Name: 支气管肺泡灌洗外来体在脂多糖致脓毒性肺损伤中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 了解支气管肺泡灌洗液中外泌体在脂多糖诱导的脓毒性急性肺损伤中的作用机制。该方法通过分离和表征高纯度外泌体，揭示其在炎症反应和肺上皮细胞紧密连接蛋白破坏中的关键功能。

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作者声明无利益冲突。

整个实验方案需要2天时间，包括第1天进行脓毒症诱导并从动物体内分离支气管肺泡灌洗液，第2天从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离外泌体。所有实验步骤均已通过亚特兰大退伍军人医疗中心机构动物护理和使用委员会的审查和批准。
1. 小鼠急性脓毒症肺损伤模型
<ol>
	<li>使用6至8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠（体重20 - 22 g）建立动物模型，所有操作均采用无菌技术和无菌器械。将所有手术器械（包括镊子和剪刀）在121 °C条件下高压灭菌20分钟。&#160;</li>
	<li>将小鼠随机分为实验组和对照组。将小鼠固定于手术板上，通过腹腔注射给予大肠杆菌脂多糖（Escherichia coli lipopolysaccharide, LPS, 15 mg/kg）。根据每只小鼠的个体体重，将适当剂量的LPS用PBS稀释至每只0.1 mL，使用1 mL注射器配合27 G针头注射LPS溶液；对照组动物注射等体积的PBS。</li>
	<li>将小鼠饲养于生物安全二级（BSL2）动物设施中，保持笼具清洁并维持适宜的室温。</li>
	<li>24小时后，通过吸入CO2对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>选择小鼠颈部正中区域作为手术部位，做一小切口（约5 mm），使用钝头镊子轻轻分离肌肉组织以暴露气管。</li>
	<li>使用10 mL无菌注射器配合27 G针头抽取小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）。首先，将针头轻柔插入气管，缓慢注入1 mL无菌PBS，随后用另一支3 mL一次性注射器配合27 G针头抽出BALF。操作完成后，将注射器和针头丢弃至生物危害锐器容器中。</li>
	<li>按照Chauret et al.27先前所述方法，使用二氧化氯处理手术器械，随后将所有器械在121 °C条件下高压灭菌20分钟。</li>
</ol>
2. &#160;外泌体分离——连续超速离心法及表征
<ol>
	<li>用15 mL圆锥形管收集小鼠支气管肺泡灌洗液。为获取肺泡细胞，将样品在4 °C条件下以1,000 g离心10分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的15 mL圆锥形管中，然后在4 °C条件下以4,000 x g离心30分钟，以去除细胞碎片。</li>
	<li>将上清液收集到超速离心管中，在4 °C条件下以10,000 x g离心60分钟，以去除较大的细胞颗粒。</li>
	<li>将上清液转移至新的圆锥形管中，然后通过0.2 µm注射器滤器过滤样品，以去除残留的较大颗粒。</li>
