Name: 体内运动神经元变性小鼠前肢肌作用电位的电生理测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学习在小鼠前肢肌肉中进行复合肌肉动作电位电生理测量的方法，用于评估神经退行性疾病中的轴突变性和脱髓鞘。该技术具有微创、可重复测量的优势，适用于CMT1A等疾病的早期诊断研究。

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本研究得到了鲁汶大学（“开启未来”项目和C1项目）、弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen）、蒂埃里·拉特兰基金会、比利时神经肌肉疾病协会（ABMM）、肌肉萎缩症协会（MDA）、美国渐冻症协会以及比利时渐冻症联盟（ALS Liga）的资助。PVD 获得弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen）资深研究员职位支持。RP 曾获得爱尔兰中央康复诊所（CRC）资助，目前获得爱尔兰国立大学（NUI）和 FWO 的资助。

所有动物均按照鲁汶大学（KU Leuven - University of Leuven）的指南以及相关的欧洲指南（欧盟动物实验指令 2010/63/EU）在标准条件下饲养。所有动物实验均经鲁汶大学当地伦理委员会批准。
1. 动物准备与麻醉
<ol>
	<li>使用异氟烷/氧气吸入法对小鼠进行麻醉诱导。诱导麻醉时使用4%异氟烷，维持麻醉时使用2-3%异氟烷，氧气流速为2.5 L/min。根据小鼠状况调整维持麻醉所需的异氟烷浓度，i.e.，体型较小或较虚弱的小鼠需要较少的麻醉剂。通过轻压后肢足垫以确认麻醉深度，e.g.，检查是否无疼痛退缩反射。</li>
	<li>使用设定为37 °C的恒温加热板控制小鼠体温，防止麻醉期间体温下降。</li>
	<li>为小鼠佩戴用于维持麻醉的鼻罩。通过检查鼻罩是否未阻塞气道以及动物是否呼吸平稳，确保其获得充足的氧气供应。</li>
	<li>在记录过程中，通过观察呼吸频率（麻醉状态下约为1 Hz）以及轻压时是否无退缩反射，监测小鼠是否处于充分麻醉状态。若麻醉深度不足，需手动提高异氟烷浓度。</li>
	<li>测量结束后，将小鼠留在加热板上或红外灯的温暖环境中恢复，直至其意识恢复到能够维持胸卧位，约需2-5分钟。在小鼠完全从麻醉中恢复之前，不得离开其身边，也不得将其与其他小鼠放在一起。</li>
</ol>
2. 后肢和前肢复合肌肉动作电位的测量
<img alt="啮齿类动物电生理实验装置；用于神经活动测量的电极放置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. CMAP测量中电极的放置位置。 图示为后肢（A）和前肢（B）的电极位置。电极编号如下：1：阳极刺激电极，2：阴极刺激电极，3：主动记录电极，4：参考电极，以及5：接地电极。 <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>使用 27 G 针状电极进行后肢和前肢复合肌肉动作电位（CMAP）测量。电极放置位置的推荐位置参见图 1。</li>
	<li>按以下方式在后肢放置电极。
	<ol>
		<li>将小鼠俯卧位置于加热垫上。伸展膝关节处的后肢，并用胶带将足部固定在工作表面上（图 1A）。</li>
		<li>将刺激电极以约 2 cm 的间距（1 = 阳极，2 = 阴极）皮下插入坐骨切迹两侧。提起皮肤，将针头垂直穿入皮肤，并将约 5 mm 针体推入皮下，避免刺穿下方肌肉。</li>
		<li>同样，将记录电极（3）皮下置于腓肠肌对齐位置。将参考电极（4）以 30 度角皮下插入跟腱旁，针体约 2–5 mm 置于皮下。将接地电极（5）以与刺激电极类似的方式皮下置于小鼠侧部，但该电极的位置对测量结果无关键影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下方式在前肢放置电极。
	<ol>
		<li>将小鼠仰卧位置于加热垫上，并用胶带将双侧前肢向身体两侧伸展（图 1B）。</li>
		<li>将刺激电极（1 = 阳极，2 = 阴极）皮下插入前肢两侧，对齐臂丛神经。提起皮肤，将针头垂直穿入皮肤，并将约 5 mm 针体推入皮下，避免刺穿下方肌肉。</li>
		<li>通过提起皮肤，将记录电极（3）皮下置于肱二头肌上方。将参考电极（4）以 30 度角插入足垫，深度约 3 mm。将接地电极（5）皮下置于小鼠侧部。 
		注意：在此设置中，电极彼此间距较近。应防止电极相互接触，以免干扰记录信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据采集
<ol>
	<li>通过按下控制器单元中的recurrent stimulus按钮开始刺激，并旋转强度控制器旋钮以增加刺激强度。使用1次/秒的频率、0.1 ms的刺激持续时间刺激所有轴突。在软件中从下拉菜单中选择正确的频率和持续时间。</li>
	<li>为达到超强刺激（5–20 mA；在脱髓鞘条件下可高达60 mA），通过旋转强度控制器旋钮逐步增加刺激强度，直至复合肌肉动作电位（CMAP）反应的幅度不再增加。此后，再将刺激强度额外增加20%，以确保CMAP幅度已达到最大反应。再次按下recurrent stimulus按钮以结束刺激。</li>
	<li>使用标记工具在记录图中标注以下时间点：刺激起始点、反应起始点、最大正向波峰和最大负向波峰（图2）。</li>
	<li>测定潜伏期（单位为ms），即从刺激起始到反应起始之间的延迟时间（图2）。将反应起始点定义为波形幅度开始上升的最早时间点。利用潜伏期评估轴突是否存在脱髓鞘。</li>
	<li>测量波幅（单位为mV），即从最大负向波峰到最大正向波峰之间的差值（图2）。通过波幅大小来推断功能性轴突的数量。</li>
</ol>
