真核生物中转录错误的全基因组监测

该方法有助于回答转录诱变领域中的关键问题，例如哪些RNA聚合酶亚基或生物学过程调控转录的保真度。该技术的主要优势在于能够测量真核生物转录组中的内源性转录错误。通常，初次接触该方案的研究人员会遇到困难，原因在于该实验流程较长且复杂，同时需要高级生物信息学分析来解读数据。

开始实验方案时，将先前制备的样品20微升在65摄氏度下热变性1分钟，使RNA片段环化。1分钟后，立即将样品置于冰上孵育2分钟。随后，加入4微升10x T4 RNA连接酶缓冲液、4微升10毫摩尔ATP、1微升RNase抑制剂、1微升无核酸酶水以及8微升50%聚乙二醇（PEG）。

然后通过涡旋充分混匀样品。接着加入2 µL浓度为10单位/µL的T4 RNA连接酶1。再次用移液器混匀样品，并在热循环仪中25 °C条件下孵育2小时，同时将热盖温度设为30 °C。

孵育两小时后，向样品中加入10微升无核酸酶水，并使用寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒对样品进行纯化。用20微升无核酸酶水洗脱样品。为逆转录环状RNA分子，向9微升RNA中加入4微升10毫摩尔/升dNTPs、4微升50纳克/微升随机六聚体引物以及9微升无核酸酶水。

用移液器充分混匀，并在65摄氏度下变性样品1分钟。变性后，将样品置于冰上2分钟。向样品中加入8 µL 5×第一链合成缓冲液、2 µL 0.1 mM DTT和4 µL 200单位/µL逆转录酶，用移液器混匀。

将样品在25摄氏度下孵育10分钟，同时将盖子温度设定为比孵育温度高5摄氏度。随后将样品在42摄氏度下孵育20分钟，盖子温度设定为47摄氏度。使用纯化与浓缩试剂盒进行清洗后，用42 µL洗脱液洗脱样品。

使用第二链合成试剂盒构建双链 cDNA 文库。将样品置于冰上，在 38 微升样品中加入 30 微升 NF 水。随后加入 8 微升 10× 第二链缓冲液和 4 微升第二链酶，用移液器轻轻吹打混匀，然后在 16°C 下孵育 2.5 小时。

使用寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒对样品进行纯化，适用于100微升反应体系，并用38微升无核酸酶水洗脱样品。通过移液混匀末端修复反应体系，并在20摄氏度孵育30分钟。随后在65摄氏度继续孵育30分钟。

首先，将用于下一代测序的接头用10毫摩尔/升Tris HCl稀释十倍，使其终浓度为1.5微摩尔/升。然后向每个样本中加入2.5微升稀释后的接头和1微升连接增强剂，并通过涡旋振荡混匀。接着，加入15微升平末端TA连接酶主混合液。

用移液器上下吹打样品以混匀，并在20摄氏度下孵育15分钟。然后加入3 µL尿嘧啶特异性切除试剂酶，在37摄氏度下孵育样品15分钟。连接反应完成后，向样品中加入13.5 µL无核酸酶水，使总体积达到100 µL，随后进行片段大小选择。

将磁珠平衡至室温。向每个样品中加入30 µL已平衡并重悬的磁珠，用移液器混匀。将样品转移至1.5 mL离心管中，在室温下孵育5分钟。

将样品置于磁力架上静置五分钟，使磁珠与上清液分离。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并弃去磁珠。向每个样品中加入15 µL新鲜的磁珠等分试样。

用移液器充分混匀，在室温下孵育5分钟。将样品置于磁力架上，在室温下孵育5分钟。然后小心移除并弃去上清液，注意不要扰动磁珠。

向每个样本中加入 200 微升新鲜配制的 80% 乙醇，注意不要扰动已沉淀的磁珠，孵育 30 秒。然后彻底去除样本中的乙醇残留，并将磁珠在空气中干燥五分钟，但注意切勿过度干燥。为从磁珠上洗脱样本，需将离心管从磁力架上取下。

加入19微升10毫摩尔的Tris HCl。用移液器反复吹打混合液多次，以重悬磁珠，并在室温下孵育样品5分钟。将样品重新置于磁力架上，再孵育5分钟，使磁珠与上清液分离。

小心地从管中移除含有纯化后且经片段大小筛选的cDNA文库的15微升上清液，并转移至新的1.5毫升离心管中。向每个纯化的cDNA文库中加入5微升通用引物和5微升独特的index引物，通过移液充分混匀。仔细检查聚合酶预混液中是否存在晶体或其他沉淀物，并用手温热预混液直至沉淀物完全溶解。

向样品中加入25 µL聚合酶预混液。通过移液混匀样品，并按照随附文本方案中列出的循环条件进行PCR扩增。通过向PCR反应中直接加入45 µL重悬的磁珠来纯化最终文库。

用移液器吹打混匀，并在室温下孵育五分钟。将样品转移至1.5毫升离心管中，放入磁力架上静置五分钟。孵育结束后，弃去上清液，用新配制的80%乙醇洗涤两次，每次30秒。

第二次洗涤后，彻底去除样品中的乙醇，并将磁珠沉淀在空气中干燥五分钟。然后用35微升0.1x TE缓冲液洗脱。通过移液重悬磁珠，并在室温下孵育五分钟。将离心管置于磁力架上五分钟后，将30微升上清液转移至新的1.5毫升离心管中。

将文库保存在负80摄氏度。RNA提取后，电泳图上可见两个明显的rRNA峰。RNA片段化将产生50至70个碱基对的RNA片段。

采用滚环反转录方法生成由至少三个串联重复的环状RNA模板组成的cDNA分子。利用磁珠进行大小筛选，可纯化出适当大小的文库。单个C-seq文库的测序结果显示，大多数重复序列的长度在45至80个碱基之间。

测序的碱基中约有 50% 属于这些重复序列。由于大多数这些碱基存在于包含三个或更多重复单位的序列中，因此测序得到的唯一性碱基数量约为总测序碱基数的三分之一。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两到三天内完成。

在进行该实验操作时，必须始终保持无菌的工作环境，避免RNase污染而干扰实验结果。同时，应严格遵循每一步操作，确保实验过程中不出现任何差错。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用C-seq检测法在真核生物中测定转录错误。