3D 染色细胞的包覆和超弹性蛋白样凝胶的制备
2018年5月19日
重组蛋白工程水凝胶有利于3D 细胞培养, 因为它们允许完整的调谐的聚合物骨干, 因此, 细胞微环境。在这里, 我们描述了重组弹力蛋白样蛋白质纯化的过程及其在3D 水凝胶细胞封装中的应用。
该方案的总体目标是表达和纯化重组衍生的弹性蛋白样蛋白，用作 3D 细胞封装的可调水凝胶。此外，该协议还介绍了封装细胞共聚焦显微镜中下游荧光标记的方法。这种方法可以帮助回答生物材料、再生医学和细胞生物学领域的关键问题，例如了解细胞-细胞外基质相互作用在 3D 中的作用。
该技术的主要优点是它提供了一个可重复、可调谐和模块化的材料平台，适用于多种细胞类型的研究。总体而言，该技术的实施可以提高我们对关键细胞 ECM 信号转导参数的理解，这些参数可能决定未来基于细胞的再生疗法的成功。用预制的细菌原液在氨苄青霉素和氯霉素琼脂平板上划线，该原液含有编码目标 ELP 的载体。
然后将带条纹的板在 37 摄氏度下倒置孵育过夜，以允许细菌生长。第二天，从平板中挑选一个菌落，并接种预热的发酵剂培养物。将培养物在 37 摄氏度的摇床中孵育 16 小时。
孵育期后，使用血清移液管将 20 mL 起始培养物转移到每个表达瓶中。让 expression 培养瓶振荡 1 小时。一小时后，测量来自表达瓶的 600 纳米等分试样的光密度。
一旦读数达到 0.6，就将摇床的温度降低到 32 摄氏度。当读数达到 0.8 时，加入 1 毫升 1 摩尔无菌过滤的 IPTG，以在表达瓶中诱导 ELP 表达。让培养物挤奶 7 小时。
7 小时后，在落地式离心机中以 12， 000 x g 的离心力在 4 摄氏度下离心 15 分钟。离心后，使用刮刀从离心容器中收集细胞沉淀，并放入预先称重的密封袋中。接下来，将细胞沉淀溶解在无菌过滤的 TEN 缓冲液中。
按摩细胞沉淀以形成均匀的溶液。将装有重悬细胞沉淀的 Ziploc 袋冷冻在 80 摄氏度的二级容器中。对于解冻的细胞沉淀物，每 100 mL 细胞裂解物添加大约 30 至 40 mg 脱氧核糖核酸酶和 1 mL 100 mmol PMSF。
将裂解物在 4 摄氏度下在摇床上孵育过夜。在第三个冻融循环之后，将样品在至少 15， 000 x g 的温度下在 4 摄氏度下离心 1 小时。离心后，从离心容器中倒出上清液，然后将溶液转移到新的离心容器中。
向每 100 毫升上清液中加入 5.84 克氯化钠，分三份加入至最终的 1 摩尔浓度。将悬浮液在 37 摄氏度的摇动培养箱中孵育 3 小时。孵育后，将样品在 37 摄氏度下以至少 15， 000 x g 的速度离心 1 小时。
离心后，从离心容器中弃去上清液，使沉淀团聚质。接下来，离心后获得的每克沉淀中加入 10 毫升高压灭菌的超纯水。为确保蛋白质完全溶解，请使用金属刮刀捣碎并重新悬浮沉淀。
将重悬的沉淀物在 4 摄氏度下在轨道振荡器上孵育过夜。重复冷和热离心步骤，总共三个循环，以进一步纯化 ELP。接下来，将 3.5 道尔顿透析膜中的残留上清液与 4 升预冷超纯水在 4 摄氏度下浸泡 3 天，以对蛋白质溶液进行脱盐。
在预冷的离心机中离心最终透析的溶液。将上清液在 80 摄氏度下冷冻在预先称重的锥形管中。最后，将冷冻溶液冻干 3 天，然后称量最终冻干产品以确定蛋白质产量。
在活检打孔器的帮助下，在 0.5 毫米厚的硅胶片上打孔。然后在每个孔周围切一个正方形。接下来，用镊子去除各个模具两侧的保鲜膜。
取下保鲜膜后，用镊子将相同数量的裸硅胶模具和玻璃盖玻片交替排列在 48 孔板的盖子上，以便随后进行等离子粘合。制备完所有细胞培养材料后，可以开始制备用于下游水凝胶包埋的目标细胞类型。将细胞解离成单细胞悬液后，将所需数量的细胞分装到 1.5 mL 离心管中。
然后，以大约 200 x g 的离心速度将细胞离心 3 分钟。离心后，吸出上清液并将沉淀储存在冰上。将细胞沉淀重悬于 ELP 储备溶液中至最终体积的 80%。
然后使用移液器将溶液混合到 ELP 中均匀的细胞悬浮液中。对于剩余的 20% 最终体积，将 THPC 储备溶液添加到细胞 ELP 悬浮液中。移液数次以确保形成均匀的混合物，同时避免形成气泡。
接下来，以圆周运动，将细胞 ELP THPC 混合物移液到 24 孔板中的每个模具中。然后将样品在室温下孵育 15 分钟。15 分钟后，将样品在 37 摄氏度下再孵育 15 分钟。
孵育结束后，小心地向 24 孔板中的每个孔中加入 750 μL 温热的细胞培养基。将水凝胶在 37 摄氏度下放置所需的培养持续时间。首先，从每个孔中吸出培养基。
然后用 1 毫升温热的 DPBS 清洗孔。洗涤完成后，向每个孔中加入 750 微升固定液。然后，将 24 孔板在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。
孵育后，从每个孔中吸出固定液，并将固定剂丢弃在危险废物容器中。接下来，向样品中加入 1 毫升 DPBS，并立即将 DPBS 丢弃到危险废物容器中。接下来，加入 750 μL 透化溶液，在室温下以每分钟 15 转的速度在摇杆上透化样品 1 小时。
一小时后，吸出透化溶液，并向样品中加入 750 μL 封闭液。将样品在室温下放在摇床上 3 小时。然后用抗体稀释液稀释所需的一抗。
接下来，向每个样品中加入 500 μL 抗体溶液。将样品在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，吸出一抗溶液，然后用 PBST 在室温下以每分钟 15 转的速度洗涤样品 1 小时，每次 3 次。
接下来，在 5 毫克/毫升的 DAPI 储备液中稀释适当的二抗，以达到 2.5 微克/毫升的最终浓度。然后，向每个样品中加入 500 微升溶液。接下来，使用铝箔覆盖 24 孔板，并将板在 4 摄氏度下孵育过夜。
第二天，吸出二抗溶液，并在室温下用 PBST 在摇杆上洗涤样品 3 次，每次 30 分钟。接下来，将一滴硬质封固剂放在载玻片的表面，并将样品放在封固剂上。最后，使用指甲油将样品密封到玻璃盖玻片上，以防止污染或样品移动。
在这里，在 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析中，在 37 道尔顿处存在条带，验证了在受控条件下靶蛋白与全长 ELP 的表达。然而，在不受控制的条件下，使用 western blot 也可以看到几个低分子量条带。较低分子量条带对应于弹性蛋白样结构域重复次数少于 4 次的蛋白质，表明蛋白质在表达过程中未完全翻译。