<img alt="电生理波形图，显示波幅和潜伏期，动作电位测量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图2. CMAP反应的代表性图像。 一个描述性的CMAP反应，标示出用于计算波幅和潜伏期的测量点（A）。潜伏期是指从刺激开始到CMAP反应起始之间的时间延迟。峰-峰波幅则从双相波的最负峰值到最正峰值进行测量。图中还展示了健康非转基因动物（B）和潜伏期延长、波幅降低的患病动物（C）的代表性记录。 <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="6">
	<li>由于电极的精确放置位置可能影响记录结果的数值，需更换电极并使用超最大刺激对同一神经重复测量三次，以确保获得最大反应值。取三次记录的平均值作为最终结果。</li>
</ol>

<ol><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28700839">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> N Engl J Med. 377 (2), 162-172 (2017).</li>
<li>Prior, R., Van Helleputte, L., Benoy, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+axonal+transport%3A+A+common+pathological+mechanism+in+inherited+and+acquired+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective axonal transport: A common pathological mechanism in inherited and acquired peripheral neuropathies.</a> Neurobiol Dis. , 300-320 (2017).</li>
<li>de Carvalho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrodiagnostic+criteria+for+diagnosis+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Electrodiagnostic criteria for diagnosis of ALS.</a> Clin Neurophysiol. 119 (3), 497-503 (2008).</li>
<li>Krajewski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+dysfunction+and+axonal+degeneration+in+Charcot-Marie-Tooth+disease+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neurological dysfunction and axonal degeneration in Charcot-Marie-Tooth disease type 1A.</a> Brain. 123 (Pt 7), 1516-1527 (2000).</li>
<li>Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+axonal+and+demyelinating+neuropathies%3A+identical+segments+recorded+from+proximal+and+distal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles.</a> Muscle Nerve. 18 (4), 402-408 (1995).</li>
<li>Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+abnormalities+in+P0-deficient+mice+resemble+human+hereditary+neuropathies+linked+to+P0+gene+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations.</a> Muscle Nerve. 19 (8), 946-952 (1996).</li>
<li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Motor+Unit+Number+Estimation+%28MUNE%29+Measuring+Compound+Muscle+Action+Potential+%28CMAP%29+in+Mouse+Hindlimb+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Motor Unit Number Estimation (MUNE) Measuring Compound Muscle Action Potential (CMAP) in Mouse Hindlimb Muscles.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Schulz, A., Walther, C., Morrison, H., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+measurements+on+mouse+sciatic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological measurements on mouse sciatic nerves.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).</li>
