线粒体功能在癌症相关疲劳中的作用评价
2018年5月17日
我们的目标是制定一个实用的协议, 以评估线粒体功能障碍与疲劳相关的癌症患者。这种创新的协议是优化的临床使用只涉及标准放血和基本的实验室程序。
该程序的总体目标是评估与癌症患者疲劳相关的线粒体功能障碍。这种方法可以帮助回答支持性癌症护理领域的关键问题，例如线粒体功能障碍是否与癌症患者接受放射治疗后的疲劳有关。该技术的主要优点是侵入性较小，可以在临床上轻松用于识别有癌症治疗毒性风险的患者。
这项技术不仅促进了我们对线粒体功能障碍在癌症相关疲劳中的作用的理解，还可以改进评估并优化其管理。虽然这种方法可以深入了解癌症相关疲劳的潜在机制，但它也可以应用于其他令人疲劳的疾病状况，例如代谢和尿酸炎症状况。通常，对于刚接触这种方法的人来说，在没有事先目视演示的情况下，将呼吸抑制剂正确注射到传感器盒的每个端口中可能具有挑战性。
演示该程序的 Quang Nguyen 先生将是我们实验室的 postbac 研究员。要对传感器盒进行水合，请先将其从包装中取出。然后向工具板的每个孔中加入 200 微升校准液。
还要用 400 微升校准液填充每个护城河。接下来，将传感器板放回工具板，并开始在 37 摄氏度的非二氧化碳培养箱中水合柱过夜。根据慢性病治疗的 13 项功能评估来测量疲劳程度。
基线、中点、EBRT 完成时和 EBRT 后一年的疲劳。首先准备用于线粒体功能测量的检测培养基。准备好培养基后，将其加热至 37 摄氏度并将 pH 值调节至 7.4。
重要的是要确保在实验当天制备测定培养基，并在将 PH 调节至 37 之前加热至 7.4 度。接下来，在每个孔中接种 PBMC 以达到 80% 至 90% 的汇合度。然后以 200 x g 的速度旋转板 2 分钟，使细胞粘附在孔底部。
离心后，从每个孔中取出培养基，并用检测培养基冲洗孔一次。在每个孔中加入 180 μL 检测培养基，包括背景孔。然后将板在 37 摄氏度下在非二氧化碳培养箱中孵育 45 至 60 分钟。
为了重新配制药物，向药物中加入 252 μL 检测培养基，以生成 50 μmol 的寡霉素储备液。向药物中加入 288 微升检测培养基，以生成 50 微摩尔的 FCCP 储备溶液。最后加入 216 μL 测定培养基，生成 25 μmol 的抗霉素 a/鱼藤酮储备液。
重新配制所有三种药物后，将药物悬浮液涡旋一分钟，然后稀释工作溶液。然后在端口 A 中移液 20 微升 10 微摩尔寡霉素，使每个孔的最终浓度为 1 微摩尔。接下来在端口 B 中吸取 22 微升 10 微摩尔 FCCP，每个孔的最终浓度为 1 微摩尔。
最后，在端口 C 中移取 25 微升 5 微摩尔抗霉素 a/鱼藤酮，每个孔的最终浓度为 0.5 微摩尔。然后在细胞外通量仪器上选择 Mito Stress Test。接下来，按照仪器提示插入传感器盒。
仪器将自动执行传感器校准。校准完成后，插入仪器的细胞板以完成其余的分析。为了制备细胞增殖测定溶液，将 5.76 μL 核酸染色剂和 28.8 μL 背景抑制因子添加到 1.405 mL 磷酸盐缓冲盐水中。
Mito 压力测试结束后，在每个孔的培养基中直接加入 180 μL 2x 工作溶液。然后将细胞与 37 摄氏度的细胞增殖测定溶液孵育 45 至 60 分钟。量化读板器上 508 纳米激发和 527 纳米发射的活细胞数量，然后对 OCR 数据进行归一化。
在进行 FCCP 滴定时，一微摩尔是用于评估 PBMC 线粒体功能的最佳药物浓度。对线粒体呼吸和新鲜分离的 PBMC 的调查表明，OCR 在 3 小时开始下降，并持续到 8 小时。然而，FCCP 注射引起的最大呼吸也没有超过基础 OCR 水平。
这里显示了从两个健康个体中分离细胞的线粒体功能的正常化。事实上，归一化为绿色荧光 DNA 结合染料代表的活细胞的 OCR 在两个健康个体中是相似的。事实上，在健康受试者和疲劳受试者之间没有观察到基础 OCR 的显着差异。
然而，与对照组相比，疲劳的受试者表现出最大耗氧量和备用呼吸量降低。健康受试者和疲劳受试者之间的非线粒体和 ATP 相关耗氧量或耦合效率没有差异。一旦掌握了这项技术，如果执行得当，可以在四个小时内完成。
在尝试此过程时，请务必记住首先确定最佳细胞密度和 FCCP 浓度。按照此程序，可以执行其他方法，例如分离不同的细胞群，以指导未来专注于特定细胞类型的机制研究。开发后，这项技术为支持性护理领域的研究人员探索线粒体功能障碍在疲劳癌症患者中的作用铺平了道路。
观看此视频后，您应该对如何测量线粒体功能和临床样本有很好的了解，这些样本也可用于主动识别有发生癌症治疗相关毒性（包括疲劳）风险的患者。不要忘记，使用寡霉素和鱼藤酮等呼吸抑制剂可能非常危险。执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备。
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概览
本文介绍了一种实用的协议，旨在评估与癌症患者疲劳相关的线粒体功能障碍。该方法针对临床使用进行了优化，利用标准采血和基本实验室程序。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 临床肿瘤学
- 代谢健康
背景
- 线粒体功能障碍与癌症患者的疲劳有关。
- 理解这种关系可以增强癌症支持性护理。
- 临床环境中更倾向于使用侵入性较小的技术。
- 该方法也可能适用于其他引起疲劳的疾病。
研究目的
- 评估与癌症相关的疲劳中的线粒体功能障碍。
- 识别因癌症治疗而面临毒性风险的患者。
- 推进对癌症疲劳机制的理解。
使用的方法
- 标准采血用于样本收集。
- 基本实验室程序用于分析。
- 向传感器盒中注射呼吸抑制剂。
- 为方法的新用户提供视觉演示。
主要结果
- 该技术有效地识别线粒体功能障碍。
- 它提供了对癌症相关疲劳机制的洞察。
- 它适用于其他有疲劳症状的疾病。
结论
- 该协议适合临床使用。
- 它可以改善癌症患者疲劳的评估和管理。
- 进一步的研究可能会扩展其应用到其他疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mitochondrial dysfunction is increasingly recognized as a mechanistic contributor to cancer-related fatigue, a condition that impacts patient quality of life and may influence treatment tolerance. This protocol enables objective assessment of PBMC mitochondrial function using a compact extracellular flux system, offering a translational tool for de-risking hypotheses in supportive oncology. By providing quantitative readouts such as basal respiration, spare respiratory capacity, and energy phenotype, the method supports target validation and mechanistic insight in fatigue-related pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial function as a potential therapeutic target in cancer-related fatigue.