	<li>将样品收集到超速离心管中，并平衡管重。在4°C条件下以140,000&#160;x&#160;g离心2小时，使外泌体沉淀。 
	注意：外泌体的大小通常在20–200 nm之间。0.2 µm滤器用于去除大于200 nm的较大颗粒。</li>
	<li>小心弃去上清液。用100 µL PBS或裂解液溶解沉淀，将外泌体样品转移至1.5 mL离心管中，并于-80 °C保存备用。 
	注意：建议使用透射电子显微镜验证所分离的外泌体。</li>
	<li>按照标准的透射电镜（TEM）样品处理流程28进行操作。使用透射电子显微镜分析外泌体样品并拍摄图像，标尺为200 nm。</li>
</ol>
3. miRNA 的制备及 miRNA 定量逆转录 PCR（q-RT-PCR）操作
注意：建议采用miRNA-q-RT-PCR分析miRNA的表达水平。
<ol>
	<li>按照标准的miRNA分离方案操作，并确保在单链反转录中使用等量的纯化RNA24。</li>
	<li>按照标准的实时PCR方案检测支气管肺泡灌洗液中外泌体microRNA的水平。使用针对miR-155、miR-146a和U6 SnRNA的特异性实时PCR引物。使用定量PCR仪器进行PCR反应，并将表达量以U6 snRNA作为内参进行归一化。 
	注意：每组包含三个重复样本24。</li>
</ol>
4. 外泌体标记与纯化
<ol>
	<li>在1.5 mL聚丙烯管中，用100 µL悬浮液重悬外泌体沉淀；另取一管加入100 µL悬浮液，并加入0.4 µL外泌体染料。</li>
	<li>迅速将外泌体溶液加入染料溶液中，通过移液充分混匀。室温避光孵育5分钟。</li>
	<li>将一个外泌体离心柱放入1.5 mL洗脱管中。将混合溶液转移至外泌体离心柱中央。</li>
	<li>室温下以800 × g离心2分钟。</li>
	<li>弃去离心柱，将洗脱后的样品储存于-20 °C，待用。</li>
</ol>
5. 受体细胞摄取外泌体的验证
<ol>
	<li>在8孔培养板中接种1 × 104 个 MLE 12 细胞/孔，在37 °C、5% CO2 条件下培养细胞。</li>
	<li>向细胞中加入10 µL荧光标记的外泌体，在37 °C孵育1小时。</li>
	<li>移除培养基，用PBS洗涤细胞，然后在室温下用1%多聚甲醛固定10分钟。</li>
	<li>用含DAPI的封片剂封片。</li>
	<li>通过荧光显微镜分析样品并采集图像，放大倍数为40倍。</li>
</ol>
6. 外泌体与受体细胞相互作用的验证
<ol>
	<li>在含有适当培养基的12孔培养板中接种2 × 105 个MLE12细胞/孔，于37 °C、5% CO2 条件下培养细胞。</li>
	<li>向MLE12细胞中加入20 µg来自小鼠支气管肺泡灌洗液的外泌体，并为每个实验组设置重复样本。</li>
	<li>24小时后，用PBS洗涤细胞，每孔加入600 µL裂解缓冲液，轻轻摇动培养板，用移液器将裂解样品收集至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>按照标准的总RNA提取和cDNA反转录操作流程，完成单链cDNA的反转录29。</li>
	<li>按照标准的实时PCR操作流程检测受体细胞中mRNA的表达水平29。&#160;使用针对TNF-α、IL-6和ZO-1的特异性实时PCR引物，用定量PCR仪进行PCR扩增反应，并以GAPDH作为内参对照对表达值进行标准化。 
	注意：每组包含三个重复样本。</li>
</ol>