<li>Mitchell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+human+wild-type+FUS+causes+progressive+motor+neuron+degeneration+in+an+age-+and+dose-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of human wild-type FUS causes progressive motor neuron degeneration in an age- and dose-dependent fashion.</a> Acta Neuropathol. 125 (2), 273-288 (2013).</li>
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<li>Huxley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+varying+levels+of+PMP22+expression+and+the+degree+of+demyelination+and+reduction+in+nerve+conduction+velocity+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Correlation between varying levels of PMP22 expression and the degree of demyelination and reduction in nerve conduction velocity in transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 7 (3), 449-458 (1998).</li>
<li>Turner, B. J., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenics%2C+toxicity+and+therapeutics+in+rodent+models+of+mutant+SOD1-mediated+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS.</a> Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).</li>
<li>Manganelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+conduction+velocity+in+CMT1A%3A+what+else+can+we+tell%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Nerve conduction velocity in CMT1A: what else can we tell.</a> Eur J Neurol. 23 (10), 1566-1571 (2016).</li>
<li>Cornett, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Variability+of+Childhood+Charcot-Marie-Tooth+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Variability of Childhood Charcot-Marie-Tooth Disease.</a> JAMA Neurol. 73 (6), 645-651 (2016).</li>
<li>Jacobson, W. C., Gabel, R. H., Brand, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+vs.+fine-wire+electrode+ensemble-averaged+signals+during+gait%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electromyogr+Kinesiol%22%5BJournal%5D)">Surface vs. fine-wire electrode ensemble-averaged signals during gait.</a> J Electromyogr Kinesiol. 5 (1), 37-44 (1995).</li>
<li>Parker, V., Warman Chardon, J., Mills, J., Goldsmith, C., Bourque, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramaximal+Stimulus+Intensity+as+a+Diagnostic+Tool+in+Chronic+Demyelinating+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+J%22%5BJournal%5D)">Supramaximal Stimulus Intensity as a Diagnostic Tool in Chronic Demyelinating Neuropathy.</a> Neurosci J. 2016, 6796270(2016).</li>
