用于细胞三维包封与免疫染色的弹性蛋白样蛋白水凝胶的制备

本实验方案的总体目标是表达并纯化重组弹性蛋白样蛋白，用于制备可调节的水凝胶，以实现三维细胞包封。此外，本方案还介绍了对包封细胞进行共聚焦显微镜下游荧光标记的方法。该方法有助于回答生物材料、再生医学和细胞生物学领域中的关键科学问题，例如深入理解三维环境中细胞与细胞外基质相互作用的功能。

该技术的主要优势在于提供了一个可重复、可调节且模块化的材料平台，适用于多种细胞类型的研究。总体而言，该技术的应用可增进我们对关键细胞外基质（ECM）信号参数的理解，这些参数可能决定未来基于细胞的再生疗法的成败。用含有编码目标弹性蛋白样多肽（ELP）载体的预制细菌菌种，在含氨苄青霉素和氯霉素的琼脂平板上划线。

然后将划线后的平板倒置于37摄氏度培养过夜，以促进细菌生长。次日，从平板上挑取单个菌落，接种至预热的起始培养液中。将培养物置于37摄氏度摇床中培养16小时。

孵育结束后，使用血清学移液管将20毫升的种子培养物转移至每个表达培养瓶中。将表达培养瓶继续振荡培养1小时。1小时后，取表达培养瓶中的等分试样，测定其在600纳米处的光密度。

当读数达到0.6时，将摇床温度降至32摄氏度。当读数达到0.8时，向表达烧瓶中加入1毫升1摩尔的无菌过滤IPTG以诱导ELP表达。让培养物表达7小时。

七小时后，在落地式离心机中，于 4 °C 下以 12,000 × g 离心表达培养基 15 分钟。离心结束后，使用刮勺从离心容器中收集细胞沉淀，并转移至已预先称重的密封袋中。接着，将细胞沉淀溶解于无菌过滤的 TEN 缓冲液中。

轻轻按摩细胞沉淀，使其形成均匀的溶液。将含有重悬细胞沉淀的密封袋放入次级容器中，在 -80 摄氏度下冷冻。向解冻的细胞沉淀中加入脱氧核糖核酸酶 30 至 40 毫克以及 100 毫摩尔的 PMSF 1 毫升，每 100 毫升细胞裂解液对应上述添加量。

将裂解液在4°C条件下于摇床中孵育过夜。完成第三次冻融循环后，在4°C条件下以至少15,000 × g离心一小时。离心结束后，将离心管中的上清液倾出，并将溶液转移至新的离心管中。

每 100 毫升上清液中，分三次加入 5.84 克氯化钠，使其终浓度为 1 摩尔/升。将悬浮液在 37 摄氏度的摇床培养箱中孵育 3 小时。孵育结束后，在 37 摄氏度下以至少 15,000 × g 离心 1 小时。

离心后，弃去离心容器中的上清液，并称量沉淀物。随后，每克离心所得沉淀物加入10毫升经高压灭菌的超纯水。为确保蛋白质完全溶解，使用金属刮勺将沉淀物研磨并重新悬浮。

将重悬的沉淀物在4°C下于旋转摇床上孵育过夜。重复冷热离心步骤，共进行三个循环，以进一步纯化ELP。接着，将残留的上清液置于3.5千道尔顿透析膜中，在4°C下对4升预冷的超纯水透析三天，以去除蛋白质溶液中的盐分。

将最终透析后的溶液在预冷的离心机中离心。将上清液转移至已预先称重的锥形管中，并在 -80 °C 下冷冻。最后，将冷冻的溶液冻干三天，然后称量最终的冻干产物以确定蛋白得率。

