividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells.</a> Science. 284, 159-162 (1999).</li>
<li>Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+induced+by+uracil+and+8-oxoguanine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli.</a> Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+encounters+with+DNA+damage%3A+transcription-coupled+repair+or+transcriptional+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis.</a> Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).</li>
<li>Vermulst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+errors+induce+proteotoxic+stress+and+shorten+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan.</a> Nature Communications. 6, 8065(2015).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RNA%3A+a+first+example+of+molecular+misreading+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease.</a> Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutants+of+beta+amyloid+precursor+protein+and+ubiquitin-B+in+Alzheimer%27s+and+Down+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients.</a> Science. 279, 242-247 (1998).</li>
<li>Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li>
<li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+transcription+fidelity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of transcription fidelity mutants.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).</li>
<li>Acevedo, A., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+for+highly+accurate+population+sequencing+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses.</a> Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).</li>
<li>Traverse, C. C., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Spectra+of+Transcription+Insertions+and+Deletions+Reveal+That+Slippage+Depends+on+RNA%3ADNA+Hybrid+Complementarity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity.</a> mBio. 8, (2017).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAT--the+BLAST-like+alignment+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">BLAT--the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12, 656-664 (2002).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14, R36(2013).</li>
<li>Zhou, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li>
<li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种优化的C-seq文库制备方案，用于检测酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中的转录错误。该方案相较于现有方法及其他替代技术具有多项优势。
在过去的15年中，已开发出多种依赖荧光素酶7,8或Cre-Lox重组3,4,15,21来检测转录错误的报告系统。这些报告系统对研究人员理解转录保真度具有重要价值，因为它们使得能够鉴定出直接调控转录保真性的基因、等位基因和分子机制。然而，这些系统仅能报告人工损伤模板或特...

基因组提供了生命精确的生物学蓝图。为了正确实施这一蓝图，基因组的转录必须具有高度精确性。然而，转录过程不太可能完全无误。例如，RNA聚合酶长期以来已知具有较高的错误倾向。 体外1,2，最近有研究表明它们会产生错误 体内 以及3,5,6，尤其是在面临DNA损伤时7,8,9,10综上所述，这些观察结果表明，转录错误在所有活细胞中持续发生，提示它们可能是突变蛋白的一个重要来源。
这一过程被称为转录突变，与经典突变在两个方面有所不同。首先，与基因突变不同，转录错误会影响有丝分裂细胞和终末分化后的细胞，因为其发生不依赖于DNA复制。因此，研究影响转录保真度的机制将有助于深入理解有丝分裂细胞和终末分化后细胞的突变负荷。有趣的是，最近研究表明转录错误可能促进蛋白质聚集11,12,13，并被假定在致癌过程10以及细菌对抗生素耐药性的产生中发挥一定作用14。
其次，与基因突变不同，转录错误在本质上是短暂的。这种短暂性带来了特别的挑战，因为它使得转录错误极难被检测。例如，尽管已有多个实验室开发出有价值的报告基因检测方法用于研究转录诱变，但这些检测方法仅能在有限的背景和模式生物中测量转录错误4,15。为了克服这些局限，许多研究人员转向了RNA测序技术（RNA-seq），该技术理论上能够记录任何物种转录组中全部的转录错误。然而，这些研究极易受到文库构建过程中产生的人为假象的干扰，例如逆转录错误、PCR扩增错误以及测序过程本身固有的错误倾向。例如，逆转录酶大约每 ~20,000 个碱基引入一个错误，而RNA聚合酶（RNAPs）预计每 300,000 个碱基才发生一个错误5,6。由于仅逆转录步骤的错误率就远高于细胞内RNA聚合酶的错误率，因此在传统的RNA-Seq数据中几乎无法区分真实的转录错误与文库制备过程中产生的人为假象（图1a）。
为了解决这一问题，我们开发了一种优化版本的环形测序（Circle-Sequencing，简称 Cirseq 或 C-seq）检测方法5,16。该检测方法可使研究人员在整个转录组范围内检测RNA中的转录错误及其他稀有变异5。该方法被称为环形测序，是因为其中关键一步涉及RNA的环化。一旦RNA靶标完成环化，便会以滚环方式逆转录，生成包含同一RNA模板多个拷贝的线性cDNA分子。如果某一模板中存在错误，则该错误将出现在cDNA分子内每一个重复序列中。相比之下，逆转录、PCR扩增或测序过程中引入的错误通常是随机发生的，因此仅会出现在一至两个重复序列中。因此，通过对每个cDNA分子生成一致性序列，并区分出现在所有重复序列中的错误与随机错误，即可有效将文库构建过程中的技术假象与真实的转录错误区分开来（图1b）。
如果正确使用，C-seq 检测可用于准确检测任何物种转录组中 RNA 的碱基替换、插入和缺失的发生率（例如，参见 Traverse 和 Ochman17）。例如，我们已利用 C-seq 检测在单碱基分辨率下对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的转录错误率进行了全基因组水平的测量5（未发表观察结果）。该 C-seq 检测的优化版本最初用于准确测序 RNA 病毒群体，现已经过改进，以尽量减少文库构建过程中可能导致人为假象的剧烈条件。此外，通过使用多种市售试剂盒，该检测的通量显著提高，操作便捷性也得到改善。若正确使用，该检测可在每次重复实验中准确检测出数千个转录错误，从而大大超越以往的研究6。总体而言，该方法为研究转录诱变提供了强有力的工具，将使研究者能够深入理解调控多种生物转录保真度的分子机制。