当进行 32 摄氏度以上的表达式时，此结果很常见。为了改变细胞粘附配体浓度，同时保持水凝胶机械性能恒定，调整了含有纤连蛋白衍生的细胞粘附物和非细胞粘附序列的 ELP 变体的比例。此外，当封装在 3% ELP 水凝胶中时，小鼠神经祖细胞在 7 天内也具有活力。
由于钙黄绿素 AM 染色，活细胞被鉴定为绿色，而红色的乙锭同源二聚体优先被死细胞占据。为了验证神经祖细胞的干细胞表型，当细胞被封装在 3D ELP 水凝胶中时，还可以通过免疫染色观察 Sox2 和 nestin 等经典标志物的表达。看完这个视频后，你应该对如何表达和纯化弹性蛋白样蛋白用于各种细胞类型的下游包埋有很好的了解，此外，还研究了 3D 微环境在调节细胞表型中的作用。
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概览
本协议概述了弹性蛋白样蛋白的表达和纯化，用于适合3D细胞包封的可调谐水凝胶。它还详细说明了用于共聚焦显微镜分析的包封细胞的荧光标记方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物材料
- 再生医学
- 细胞生物学
背景
- 重组蛋白工程化水凝胶提供了聚合物主链的可调谐性。
- 这些水凝胶可以显著影响细胞微环境。
- 了解细胞-细胞外基质相互作用对再生治疗至关重要。
- 该技术提供了一个可重复和模块化的材料平台。
研究目的
- 纯化弹性蛋白样蛋白以用于3D细胞包封。
- 在受控环境中研究细胞-ECM相互作用。
- 提高对影响再生治疗的细胞信号参数的见解。
使用的方法
- 在细菌系统中表达弹性蛋白样蛋白。
- 纯化蛋白质以形成水凝胶。
- 包封细胞的荧光标记。
- 共聚焦显微镜用于成像细胞相互作用。
主要结果
- 成功纯化了弹性蛋白样蛋白。
- 开发了可调谐的3D细胞培养水凝胶。
- 验证了共聚焦显微镜的荧光标记技术。
- 获得了在3D环境中细胞-ECM相互作用的见解。
结论
- 该协议提供了研究3D细胞行为的稳健方法。
- 重组水凝胶可以为各种细胞类型定制。
- 这种方法可能会增强未来的基于细胞的再生治疗。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible, tunable hydrogel platforms for 3D cell encapsulation, addressing the translational gap between 2D in vitro models and in vivo microenvironments. By providing independent control over mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration, it supports mechanistic de-risking in early discovery and improves predictive confidence in cell-based regenerative therapy development. The method enhances workflow continuity from target validation through preclinical modeling by enabling standardized, quantitative assessment of cell-ECM interactions in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modulating ECM mechanics and ligand density to clarify pathway-specific cell responses.
- Operational Value: Provides a modular material system for consistent phenotypic screening across multiple cell types under defined 3D conditions.
- Predictive Value: Supports lead identification by reducing mechanistic ambiguity in cell-ECM signaling parameters critical for regenerative medicine targets.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized hydrogels with quantifiable mechanical and biochemical outputs for reliable compound or genetic perturbation screening.
- Reproducibility: Enables batch-to-batch consistency in hydrogel formulation, supporting assay standardization and cross-functional data comparison.