借助活检打孔器，在厚度为 0.5 毫米的硅胶片上打孔。然后在每个孔周围切割出方形。接下来，使用镊子去除每个独立模具两侧的塑料薄膜。

去除保鲜膜后，使用镊子将相同数量的裸露硅胶模具和玻璃盖玻片交替排列在48孔板的盖子上，以备后续等离子体键合。所有细胞培养材料制备完成后，即可开始制备用于后续水凝胶包埋的目标细胞类型。将细胞解离成单细胞悬液后，将所需数量的细胞分装至1.5毫升离心管中。

然后，在约 200 × g 条件下离心细胞 3 分钟。离心后，吸除上清液，并将沉淀物置于冰上保存。用 ELP 储存液将细胞沉淀重悬至终体积的 80%。

然后使用移液器将溶液混匀，使细胞在ELP中形成均一的悬浮液。对于剩余的20%终体积，向细胞ELP悬浮液中加入THPC储存液。反复吹打数次以确保形成均一的混合物，同时避免产生气泡。

接下来，以环形方式将细胞ELP THPC混合物移液至24孔板的每个模具中。然后在室温下孵育样品15分钟。15分钟后，将样品在37摄氏度下继续孵育15分钟。

孵育结束后，向24孔板的每个孔中小心加入750微升预热的细胞培养基。将水凝胶置于37摄氏度，持续培养至所需时间。首先，吸除每个孔中的培养基。

然后用一毫升温热的DPBS洗涤各孔。洗涤完成后，向每孔加入750微升固定液。随后，将24孔板在37摄氏度孵育30分钟。

孵育结束后，吸出各孔中的固定液，并将固定液弃置于危险废物容器中。随后，向样品中加入1毫升DPBS，立即弃去DPBS至危险废物容器中。接着，加入750微升通透液，在室温下以每分钟15转的振荡速度通透样品1小时。

孵育一小时后，吸除透化溶液，向样品中加入 750 微升封闭液。将样品置于摇床，在室温下孵育三小时。随后用抗体稀释液稀释所需的一抗抗体。

接下来，向每个样品中加入 500 µL 抗体溶液。在 4 °C 下孵育样品过夜。次日，吸去一抗溶液，然后在室温下用 PBST 洗涤样品，每 15 转/分钟洗涤 1 小时，共洗涤三次。

接下来，将适当的二抗用终浓度为5毫克/毫升的DAPI储存液稀释，使其终浓度达到2.5微克/毫升。然后，向每个样本中加入500微升该溶液。接着，用铝箔包裹24孔板，并在4摄氏度下避光孵育过夜。

第二天，吸去二抗溶液，用 PBST 在室温下于摇床上对样品进行三次洗涤，每次 30 分钟。接着，在玻璃载片表面滴加一滴固化封片剂，将样品置于封片剂上。最后，用指甲油将样品封固在玻璃盖片上，以防止污染或样品移动。

在此，通过 SDS-PAGE 和 Western 印迹分析中均出现 37 千道尔顿的条带，验证了在受控条件下全长 ELP 融合目标蛋白的表达。然而，在非受控条件下，Western 印迹中还可观察到多个低分子量条带。这些低分子量条带对应于含有少于四个弹性蛋白样结构域重复序列的蛋白质，表明该蛋白在表达过程中未完全翻译。

当在 32 摄氏度以上进行上述表达时，该结果较为常见。为了在保持水凝胶机械性能不变的同时改变细胞黏附配体浓度，可调节含有纤维连接蛋白来源的细胞黏附序列和非细胞黏附序列的 ELP 变体的比例。此外，小鼠神经前体细胞在 3% ELP 水凝胶中包封后，在七天内也保持活性。

活细胞因钙黄绿素AM染色呈绿色，而死细胞则优先摄取红色的碘化丙啶同源二聚体。为了验证神经前体细胞的干细胞表型，当细胞被包封于三维弹性蛋白样多肽水凝胶中时，还可通过免疫荧光染色观察Sox2和nestin等经典标志物的表达。观看本视频后，您应能够充分理解如何表达和纯化弹性蛋白样蛋白，用于后续多种细胞类型的包封，并进一步研究三维微环境在调控细胞表型中的作用。