<table><tbody><tr><td>RiboPure RNA 纯化试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1926</td><td>总 RNA 纯化</td></tr><tr><td>Genelute mRNA 纯化试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MRN70-1KT</td><td>mRNA 纯化</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>洗脱和稀释</td></tr><tr><td>Ambion RNase III</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2290</td><td>RNA 片段化</td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶 1（ssRNA 连接酶）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td>RNA 环化</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td>RNase 抑制剂</td></tr><tr><td>SuperScript III 逆转录酶</td><td>ThermoFisher</td><td>18080044</td><td>滚环逆转录</td></tr><tr><td>10 mM dNTP 混合液</td><td>ThermoFisher</td><td>18427013</td><td>滚环逆转录</td></tr><tr><td>随机六聚体（50 ng/&amp;micro;L）</td><td>ThermoFisher</td><td>N8080127</td><td>滚环逆转录</td></tr><tr><td>NEB 第二链合成模块</td><td>New England Biolabs</td><td>E6111S</td><td>第二链合成</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA 文库制备试剂盒（适用于 Illumina）</td><td>New England Biolabs</td><td>E7370S</td><td>cDNA 文库构建</td></tr><tr><td>NEB Next index 引物</td><td>NEB</td><td>E7335S</td><td>多重 PCR 引物</td></tr><tr><td>Oligo Clean &amp; Concentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>RNA 和 DNA 样本纯化</td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>磁珠纯化</td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>磁珠纯化</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 微型离心机</td><td>FisherScientific</td><td>05-403-93</td><td>离心</td></tr><tr><td>INCU-Shaker 10 L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>T100 梯度 PCR 仪</td><td>BIO RAD</td><td>1861096</td><td>中高温循环条件</td></tr><tr><td>PTC-200 梯度 PCR 仪</td><td>GMI</td><td>8252-30-0001&amp;nbsp;</td><td>低温循环条件</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular Bioproducts</td><td>700S-11</td><td>消毒</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430290</td><td>无核酸酶</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>无核酸酶</td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>无核酸酶</td></tr><tr><td>4200 Tapestation 系统</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>用于 RNA 和单链 DNA 样本质量控制的核苷酸分析仪器</td></tr><tr><td>高灵敏度 RNA Screen Tape</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>RNA 和单链 DNA 样本的质量控制</td></tr><tr><td>RNA ScreenTape 样本缓冲液</td><td>Agilent</td><td>5067-5577</td><td>RNA 和单链 DNA 样本的质量控制</td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Ladder</td><td>Agilent</td><td>5067-5578</td><td>RNA 和单链 DNA 样本的质量控制</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer 仪器</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>双链 DNA 质量控制</td></tr><tr><td>高灵敏度 DNA 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>双链 cDNA 样本的质量控制</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR</td><td>462-0244</td><td>孵育</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C 分光光度计</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000C</td><td>RNA 浓度测定</td></tr></tbody></table>

真核生物中转录错误的全基因组监测

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

准确的转录对于遗传信息的忠实表达至关重要。然而令人惊讶的是，目前对控制转录保真度的机制仍知之甚少。为了填补这一科学空白，我们近期优化了环形测序（circle-sequencing）检测方法，以在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的转录组范围内检测转录错误。本实验方案将为研究人员提供一种强大的新工具，用于绘制真核细胞中转录错误的图谱，从而以前所未有的细节揭示调控转录保真度的分子机制。

与所有大规模并行测序方法一样，每次C-seq实验都会产生庞大且难以处理的数据集。对于初次使用者而言，处理这些数据集可能较为困难；因此，建议所有使用者在实验前联系有经验的生物信息学专家。通常情况下，在大多数大规模并行测序平台上，每次运行预计可产生约55–70千兆碱基（Gbases）的数据。在本方案中，通常每次运行会将12–30个样本进行多重测序，从而使每个样本获得约2–6 Gbases的数据量。在从该数据集中去除接头序列以及低质量碱基识别（&lt; 20）后，约保留初始数据量的70%。
随后进一步分析这些碱基，以通过测定生成的重复序列长度来评估RNA片段化和环化的效率。大多数重复序列的长度在45–80个碱基之间（图4A），约50%的测序碱基属于这些重复序列（图4B）。由于大多数碱基存在于包含3个或更多重复序列的读段中，因此测序获得的唯一...