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本研究由美国退伍军人事务部优秀研究基金 2I01BX001786-06A1 资助，项目负责人为 RS。

疾病的小鼠模型常用于评估特定基因的生理功能，并降低实验成本2。此处描述的急性脓毒症性肺损伤模拟了急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者中观察到的炎症反应。该模型适用于研究分子发病机制、生物标志物的开发以及潜在新疗法的测试5。
共培养系统在研究生物分子（如RNA、DNA、脂质和蛋白质）在体外系统中转移的潜在机制时，对于体内研究具有重要意义23,30。其中一些平台在解析复杂疾病机制以及开发相关疗法方面具有重要价值22,23。如本研究所示，灌洗液来源的细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）释放的外泌体可通过外泌体转移影响结构上皮细胞的完整性。
外泌体的病理生物学效应在人类疾病的诊断和治疗中正逐渐成为关键...

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是非心源性肺水肿引起的严重低氧血症性呼吸衰竭的危及生命的形式，全球每年约影响100万人1。ARDS的病因包括由感染或误吸导致的肺部直接损伤以及多种间接损伤。在过去十年中，人们对ARDS的分子发病机制有了更深入的理解，但目前尚未开发出针对ARDS的特异性靶向治疗方法2,3。
已开发出多种急性肺损伤的动物模型，这些模型为将实验性治疗手段转化为人类研究提供了桥梁4,5。常用的模型包括局部注射油酸、细菌、脂多糖（LPS）和博来霉素。其他方法包括缺血-再灌注、盲肠结扎穿孔、机械通气引起的牵拉损伤、高氧暴露，以及细菌和LPS的全身给药5。这些模型为检验临床假设和开发潜在治疗方法提供了有用的生物系统。为了模拟人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS），动物模型应能重现肺部上皮细胞和内皮细胞的炎症与急性损伤，并伴有肺屏障功能障碍。
外泌体是直径为20 - 200 nm的膜性囊泡，其分子内容物包含蛋白质、DNA、RNA和脂质，可通过分子成分的转移介导组织微环境中细胞间的通讯。外泌体由多种细胞分泌，如内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞和肿瘤细胞，并存在于人体体液中。研究表明，在感染性和非感染性炎症疾病过程中，外泌体可调节免疫细胞与基质细胞之间的相互作用，其异常释放似乎在生理和病理过程中受到多种天然及实验性刺激的调控6。此类通讯网络可能在肺部疾病的发病机制中发挥重要作用，并影响其病理生理进程7,8。miRNA是一类长度为18 - 22个核苷酸的非编码RNA，存在于组织和体液（如血浆、血清）中，可在转录后水平调控mRNA的表达9,10。
外泌体中包裹的miRNA影响多种细胞的分化和功能，其过量表达与多种疾病相关，包括癌症、肺部疾病、肥胖、糖尿病和心血管疾病11,12,13,14,15,16。外泌体miRNA进入受体细胞并进行转运，有助于细胞间通讯，从而调节微环境的稳态17,18。急性肺损伤是一个复杂的过程，涉及多种细胞类型，并通过外泌体实现广泛的细胞间通讯8。miR-155和miR-146a具有共同的转录调控机制，在炎症反应和免疫耐受中发挥重要作用19,20。近期研究表明，两者均通过免疫细胞间外泌体miRNA的转运来调节炎症反应21。然而，外泌体miRNA对肺泡细胞响应内毒素的调节作用所涉及的分子机制仍不明确，其潜在的临床意义和转化价值无疑值得进一步研究。
共培养模型被用于界定特定细胞类型在复杂环境（如炎症和癌症）中的相互作用22,23。这些平台为研究细胞类型之间的相互交流，特别是免疫细胞与结构细胞之间的相互作用，提供了一种替代策略。
气管内、气溶胶、腹腔或全身给予脂多糖（LPS）被广泛用于诱导实验性肺损伤24,25,26，并已被证明可引起肺上皮和内皮通透性障碍。本研究中，我们采用腹腔注射LPS在小鼠中建立急性肺损伤的脓毒症模型。腹腔注射LPS后24小时内，肺组织即出现通透性障碍，并伴有炎性细胞的募集。此外，我们发现支气管肺泡灌洗液（BAL）来源的外泌体含有miRNA-155和miR-146a，且BAL液中的外泌体可诱导受体上皮细胞表达包括IL-6和TNF-α在内的促炎性细胞因子。这些数据首次表明，在该急性脓毒症肺损伤模型中，外泌体miRNA可分泌至BAL液中。

<table><tbody><tr><td>脂多糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Escherichia coli 055:B5</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH7.2(1X)</td><td>Life technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA 提取试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>449774</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达预混液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>mmu-miR-155 (002571) 引物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-146a (000468) 引物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>U6snRNA 引物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;(Mm00443258_m1) 引物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 (Mm00446190_m1)&amp;nbsp;&amp;nbsp; 引物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1（Mm00493699_m1）&amp;nbsp; 引物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基（MEM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11095-072</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>使用PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒（Mini Kit）将外泌体标记PKH67&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>外泌体离心柱（MW3000）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4484449</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100XP 超速离心机&amp;nbsp;</td><td>贝克曼库尔特</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>超透明离心管</td><td>贝克曼库尔特</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Fast 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜（TEM）</td><td>日本电子株式会社</td><td>120 kV 透射电子显微镜</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯 BX41 显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