- Operational Value: Uses minimally invasive phlebotomy to obtain clinically relevant PBMCs for repeated longitudinal sampling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, normalized OCR data that enables comparison across time points and treatment conditions.
- Operational Value: Completes in under 4 hours with standardized normalization to live cell count, supporting assay reproducibility and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links mitochondrial metrics to clinical fatigue scores, enabling correlation of mechanistic data with patient-reported outcomes.
- Operational Value: Adaptable to other fatiguing conditions, broadening utility across metabolic and inflammatory disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by providing functional mitochondrial data that can inform target selection and pathway analysis in fatigue-associated signaling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing around mitochondrial respiration and energy metabolism in immune cells from fatigued patients.
- Screening: Delivers assay-ready, normalized mitochondrial readouts suitable for evaluating compound effects on OCR and spare capacity.
- Analytics: Provides basal, maximal, and spare respiratory capacity measurements that enable quantitative comparison of mitochondrial phenotypes.
- Translational Research: Connects ex vivo mitochondrial function to in vivo fatigue severity, supporting biomarker-aligned study designs.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, clinic-compatible workflow for longitudinal immune-metabolic monitoring in oncology cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cancer-related fatigue by providing direct functional readouts of mitochondrial health.
- Operational Value: Enables standardization across sites via normalization to live cell count and defined inhibitor injection protocols.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions in fatigue-targeted programs by identifying patients with measurable mitochondrial impairment.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-stratified advancement of interventions based on objective mitochondrial response to therapy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial assay techniques and extracellular flux instrumentation.
- Dependent on access to a calibrated extracellular flux analyzer and sensor cartridges.
- Necessitates standardized training for consistent respiratory inhibitor injection to avoid technical variability.
- Requires optimization of cell density and FCCP concentration for each PBMC donor batch.
- Limited by PBMC viability and functional stability post-isolation, necessitating same-day assay execution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:26
Mitochondrial Function Measurement and Clinical Sample Preparation (Day 1 and 2 of the Experiment)
2:16
Mitochondrial Function Measurement
5:21
Normalization of Mitochondrial Functional Data
6:13
Results: Use of Mito Stress Test to Diagnose Dysfunction in Fatigued Cancer Patients
7:34
Conclusion