- Scalability: Supports platform reuse in downstream workflows through lyophilized protein storage and rapid reconstitution for high-throughput encapsulation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates modeling of pathophysiological microenvironments by tuning hydrogel properties to match tissue-specific ECM profiles.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining consistent 3D culture conditions across workflow stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on quantitative immunostaining readouts of stemness markers and viability in encapsulated cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification and preclinical evaluation, providing a tunable 3D system that improves biological fidelity at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise control over ECM variables that influence cellular phenotype and signaling.
- Screening: Delivers assay-ready hydrogels with reproducible encapsulation efficiency and downstream compatibility with immunostaining and imaging workflows.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts from immunostained biomarkers (e.g., Sox2, nestin) and viability assays, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains phenotypic stability of progenitor cells over extended culture periods, supporting continuity from mechanistic discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Positions the ELP expression and purification pipeline as a reusable platform capability for multiple projects requiring customizable 3D microenvironments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing biological noise through tunable, defined 3D matrices that better reflect in vivo ECM complexity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via lyophilizable protein stocks and standardized encapsulation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insights into cell-ECM dependencies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating quantitative, imaging-based endpoints for assessing cellular responses in 3D.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression, bacterial culture, and purification techniques including centrifugation, dialysis, and lyophilization.
- Dependent on access to shakers, centrifuges, and electrophoresis/wblotting equipment for expression validation and quality control.
- Necessitates standardization of hydrogel formulation ratios and crosslinking conditions across teams to ensure mechanical and ligand consistency.
- Requires adaptation of cell dissociation and resuspension protocols for different cell types to maintain viability during encapsulation.
- Practical limitations include the need for optimization of ELP variant ratios to independently tune mechanics and adhesion without compromising gelation kinetics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
ELP Expression Protocol
5:06
Cell Encapsulation in 3D Elastin-like Protein Hydrogels
7:11
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
9:47
Results: Purification of Elastin-like Protein and its Application for 3D Hydrogel Cell Encapsulation
11:18
Conclusion