脂多糖诱导的脓毒性肺损伤中支气管肺泡灌洗外泌体

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一组异质性肺部疾病，其发病率和死亡率仍然较高。尽管ALI的分子发病机制正在逐步明确，但由于该疾病具有复杂的特性，目前尚未开发出有效的分子疗法。本文采用脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性脓毒症肺损伤模型，以阐明外泌体在炎症反应中的作用。利用该模型，我们发现经腹腔注射LPS的小鼠会从肺部分泌含有miRNA和细胞因子的外泌体进入支气管肺泡灌洗（BAL）液中，这些分子可调控炎症反应。此外，通过共培养模型系统，我们证实巨噬细胞释放的外泌体可破坏支气管上皮细胞中紧密连接蛋白的表达。这些结果提示：1）天然免疫细胞与结构细胞之间通过外泌体介导的信号传递相互作用，参与了炎症反应及结构屏障的破坏；2）靶向这些miRNA可能为治疗ALI和ARDS提供一种全新的策略。

为诱导脓毒症性肺损伤，小鼠接受腹腔注射脂多糖（LPS，15 mg/kg）。LPS给药后24小时内，肺部出现中性粒细胞浸润，如图1A所示。采集小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF），随后分离并纯化外泌体。通过透射电子显微镜确认BALF外泌体的形态（图1B）。
通过q-RT-PCR检测纯化的外泌体中选择性促炎性miRNA miRNA-155和miR-146a的表达。与PBS处理的对照组小鼠相比，LPS处理小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）外泌体中miR-155和miR-146a的表达水平显著升高（miR-155，1 ± 0.16 vs 11.6 ± 0.6；miR-146a，1 ± 0.12 vs 13.5 ± 1.186）（图2）。
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经腹腔注射LPS的小鼠在支气管肺泡灌洗（BAL）液中分泌含有miRNA的外泌体。利用共培养系统，我们发现BAL液中释放的外泌体可破坏支气管上皮细胞中紧密连接蛋白的表达，并增加促炎性细胞因子的表达，从而加剧肺损伤。