<li>Benoy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Improved+HDAC6+Inhibitors+as+Pharmacological+Therapy+for+Axonal+Charcot-Marie-Tooth+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Development of Improved HDAC6 Inhibitors as Pharmacological Therapy for Axonal Charcot-Marie-Tooth Disease.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 417-428 (2017).</li>
<li>Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+caudal+tail+and+sciatic+motor+nerve+conduction+studies+in+adult+mice%3A+technical+aspects+and+normative+data%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data.</a> Muscle Nerve. 41 (6), 850-856 (2010).</li>
<li>Srivastava, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+HSPB1+overexpression+in+neurons+is+sufficient+to+cause+age-related+motor+neuronopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Mutant HSPB1 overexpression in neurons is sufficient to cause age-related motor neuronopathy in mice.</a> Neurobiol Dis. 47 (2), 163-173 (2012).</li>
<li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Biomarkers+in+Spinal+Muscular+Atrophy%3A+Preclinical+Proof+of+Concept%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Biomarkers in Spinal Muscular Atrophy: Preclinical Proof of Concept.</a> Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

敏感的记录方法对于评估神经元疾病动物模型中的疾病进展以及治疗效果至关重要。测定复合肌肉动作电位（CMAP）是一种微创性电生理技术，临床上及实验研究中常规用于评估神经肌肉和神经病变中的神经传导功能3,18。本文介绍了一种在小鼠中记录CMAP的新应用方法，用于测量前肢臂丛神经的神经传导。该方法可实现对神经退行性疾病小鼠模型中神经功能进行更灵活、更详尽的纵向评估。
针电极比环形电极具有稍高的侵入性，尤其是在纵向研究中，必须注意尽量减少对组织的损伤。该方法的一个可能缺点是穿刺神经或肌肉所导致的损伤。然而，在仔细进行皮下放置电极后，可以避免对肌肉和神经造成的损伤与破坏。与使用环形电极的方法不同，本文介绍的方法无需剃除动物体表大面积的毛发，因此不会对动物造成不适，也不会影响其体温调节功能。
电极的位置对于正确且一致地记录复合肌肉动作电位（CMAP）的波幅和潜伏期至关重要。建议重新调整电极位置，并在每个检测位点进行两到三次测量，以确认已达到最大刺激和反应。正确的记录应产生双相波形，如图2所示。为了标准化该方法，未进行神经损伤的非转基因小鼠是建立最佳且一致电极位置以实现有效刺激的最佳模型。&#160;重复使用的针状电极在定期消毒（例如，在不同动物之间使用戊二醛消毒20分钟）并检查针尖锐度的情况下，适合重复使用。
在健康的成年小鼠中，采用本方法刺激坐骨神经和臂丛神经后记录到的复合肌肉动作电位（CMAP）振幅通常为 80–100 mV。这一数值明显高于使用环形电极测得的结果，因为环形电极受皮肤阻抗较高影响，测得的振幅仅为 20–40 mV8,19,20。在肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型中，刺激瘫痪肢体的坐骨神经或臂丛神经后，CMAP 振幅下降至 10–30 mV。由于 CMAP 振幅在发育过程中逐渐增加，幼龄动物的 CMAP 振幅较小21。
本文所述方法在肌萎缩侧索硬化（ALS）的小鼠模型中尤为有用，因为在这些模型中，后肢的去神经支配及其继发的运动功能障碍比前肢更早出现13。除了检测去神经支配外，该方法还可用于检测再神经支配，其表现为复合肌肉动作电位（CMAP）振幅下降被阻止或延缓。后肢肌肉的CMAP振幅在症状出现时即已显著降低，这限制了对后续疾病进展的追踪；由于CMAP振幅在疾病早期已降至极低水平，因此在疾病进程中不再进一步下降。相比之下，前肢臂丛神经的轴突丢失进展较慢，因而更适合在较长的病程中用于评估疾病进展。此外，退化程度较轻的前肢可能是评估旨在增强轴突功能的治疗策略的更有效部位。
显然，该技术为神经肌肉疾病小鼠模型的表征提供了新的可能性。通过坐骨神经和臂丛神经的针电极记录复合肌肉动作电位（CMAP），是一种快速且可重复的方法，可用于评估后肢和前肢的轴突丢失及脱髓鞘情况。该方法具有较高的敏感性，能够在明显的运动功能障碍出现之前即检测到轴突功能缺陷，从而实现对这些缺陷的早期定量分析。此外，该技术允许对同一动物进行多次重复检测，减少了所需实验动物的数量，并可对单个动物不同部位的神经肌肉及神经病变进展提供详尽的动态观察。

电生理学被用作诊断神经肌肉疾病（如运动神经元病、神经丛病、神经病、神经肌肉接头病和肌病）的工具。在主要累及运动神经元的肌萎缩侧索硬化症（ALS）中，轴突损伤和肌肉瘫痪1会在神经传导检查（NCS）中表现为复合肌肉动作电位（CMAP）波幅降低。在夏科-马里-图斯病（CMT）中，可通过神经传导检查评估周围神经的轴突变性和脱髓鞘程度2。该技术可用于确诊疾病，也可用于评估疾病进展3,4。神经传导检查能够评估轴突病变，后者由动作电位波幅的大小推断得出5；同时也能评估脱髓鞘程度——脱髓鞘会导致传导速度减慢、远端潜伏期延长或传导阻滞6。
