October 7th, 2018
我们展示了三种不同的组织制备技术的免疫组化显示大鼠视网膜微血管毛细血管,即低温切片, 全支架, 和低渗的隔离血管网络。
这些方法可以帮助回答眼科领域的关键问题,如环小体增殖或迁移。这些过程的主要优点是它们提供了各种可视化选项。演示程序的将是卡琳·德雷西格和弗兰克·布利克斯特,两个博士后在我们的实验室。
为了使眼睛保持光亮,首先使用手术刀在大鼠眼睑中使后侧和前部的缝隙保持约 0.5 厘米。用钳子抓住眼睛,小心地向侧面倾斜,露出周围的组织。在结缔组织和肌肉组织中用解剖剪刀进行切口,使眼睛得到锻炼。
将眼睛短暂地放在4%甲醛和磷酸盐缓冲盐水中一至两分钟。在用手术刀尖施加轻压之前,先在角膜肢上打孔,然后用钠缓冲液短暂冲洗。用解剖剪刀切割角膜肢体,用钳子切除角膜和透镜。
将剩余的组织与视网膜一起吸收到PBS中4%甲醛中,两到四个小时。通过浸入索伦森含有10%蔗糖的磷酸盐缓冲液,然后吸收25%蔗糖,冷冻保护组织。一旦组织沉入容器底部,就将其转移。
嵌入雅祖拉介质中,用3%的明胶从猪皮和30%白素从蛋清准备。接下来,将明胶嵌入视网膜的10微米垂直冷冻切入视神经。将冷冻片放在玻璃滑梯上,至少干燥一小时。
干燥后,用 0.25%Triton-X 100 将幻灯片淹没在 PBS 中 15 分钟。然后,将PBST和1%BSA中1:100 PDGF受体β和1:500NG2原抗体的混合物滴到低温上,在4摄氏度的湿润室中过夜。第二天,将幻灯片浸入 PBST 中两次,每次 15 分钟,以清洗部分。
然后滴1:100抗小鼠Alexa Fluor 594链接和1:100抗兔 FITC链接的二次抗体的混合物,用3%BSA稀释在BST中,并在黑暗中孵育一小时。孵育后,每次在PBST中冲洗玻璃滑梯15分钟。使用含有 DAPI 和盖玻片的防褪色安装介质安装染色的低温。
第二种视网膜组织制备技术是全安装。切除角膜后,使用钳子的小开口运动将视网膜从视网膜色素上皮分离到视神经。用解剖剪刀释放视神经的视网膜,从视网膜外围向视神经头部开三到四条几毫米长的缝隙。
将视网膜铺在玻璃滑梯上,晾干5至10分钟。将4%甲醛滴到视网膜上,固定20至30分钟。固定后,使用 PBS 冲洗。
为了获得最佳效果,冲洗后直接进行免疫。首先,将PBST滴入整座,在室温下孵育15分钟。从PBST中倒出,然后加入原抗体溶液,在4摄氏度的湿润室中孵育。
第二天,倒掉原抗体,滴在PBST上,每次冲洗视网膜两次,每次15分钟。浇注第二次洗涤后,将二次抗体溶液滴到视网膜上,在黑暗中室温下在湿润室中孵育一小时。在二次抗体孵育后,与以前一样用PBST洗涤两次。
使用包含 DAPI 和盖滑的防褪色安装介质安装染色的整个安装。除了完全安装视网膜,视网膜血管可以通过低分位隔离来隔离。首先,将视网膜放在24井板中的一毫升去电化水中,在室温下以1.5毫米振动轨道以200 rpm转速摇动,持续一小时,然后加入200单位的DNAse 1,将视网膜血管中的落酸细胞碎片分离,在室温下再摇晃30分钟。
在去层水中冲洗视网膜三次,每次五分钟,以 150 至 300 rpm 的转速摇动,以清除神经元细胞碎片。每次冲洗时,视网膜应变得更透明,表示可去除神经元细胞碎片。冲洗后,在室温下将视网膜固定为4%甲醛和PBS的1毫升10分钟。
用 PBS 冲洗三次。如果继续免疫,用500微升10%驴血清在PBS中稀释1小时,在100转/小时时摇晃,阻断低分分离血管。阻断后,在600微升原抗体溶液中孵育视网膜,包括1:100PDGF受体β和1:500NG2原抗体,在10%驴血清和PBS中稀释。
第二天,在PBS中冲洗视网膜网络三次,每次五分钟,然后在1:100抗小鼠Alexa Fluor 594和1:100抗兔 FITC 相关二次抗体中孵育,在 10% 驴血清和 PBS 中稀释,在室温下以 100 rpm 摇动,在黑暗中摇动一小时。在 PBST 中洗涤 5 分钟后,每毫升 DAPI 和 PBST 孵育 0.2 毫微克 15 分钟。使用 PBST 清洗三次,五分钟,同时防止光线。