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一组异质性肺部疾病，其发病率和死亡率仍然较高……

本实验的总体目标是阐明外泌体在脂多糖（LPS）诱导的急性脓毒症肺损伤小鼠模型中炎症反应的作用。因此，该方法有助于回答与急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征中细胞间相互作用相关的关键问题，特别是通过外泌体转运介导的肺泡微环境内的细胞间通讯。该技术的主要优势在于，能够从经内毒素处理并患有急性肺损伤的脓毒症小鼠中分离并表征高度纯化的支气管肺泡灌洗外泌体。演示该操作的是袁志宏博士和Chetna Bedi博士。首先，使用配备27号针头的1毫升注射器，每只小鼠注射0.1毫升LPS和PBS混合液，并手动固定第一只6至8周龄的雄性C57 black 6J小鼠。通过腹腔注射给予LPS，并将动物放回笼中。24小时后，在第一只动物颈部中央做一个5毫米的切口，使用钝头镊子轻轻分离肌肉以暴露气管。接着，将连接无菌10毫升注射器的27号针头轻轻插入气管，注入1毫升无菌PBS。然后立即用装有新的27号针头的3毫升注射器替换10毫升注射器。抽吸支气管肺泡灌洗液（BOLF），并将BOLF加入预先标记好的、置于冰上的15毫升锥形管中。为分离外泌体，将BOLF样本离心，并将上清液转移至新的15毫升离心管中。再次离心样品，并将上清液转移至超速离心管中，以去除较大的细胞颗粒。将上清液转移至新的锥形管中，然后将样品加入0.2微米针筒式滤器，以去除任何残留的较大颗粒。将过滤后的样品加入新的超速离心管中，以沉淀外泌体。小心弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮于每管 100 微升的 PBS 中。然后将外泌体样品转移至各自的 1.5 毫升离心管中，于 -80 摄氏度保存。为纯化外泌体，向每份含有 100 微升悬浮液的样品管中加入 0.4 微升适当的外泌体染料，并迅速将一份解冻的外泌体样品加入每管染料中。将外泌体与染料充分混匀，在室温下避光孵育5分钟。孵育结束后，每个样本取一个外泌体离心柱放入1.5毫升离心管中，将外泌体溶液转移至每个离心柱的中心。随后离心样本，弃去离心柱，并将所得样本于-20°C保存。为了检测受体细胞对外泌体的摄取，首先将1×10⁴个小鼠肺上皮12细胞接种于八孔板的每个孔中，每孔加入0.5毫升培养基，在37°C、5% CO₂条件下培养16小时。解冻后，向每孔加入10 µL纯化的荧光标记外泌体，并将细胞培养物放回培养箱孵育1小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞，并在室温下用1%多聚甲醛固定共培养细胞10分钟。吸去培养基，然后用含DAPI的封片液封片，并在40倍放大倍数下通过荧光显微镜观察样品。为验证外泌体与受体细胞的相互作用，将两乘以10的5次方个小鼠肺上皮12细胞接种于12孔培养板中，每孔加入2毫升适当的培养基，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2小时。孵育结束后，向每个实验组的三个上皮细胞孔中各加入20微克外泌体，并将细胞放回培养箱继续孵育。24小时后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞，每孔加入600微升裂解缓冲液，轻轻振荡。然后将每孔中的全部内容物转移至各自的1.5毫升离心管中，并根据标准的实时PCR操作流程分析样品。在给予LPS后24小时内，可在LPS处理动物的肺组织中观察到中性粒细胞的浸润。在如上所述完成分离与纯化后，可通过透射电子显微镜确认脓毒症肺损伤动物支气管肺泡灌洗液（BOLF）中存在外泌体。与经PBS处理的对照小鼠相比，经LPS处理的小鼠其支气管肺泡灌洗液外泌体中特定促炎性microRNA的表达显著升高。经LPS处理的外泌体可被小鼠细支气管上皮细胞摄取，共培养1小时后，荧光染料标记的外泌体与DAPI标记的细胞出现共定位，证实了这一摄取过程。与来自对照组PBS处理小鼠的外泌体共培养相比，与来自LPS处理动物的外泌体共培养的上皮细胞中，促炎介质的表达显著增加。此外，经LPS处理小鼠来源外泌体处理的细胞，其闭锁小带蛋白1（zonula occludens one）的表达显著降低，表明在LPS处理的外泌体共培养后细胞完整性较差。腹腔注射LPS、支气管肺泡灌洗液提取以及从支气管肺泡灌洗液中分离外泌体等所有步骤均可在相对较短的时间内完成。通过该实验流程，还可进一步开展外泌体与上皮细胞共培养等其他方法，以探究肺泡微环境中固有免疫细胞与结构细胞之间的相互作用。外泌体介导的固有免疫细胞与结构细胞之间的相互交流，参与了炎症反应及结构屏障的破坏过程，提示靶向外泌体中的微小RNA可能为治疗急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征提供新的干预平台。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在小鼠中诱导脓毒症性肺损伤、从小鼠中分离支气管肺泡灌洗液、从灌洗液中提取外泌体，以及如何利用共培养模型研究细胞内信号交互作用。请注意，操作LPS可能存在危险，进行本实验时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的个人防护装备。

bronchoalveolar-lavage-exosomes-lipopolysaccharide-induced-septic

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

来源：Yuan, Z., et al. 脂多糖诱导的脓毒症肺损伤中的支气管肺泡灌洗外泌体。 J. Vis. Exp.

小鼠脂多糖诱导急性肺损伤用于外泌体与免疫分析

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使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

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使用超滤离心技术从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡

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非侵入性经气管给予脂多糖诱导啮齿类动物急性肺损伤

本方案描述了一种利用微电穿孔法高效转染新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞中siRNA，并鉴定这些细胞中DNA-蛋白质复合物的方法。在4天的培养期间，可通过Western印迹和EMSA分析对转染细胞进行监测。...

新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞的siRNA转染及EMSA分析

了解支气管肺泡灌洗液中外泌体在脂多糖诱导的脓毒性急性肺损伤中的作用机制。该方法通过分离和表征高纯度外泌体，揭示其在炎症反应和肺上皮细胞紧密连接蛋白破坏中的关键功能。

脂多糖诱导的脓毒性肺损伤中支气管肺泡灌洗外泌体

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