复合肌肉动作电位（CMAP）测量是一种快速且敏感的方法，可用于评估人和小鼠的神经传导功能。在临床患者中，通常在多个部位进行神经传导检测（NCS），以记录不同神经和肌肉的反应；而在小鼠中，CMAP测量通常仅针对坐骨神经，以评估后肢的神经功能。然而，在某些动物研究中，同时记录前肢和后肢的CMAP将具有优势，例如在肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型中，可用于追踪前肢与后肢之间疾病进展的差异。
本文介绍了一种使用针状电极记录小鼠前肢复合肌肉动作电位（CMAP）的方法。此外，我们还提供了一种同样采用针状电极记录后肢CMAP&#160;的方法。既往已有研究采用环形电极记录后肢CMAP7,8。使用针状电极记录CMAP是一种快速的测量方法，无需剃除动物毛发，且对于有经验的研究人员而言，每只动物前后肢的测量过程仅需10分钟。此外，这种微创方法适用于重复测量，可实现对动物多个神经的长期纵向随访。

<table><tbody><tr><td>可重复使用的皮下针电极，铂/铱合金</td><td>Technomed</td><td>TE/S61-434</td><td>针长13 mm（0.51&quot;），直径0.4 mm（27G）</td></tr><tr><td>Natus神经电生理诊断系统</td><td>Natus Neurology</td><td>UltraPro S100</td><td>肌电图设备</td></tr><tr><td>Synergy</td><td>Natus Neurology</td><td>版本 20.1.0.100</td><td>UltraPro S100配套肌电图软件</td></tr><tr><td>Physitem Controller</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td>加热垫</td></tr><tr><td>combi-vet 基础麻醉系统 数字流量计 配备TEC 3蒸发器</td><td>Rothacher &amp;amp; Partner</td><td>CV 30-301-D</td><td>异氟烷蒸发器及流量计</td></tr><tr><td>Iso-Vet 1000 mg/g&amp;nbsp;</td><td>Piramal Healthcare UK Limited</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td>异氟烷</td></tr><tr><td>SOD1-G93A小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#002726</td><td>肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠及非转基因对照同窝小鼠，仅雌性</td></tr><tr><td>PrP-hFUS-WT3小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#017916&amp;nbsp;</td><td>肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠及非转基因对照同窝小鼠，各组雄性和雌性比例均衡</td></tr><tr><td>C57BL/6Jax小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>用于轴突切断实验的非转基因小鼠，包含雄性和雌性</td></tr><tr><td>C61-PMP22小鼠</td><td>该小鼠品系由德国哥廷根马克斯·普朗克实验医学研究所M. Sereda教授慷慨赠送&amp;nbsp;&amp;ouml;</td><td></td><td>腓骨肌萎缩症转基因小鼠及非转基因对照同窝小鼠，各组雄性和雌性比例均衡</td></tr></tbody></table>

体内电生理记录小鼠运动神经元变性模型前肢复合肌肉动作电位

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

评估神经轴突的功能可为神经肌肉疾病的进展提供详细信息。电生理记录是一种灵敏的方法，可用于测量人类和啮齿类动物模型中的神经传导。为了拓展小鼠肌电图的技术可能性，本文介绍了使用针电极从前肢臂丛神经记录复合肌肉动作电位（CMAP）的方法。此前已有报道通过刺激后肢坐骨神经来记录CMAP。本研究新引入的方法可在另一个解剖位点评估神经传导功能，从而更全面地了解神经肌肉系统的功能状态。该技术可提供有关功能性轴突的相对数量以及髓鞘化水平的信息，因此既可用于评估轴突性疾病，也可用于评估脱髓鞘性疾病。该方法具有微创性，无需摘除神经，因此适用于同一只动物的多次重复测量，便于进行纵向随访。临床上也采用类似的记录方法，突显了该技术的转化应用价值。

使用针电极进行复合肌肉动作电位（CMAP）的电生理学测量是一种微创且高度敏感的方法，可用于长期监测神经肌肉功能。本文所述技术可用于评估小鼠前肢神经的传导功能，从而深入了解神经的功能状态。
在两种肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型 SOD1-G93A9 和 PrP-hFUS-WT310（图3）以及一种腓骨肌萎缩症（CMT）小鼠模型 C61-PMP2211,12（图4）中，于疾病进程中测量了后肢和前肢的复合肌肉动作电位（CMAP）波幅和潜伏期。ALS 小鼠模型通过过表达与 ALS 相关的人源基因构建，分别为突变型 SOD1 或野生型 FUS。在这两种模型中，小鼠均出现类似于进行性运动神经元变性的 ALS 表型，最终导致瘫痪。在非转基因同窝对照小鼠中，后肢和前肢的 CMAP 波幅随时间未发生明显变化（图3A）。相比之下，SOD1-G93A 小鼠后肢坐骨神经的 CMAP 波幅在症状出现前（约60日龄时）已显著降低（而首次运动症状通常出现在三个月龄左右）13。在该年龄点，非转基因（non-tg）同窝小鼠的波幅为 90 mV，而 SOD1-G93A 小鼠仅为 30 mV。随着疾病进展至150日龄的晚期症状阶段，波幅仅出现轻微进一步下降。与后肢坐骨神经相比，前肢臂丛神经的 CMAP 波幅下降以及轴突变性出现较晚。在前肢中，疾病进展更为明显：在这些小鼠出现运动功能障碍前后进行测量时，CMAP 波幅从 70 mV 下降至 30 mV。