接下来,切割塑料巴斯德移液器的尖端。使用移液器尖端去除锋利的边缘,用 PBST 滋润巴斯德移液器,然后将视网膜血管吸入移液器并放入四孔玻璃室滑梯中。保湿步骤是重要的,以避免视网膜血管粘在巴斯德移液器内部。
通过来回倾斜腔室滑动来定位视网膜血管。从腔室滑轨的井中拆下介质。液体的表面张力会将血管压平到滑轨底部。
如果需要,将液体滴到视网膜血管上展开。在从室滑轨上取下塑料孔之前,确保在显微镜下正确展开。使用防褪色安装介质和盖滑来安装染色的血管。
NG2免疫组织化学揭示了视网膜内侧阳性的血管。箭头表示容器中的圆形和马蹄形免疫反应。箭头指出了一个纵向切割的容器。
PDGF受体β免疫组织化学显示与NG2相似的免疫反应。再次箭头和箭头指示容器中的免疫反应。此图显示了绿色 NG2 的合并,红色中的 PDGF 受体测试版和蓝色 DAPI 的合并。
通过叠加三种不同的滤波器,发现NG2和PDGF受体β是共同本地化的。此图显示了一个免疫染色全安装制剂与NG2染色为红色。免疫反应性沿着表面血管网络可见,在肺膜内有强烈的染色。
神经元细胞在NG2染色微血管之间以DAPI蓝色核可见。此图显示了低分位分离大鼠视网膜血管网络染色的NG2在绿色和PDGF受体β在红色。整个网络显示NG2免疫反应。
PDGF受体β免疫反应在细胞生长膜中发现。在较高的放大率下,很明显PDGF受体β染色只在血管网络中的细胞索马斯中看到,表明具有抗性免疫反应。将 DAPI 染色与 NG2 和 PDGF 受体 beta 一起显示此高放大图像中两个未定义的容器壁细胞中的三个周数。
按照这些程序,其他免疫染色,如平滑肌肉细胞或内皮染色可用于回答其他问题。例如,视网膜血管中的细胞在缺血之后看起来如何?
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本文演示了用于大鼠视网膜微血管周细胞免疫组织化学可视化的三种组织制备技术:冷冻切片、整体展示和血管网络的低渗分离。这些方法对于解决眼科问题至关重要,例如周细胞增殖和迁移。
Immunohistochemical visualization of retinal microvascular pericytes is critical for early discovery and target validation in ophthalmological drug development. The ability to select and optimize tissue preparation methods directly impacts the predictive confidence of pericyte-related disease models and supports mechanistic de-risking in preclinical pipelines. These visualization strategies enable robust assessment of pericyte dynamics, informing portfolio decisions in vascular-targeted therapeutic programs.
These immunohistochemical visualization methods position retinal pericyte analysis at the intersection of early discovery, assay development, and preclinical research in ophthalmology-focused pipelines.