本方案为研究人员提供了一种新工具，可用于监测多种模式生物中转录的保真度。

准确的转录对于遗传信息的忠实表达至关重要。然而令人惊讶的是，关于确保转录准确性的机制，目前所知甚少。

该方法有助于回答转录诱变领域中的关键问题，例如哪些RNA聚合酶亚基或生物学过程调控转录的保真度。该技术的主要优势在于能够测量真核生物转录组中的内源性转录错误。通常，初次接触该方案的研究人员会遇到困难，原因在于该实验流程较长且复杂，同时需要高级生物信息学分析来解读数据。开始实验方案时，将先前制备的样品20微升在65摄氏度下热变性1分钟，使RNA片段环化。1分钟后，立即将样品置于冰上孵育2分钟。随后，加入4微升10x T4 RNA连接酶缓冲液、4微升10毫摩尔ATP、1微升RNase抑制剂、1微升无核酸酶水以及8微升50%聚乙二醇（PEG）。然后通过涡旋充分混匀样品。接着加入2 µL浓度为10单位/µL的T4 RNA连接酶1。再次用移液器混匀样品，并在热循环仪中25 °C条件下孵育2小时，同时将热盖温度设为30 °C。孵育两小时后，向样品中加入10微升无核酸酶水，并使用寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒对样品进行纯化。用20微升无核酸酶水洗脱样品。为逆转录环状RNA分子，向9微升RNA中加入4微升10毫摩尔/升dNTPs、4微升50纳克/微升随机六聚体引物以及9微升无核酸酶水。用移液器充分混匀，并在65摄氏度下变性样品1分钟。变性后，将样品置于冰上2分钟。向样品中加入8 µL 5×第一链合成缓冲液、2 µL 0.1 mM DTT和4 µL 200单位/µL逆转录酶，用移液器混匀。将样品在25摄氏度下孵育10分钟，同时将盖子温度设定为比孵育温度高5摄氏度。随后将样品在42摄氏度下孵育20分钟，盖子温度设定为47摄氏度。使用纯化与浓缩试剂盒进行清洗后，用42 µL洗脱液洗脱样品。使用第二链合成试剂盒构建双链 cDNA 文库。将样品置于冰上，在 38 微升样品中加入 30 微升 NF 水。随后加入 8 微升 10× 第二链缓冲液和 4 微升第二链酶，用移液器轻轻吹打混匀，然后在 16°C 下孵育 2.5 小时。使用寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒对样品进行纯化，适用于100微升反应体系，并用38微升无核酸酶水洗脱样品。通过移液混匀末端修复反应体系，并在20摄氏度孵育30分钟。随后在65摄氏度继续孵育30分钟。首先，将用于下一代测序的接头用10毫摩尔/升Tris HCl稀释十倍，使其终浓度为1.5微摩尔/升。然后向每个样本中加入2.5微升稀释后的接头和1微升连接增强剂，并通过涡旋振荡混匀。接着，加入15微升平末端TA连接酶主混合液。用移液器上下吹打样品以混匀，并在20摄氏度下孵育15分钟。然后加入3 µL尿嘧啶特异性切除试剂酶，在37摄氏度下孵育样品15分钟。连接反应完成后，向样品中加入13.5 µL无核酸酶水，使总体积达到100 µL，随后进行片段大小选择。将磁珠平衡至室温。向每个样品中加入30 µL已平衡并重悬的磁珠，用移液器混匀。将样品转移至1.5 mL离心管中，在室温下孵育5分钟。将样品置于磁力架上静置五分钟，使磁珠与上清液分离。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并弃去磁珠。向每个样品中加入15 µL新鲜的磁珠等分试样。用移液器充分混匀，在室温下孵育5分钟。将样品置于磁力架上，在室温下孵育5分钟。然后小心移除并弃去上清液，注意不要扰动磁珠。向每个样本中加入 200 微升新鲜配制的 80% 乙醇，注意不要扰动已沉淀的磁珠，孵育 30 秒。然后彻底去除样本中的乙醇残留，并将磁珠在空气中干燥五分钟，但注意切勿过度干燥。为从磁珠上洗脱样本，需将离心管从磁力架上取下。加入19微升10毫摩尔的Tris HCl。用移液器反复吹打混合液多次，以重悬磁珠，并在室温下孵育样品5分钟。将样品重新置于磁力架上，再孵育5分钟，使磁珠与上清液分离。小心地从管中移除含有纯化后且经片段大小筛选的cDNA文库的15微升上清液，并转移至新的1.5毫升离心管中。向每个纯化的cDNA文库中加入5微升通用引物和5微升独特的index引物，通过移液充分混匀。仔细检查聚合酶预混液中是否存在晶体或其他沉淀物，并用手温热预混液直至沉淀物完全溶解。向样品中加入25 µL聚合酶预混液。通过移液混匀样品，并按照随附文本方案中列出的循环条件进行PCR扩增。通过向PCR反应中直接加入45 µL重悬的磁珠来纯化最终文库。用移液器吹打混匀，并在室温下孵育五分钟。将样品转移至1.5毫升离心管中，放入磁力架上静置五分钟。孵育结束后，弃去上清液，用新配制的80%乙醇洗涤两次，每次30秒。第二次洗涤后，彻底去除样品中的乙醇，并将磁珠沉淀在空气中干燥五分钟。然后用35微升0.1x TE缓冲液洗脱。通过移液重悬磁珠，并在室温下孵育五分钟。将离心管置于磁力架上五分钟后，将30微升上清液转移至新的1.5毫升离心管中。将文库保存在负80摄氏度。RNA提取后，电泳图上可见两个明显的rRNA峰。RNA片段化将产生50至70个碱基对的RNA片段。采用滚环反转录方法生成由至少三个串联重复的环状RNA模板组成的cDNA分子。利用磁珠进行大小筛选，可纯化出适当大小的文库。单个C-seq文库的测序结果显示，大多数重复序列的长度在45至80个碱基之间。测序的碱基中约有 50% 属于这些重复序列。由于大多数这些碱基存在于包含三个或更多重复单位的序列中，因此测序得到的唯一性碱基数量约为总测序碱基数的三分之一。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两到三天内完成。在进行该实验操作时，必须始终保持无菌的工作环境，避免RNase污染而干扰实验结果。同时，应严格遵循每一步操作，确保实验过程中不出现任何差错。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用C-seq检测法在真核生物中测定转录错误。

