全基因组对真核生物转录误差的监测

这种方法可以帮助回答转录诱变领域的关键问题，例如哪些 RNA 聚合酶亚基或生物过程控制转录的保真度。该技术的主要优点是它允许测量真核生物转录组中的内源性转录错误。通常，刚接触该方案的人会很挣扎，因为检测的长度和复杂性以及需要先进的生物信息学来解释数据。

首先，将 20 微升先前制备的样品在 65 摄氏度下加热变性 1 分钟，使 RNA 片段圆化。1 分钟后，立即将样品置于冰上 2 分钟。接下来，加入 4 微升 10x T4 RNA 连接酶缓冲液、4 微升 10 毫摩尔 ATP、1 微升 RNase 抑制剂、1 微升无核酸酶水和 8 微升 50% 聚乙二醇或 PEG。

然后通过涡旋充分混合样品。然后加入 2 微升，每微升 10 单位的 T4 RNA 连接酶 1。通过移液再次混合样品，并在 25 摄氏度下在热循环仪中孵育 2 小时，盖子温度设置为 30 摄氏度。

孵育 2 小时后，向样品中加入 10 μL 不含核酸酶的水，并使用寡核苷酸纯化和浓缩试剂盒清洁样品。用 20 μL 不含核酸酶的水洗脱样品。为了逆转录环状 RNA 分子，向 9 微升 RNA 中加入 4 微升 10 毫摩尔 dNTP、4 微升 50 纳克/微升随机六聚体和 9 微升无核酸酶水。

通过移液充分混合，并在 65 摄氏度下使样品变性 1 分钟。使样品变性后，将其置于冰上 2 分钟。向样品中加入 8 微升 5x 第一链合成缓冲液、2 微升 0.1 毫摩尔 DTT 和 4 微升每微升 200 单位的逆转录酶，并通过移液混合。

将样品在 25 摄氏度下孵育 10 分钟，并将盖子设置为比孵育温度高 5 摄氏度。然后将样品在 42 摄氏度下孵育 20 分钟，并将盖子设置为 47 摄氏度。使用净化浓缩液试剂盒进行净化后，在 42 μL 洗脱液中洗脱样品。

使用第二链合成试剂盒生成双链 cDNA 文库。将样品放在冰上，向 38 微升样品中加入 30 微升 NF 水。接下来，加入 8 微升 10x 第二链缓冲液和 4 微升第二链酶，轻轻移液混合样品，然后在 16 摄氏度下孵育两个半小时。

使用寡核苷酸纯化和浓缩试剂盒净化样品以进行 100 μL 反应，并在 38 μL 无核酸酶水中洗脱样品。通过移液混合末端修复反应物，并在 20 摄氏度下孵育 30 分钟。在 20 摄氏度孵育后，在 65 摄氏度下孵育 30 分钟。

首先，在 10 毫摩尔 tris HCl 中将用于下一代测序的接头稀释 10 倍，至最终浓度为 1.5 微摩尔。然后向每个样品中加入 2.5 μL 稀释的接头和 1 μL 的连接增强剂，并通过涡旋混合。接下来，加入 15 μL 平头 TA 连接酶预混液。

上下移液将样品混合，并在 20 摄氏度下孵育 15 分钟。然后，加入 3 μL 尿嘧啶特异性切除试剂酶，并将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。连接完成后，向样品中加入 13.5 μL 无核酸酶水，总体积为 100 μL，然后进行大小选择。

使磁珠适应室温。向每个样品中加入 30 μL 驯化、重悬的磁珠，并通过移液混合。将样品转移至 1.5 mL 试管中，并在室温下孵育 5 分钟。

将样品放在磁力架上 5 分钟，以将磁珠与上清液分离。将上清液转移到新的 1.5 mL 试管中，并处理掉磁珠。向每个样品中加入 15 μL 的新鲜等分试样的磁珠。

通过移液充分混匀，并在室温下孵育 5 分钟。将样品放在磁力架上，在室温下孵育 5 分钟。然后小心地取出并处理上清液，确保不要干扰珠子。

向每个样品中加入 200 微升 80% 新鲜制备的乙醇，不要干扰沉淀的磁珠，并孵育 30 秒。然后，从样品中完全去除任何痕量乙醇，并将磁珠风干 5 分钟，但注意不要过度干燥磁珠。要从磁珠中洗脱样品，请从磁力架上取下试管。

加入 19 微升 10 毫摩尔 tris HCl。上下移液多次，以重悬微珠，并在室温下孵育样品 5 分钟。将样品放回磁力架上，孵育 5 分钟，以将磁珠与上清液分离。

小心地从试管中取出 15 μL 含有纯化的、大小选择的 cDNA 文库的上清液，并将其转移到新的 1.5 mL 试管中。向每个纯化的 cDNA 文库中加入 5 微升通用引物和 5 微升独特索引引物，并通过移液充分混合。仔细检查聚合酶预混液中是否有晶体和其他沉淀物，然后用手加热预混液，直到沉淀物溶解。

向样品中加入 25 μL 聚合酶预混液。通过移液混合样品，并按照随附文本方案中列出的循环条件进行 PCR 扩增。通过将 45 μL 重悬的磁珠直接添加到 PCR 反应中来清理最终文库。

通过移液混合它们，并在室温下孵育 5 分钟。将样品转移至 1.5 mL 试管中，置于磁力架中 5 分钟。孵育后，弃去上清液，用新鲜制备的 80% 乙醇洗涤两次，每次 30 秒。

第二次洗涤后，从样品中完全去除乙醇，并将微珠沉淀风干 5 分钟。然后在 35 微升 0.1x TE 中洗脱。通过移液重新悬浮磁珠，并在室温下孵育 5 分钟。试管在磁力架上放置 5 分钟后，将 30 μL 上清液转移到新的 1.5 mL 试管中。

将库存储在零下 80 摄氏度。分离 RNA 后，在电泳图上可以看到两个不同的 rRNA 峰。RNA 片段化将产生 50 至 70 个碱基对 RNA 片段。

使用滚环逆转录生成 cDNA 分子，这些分子由环状 RNA 模板的至少三个串联重复序列组成。使用磁珠进行大小选择可纯化适当大小的文库。单个 C-seq 文库的测序信息显示，大多数重复序列的长度往往为 45 至 80 个碱基。

大约 50% 的测序碱基是这些重复序列的一部分。由于这些碱基中的大多数都存在于包含 3 次或更多重复的速率中，因此测序的唯一碱基数约为测序碱基总数的三分之一。一旦掌握了，如果执行得当，这项技术可以在两到三天内完成。

在尝试此程序时，请务必始终保持无菌的工作环境，没有可能干扰您工作的 RNA。仔细遵循每个步骤以确保在过程中不犯错误也很重要。观看此视频后，您应该对如何使用 C-seq 检测法测量真核生物中的转录错误有很好的了解。