视网膜冷冻切片、全层铺片及低渗分离血管制备用于微血管周细胞的免疫组织化学可视化

这些方法有助于回答眼科领域的一些关键问题，例如周细胞的增殖或迁移。该实验流程的主要优势在于提供了多种可视化选择。本次实验操作将由本实验室的两位博士后 Karin Dreisig 和 Frank W. Blixt 进行示范。

摘除眼球时，首先使用手术刀在大鼠眼睑上做约0.5厘米的后部和前部切口。用镊子夹住眼球，小心地向一侧倾斜以暴露周围组织。用解剖剪剪断结缔组织和肌肉组织，从而摘除眼球。

将眼球短暂置于4%甲醛和磷酸盐缓冲液中固定1至2分钟。用生理缓冲液短暂冲洗后，用手术刀尖在角膜缘处轻轻施压，制造一个小孔。随后用解剖剪沿角膜缘剪开，用镊子取下角膜和晶状体。

将剩余的带有视网膜的组织浸入含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定2至4小时。将组织依次浸入含10%蔗糖和25%蔗糖的索伦森磷酸盐缓冲液中进行冷冻保护。待组织沉入容器底部后，转移组织。

将样品包埋于含3%猪皮明胶和30%鸡卵清蛋白的Yazulla培养基中。随后，将明胶包埋的视网膜组织沿视神经方向切成10微米厚的垂直冷冻切片。将冷冻切片置于玻片上，室温下干燥至少一小时。

干燥后，将切片浸入含0.25%Triton-X 100的PBS中，孵育15分钟。随后，在冷冻切片上滴加按1:100稀释的PDGF受体β抗体和按1:500稀释的NG2一抗混合液（溶于PBST和1%BSA中），置于4摄氏度湿盒中过夜。次日，将切片在PBST中浸洗两次，每次15分钟。

然后将用含3% BSA的PBST稀释的1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594标记二抗和1:100 Anti-Rabbit FITC标记二抗的混合液滴加到冷冻切片上，避光孵育一小时。孵育结束后，用PBST将玻片漂洗两次，每次15分钟。最后用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂和盖玻片封片。

第二种视网膜组织制备技术为整体封片法。在去除角膜后，使用镊子进行小幅度开合动作，从视网膜色素上皮层开始向视神经方向分离视网膜。用解剖剪在视神经处将视网膜完全游离，并从视网膜周边向视盘方向做3至4个长度为几毫米的切口。

将视网膜铺展在玻璃载片上，室温干燥5至10分钟。滴加4%甲醛溶液于视网膜上，固定20至30分钟。固定后，用PBS缓冲液冲洗。

为获得最佳结果，清洗后应立即进行免疫染色。首先，将 PBST 滴加到整体样本上，在室温下孵育 15 分钟。倒掉 PBST，然后加入一抗溶液，在潮湿环境中 4°C 下孵育过夜。

第二天，倒掉一抗溶液，滴加PBST冲洗视网膜，每次15分钟，共冲洗两次。第二次冲洗结束后，倒掉PBST，滴加二抗溶液至视网膜上，于湿盒中室温避光孵育1小时。二抗孵育完成后，按前述方法用PBST再次洗涤两次。

使用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂和盖玻片对染色后的整体样本进行封片。作为整体封片视网膜的替代方法，可通过低渗法分离视网膜血管系统。首先，将视网膜置于24孔板中1毫升去离子水中，在室温下以每分钟200转、1.5毫米振动直径的振荡条件下孵育1小时；随后加入200单位的DNase 1，以解离视网膜血管系统上的细胞碎片，并在室温下继续振荡30分钟。

用去离子水冲洗视网膜，每次5分钟，共冲洗三次，同时以150至300 rpm振荡，以去除神经元细胞碎片。每次冲洗后视网膜应逐渐变得透明，表明神经元细胞碎片已被清除。冲洗后，将视网膜置于1 mL 4%多聚甲醛和PBS中，室温固定10分钟。

用 PBS 冲洗三次。若进行免疫染色，加入 500 微升含 10% 驴血清的 PBS 溶液，以 100 rpm 振荡封闭低渗处理后分离的脉络膜血管，持续 1 小时。封闭后，在 600 微升一抗溶液中于 4°C 过夜孵育视网膜，一抗溶液包含 1:100 稀释的 PDGF-receptor beta 和 1:500 稀释的 NG2 一抗，溶于含 10% 驴血清的 PBS 中。

第二天，用 PBS 将视网膜网络冲洗三次，每次五分钟。随后在含有 10% 驴血清的 PBS 中加入 1:100 稀释的 Anti-Mouse Alexa Fluor 594 标记二抗和 1:100 稀释的 Anti-Rabbit FITC 标记二抗，在室温下避光振荡孵育一小时（振荡速度为 100 rpm）。用 PBST 洗涤五分钟之后，再在含 0.2 纳克/毫升 DAPI 的 PBST 中孵育 15 分钟。最后在避光条件下用 PBST 洗涤三次，每次五分钟。

接下来，剪去塑料巴斯德吸管的尖端。使用吸头去除其锋利边缘，并用PBST润湿巴斯德吸管，然后将视网膜血管系统吸入吸管中，并转移至四孔玻璃培养皿载玻片中。润湿步骤至关重要，可防止视网膜血管系统黏附在巴斯德吸管内壁。

通过前后倾斜腔室载玻片来调整视网膜血管的位置。移除腔室载玻片各孔中的培养基。液体的表面张力将使血管结构贴附并展平于载玻片底部。

如有需要，可将液滴滴加至视网膜血管上以助其展开。在将塑料小室从腔室载玻片上移除前，需在显微镜下确认血管已正确展开。使用抗荧光淬灭封片剂和盖玻片对染色后的血管进行封片。

NG2免疫组织化学显示视网膜内层存在阳性血管。箭头指示血管中呈圆形和马蹄形的免疫反应性结构。箭头尖端指出一个纵切面的血管。

PDGF受体β免疫组织化学显示与NG2相似的免疫反应性。同样，箭头和箭头指示血管中的免疫反应性。该图像显示了NG2（绿色）、PDGF受体β（红色）和DAPI（蓝色）的叠加结果。

通过叠加三种不同的滤光片，可以发现NG2与PDGF受体β存在共定位。该图像显示的是NG2染色呈红色的免疫染色整体封片样本。免疫反应性可见于浅层血管网络，其中管腔外周细胞染色强烈。

神经元细胞表现为位于NG2染色的微血管之间的DAPI蓝色细胞核。该图像显示了低渗法分离的大鼠视网膜血管网络，其中NG2呈绿色染色，血小板源性生长因子受体β（PDGF-receptor beta）呈红色染色。整个血管网络均显示NG2免疫反应阳性。

在细胞胞体中检测到PDGF受体β的免疫反应性。在高倍镜下，PDGF受体β的染色仅出现在血管网络中细胞胞体，表明周细胞具有免疫反应性。结合DAPI染色与NG2及PDGF受体β染色，该高倍镜图像显示了三个周细胞以及两个未明确的血管壁细胞。

通过上述步骤，可采用其他免疫染色方法（如平滑肌细胞或内皮细胞染色）来回答更多科学问题。例如，视网膜血管中的细胞在缺血后呈现何种形态？