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Research

科研

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Genetics

遗传学

全基因组对真核生物转录误差的监测

我们提出了一种用于识别影响转录因子（TF）DNA结合的非编码遗传变异的策略性方案和实验流程。本文提供了针对基因型依赖性转录因子DNA结合的电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）的详细实验方案。...

利用电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）筛选功能性非编码遗传变异

本文介绍了一种实现接近碱基对分辨率的蛋白质-DNA 相互作用研究的实验方案。该方法通过染色质免疫沉淀（ChIP-exo）选择性富集 DNA...

ChIP-exo 方法：以接近碱基对精度鉴定蛋白质-DNA 相互作用

我们描述了一种用于分析RNA聚合酶II转录终止的基本实验方法 体内 利用BrUTP通过芽殖酵母的链特异性转录延伸（TRO）方法。该方案可拓展用于研究酵母及其他真核生物中其他RNA聚合酶的转录终止过程。...

利用溴尿苷三磷酸链特异性转录延伸（TRO）方法分析转录终止

我们描述了染色质内源性切割联合高通量测序技术（ChEC-seq），这是一种与染色质免疫沉淀（ChIP）正交的方法，利用微球菌核酸酶（MNase）融合蛋白在全基因组范围内定位蛋白质结合位点。...

全基因组范围内利用 ChEC-seq 技术在 Saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total...

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

下一代测序（NGS）是一种强大的基因组表征工具，但其应用受到该平台较高错误率（约0.5–2.0%）的限制。我们介绍了错误校正测序的方法，可消除NGS的错误率影响，检测到低至0.0001变异等位基因分数的突变。...

利用纠错型DNA和RNA测序进行稀有事件检测

我们提出了一种通过天然γH2A.X染色质免疫沉淀（ChIP）快速高效检测常见脆性位点断裂的方法。该方法显著缩短了传统γH2A.X...

通过原生 &#947;H2A.X ChIP 捕获常见脆性位点断裂

插入突变是正向遗传学中用于鉴定功能性基因组元件的重要工具。本文中，我们描述了一种基于插入的功能元件与转录本筛选方法（InSET），该方法可用于检测基于慢病毒的插入突变细胞文库中的慢病毒整合位点。...

插入突变细胞文库中功能相关慢病毒整合位点的鉴定

在本文中，我们描述了一种用于功能性检测转录过程以及针对细菌转录的抗菌剂抑制活性的实验方案。...

体外 转录实验及其在药物发现中的应用

了解全基因组监测真核生物转录误差的方法，通过RNA环化和滚环反转录技术精确测量内源性转录错误。该方法结合生物信息学分析，为研究转录保真度和转录诱变机制提供可靠工具。

真核生物中转录错误的全基因组监测

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