在ALS的PrP-hFUS-WT3小鼠模型中，运动功能障碍的发病时间大约始于28日龄10，这与复合肌肉动作电位（CMAP）振幅下降的起始时间相一致。该模型疾病进展较快，小鼠大约在65日龄时达到终末期。与前肢臂丛神经相比，后肢坐骨神经的CMAP振幅下降更为迅速，表明后肢的轴突变性发生得更早（图3D）。这一观察结果支持了在这两种小鼠模型中的临床现象，即后肢明显早于前肢出现瘫痪，而前肢功能可维持至疾病晚期。
总体而言，前肢从刺激到动作电位起始的潜伏期比后肢更短（图3B、E）。这仅仅是由于刺激电极与记录电极之间的距离较短所致。潜伏期可反映轴突的髓鞘化水平。我们观察到，在肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型的疾病进展过程中，复合肌肉动作电位（CMAP）的潜伏期延长，尽管ALS并非脱髓鞘疾病。这最可能是由于较大且传导速度较快的运动轴突发生丢失所致。
表达3-4个拷贝人PMP22的C61-PMP22小鼠及其杂合子小鼠可重现一种非常轻微的CMT1A疾病表型，表现为轻度脱髓鞘和复合肌肉动作电位（CMAPs）降低，但无可见表型11,12在1.5至2岁的C61-PMP22小鼠中，后肢和前肢的复合肌肉动作电位（CMAP）波幅均降低，潜伏期延长图4）。与健康受试者的记录相比，代表性记录显示出振幅降低和反应延迟，如下所示 图2C，B，分别。前肢的复合肌肉动作电位（CMAP）潜伏期受影响程度较轻，而后肢则更为明显。这一现象与CMT1A患者的表现一致，由于腓骨肌萎缩症（CMT）是一种具有长度依赖性特征的疾病，患者下肢的CMAP常显著降低甚至无法检测。14此外，疾病严重程度与CMAP波幅相关，而非潜伏期或传导速度，因为波幅与轴突完整性程度相关。14,15然而，结果表明该方法对检测脱髓鞘过程（如在CMT1A中观察到的）具有足够的敏感性。
非转基因组的波幅和潜伏期变异最小（变异系数分别为2-15%和1-13%）。在所有转基因情况下，测量值的变异程度更高（波幅的变异系数为8-51%，潜伏期为1-21%），这很可能归因于动物之间疾病进展的差异。在所有情况下，后肢与前肢的变异程度相似。已有报道指出，针电极与表面电极使用时的变异程度相似16。
所需刺激强度在非转基因模型与ALS模型之间差异不大（图3C，F）。同样，在这些情况下，前肢和后肢达到超最大刺激所需的刺激强度相似，介于5-12 mA之间。在腓骨肌萎缩症（CMT）中，刺激强度需要增加的现象已被认识17 且在 C61-PMP22 小鼠中也观察到相同的表型（图 4C）。这一现象可归因于肥厚性神经内膜改变导致的电阻力增加17.
为了确认从前肢记录到的复合肌肉动作电位（CMAP）是由神经刺激引起而非肌肉直接刺激所致，我们在5月龄的非转基因C57BL/6Jax小鼠（雄性和雌性）中进行了单侧臂丛神经部分横断术（图5）。神经横断术后，CMAP波幅从90 mV降低至20 mV，表明手术中大部分轴突已被切断。而在对侧前肢或后肢中，波幅未见变化。该结果有力地表明，在肱二头肌中检测到的反应源于神经刺激，而非肌肉直接刺激所致。
<img alt="振幅、潜伏期、刺激强度与年龄关系；图表；随时间推移的神经生理反应研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. ALS小鼠模型后肢与前肢在疾病进程中CMAP振幅、潜伏期及所需刺激强度的变化。 对SOD1-G93A（A-C）和PrP-hFUS-WT3（D-F）转基因（tg）小鼠及其非转基因（non-tg）同窝小鼠，在运动症状出现时、症状期及疾病晚期（分别为57天、91天和147天，或SOD1-G93A与PrP-hFUS-WT3小鼠分别为29天、38天和53天）进行检测。黑色：非转基因后肢，黑色虚线：非转基因前肢，灰色：转基因后肢，灰色虚线：转基因前肢。结果以均值±标准差表示。在非转基因动物中，无论后肢还是前肢，振幅（A、D）随时间保持稳定；而在转基因动物中，振幅随疾病进展而下降。潜伏期（B、E）受疾病影响较小，但无论基因型如何，后肢与前肢之间均存在显著差异。所需刺激强度（C、F）在所有组别中变化均较小。SOD1-G93A组各时间点n=4，仅tg 147 d组n=3；PrP-hFUS-WT3组在29、38和53天龄组中，non-tg组n分别为4、5、4，tg组n分别为7、5、3。符号表示组间差异：*：non-tg后肢 vs. tg后肢，#：non-tg前肢 vs. tg前肢，¤：non-tg后肢 vs. non-tg前肢，灰色*：tg后肢 vs. tg前肢。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验，*：p &lt; 0.05，**：p &lt; 0.01，***：p &lt; 0.001，****：p &lt; 0.0001；#：p &lt; 0.05，##：p &lt; 0.01，###：p &lt; 0.001，####：p &lt; 0.0001；¤：p &lt; 0.05，¤¤：p &lt; 0.01，¤¤¤：p &lt; 0.001，¤¤¤¤：p &lt; 0.0001。<a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示肢体神经信号波幅、潜伏期和刺激强度的电生理学结果图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. CMT1A 小鼠后肢与前肢的复合肌肉动作电位（CMAP）波幅、潜伏期及所需刺激强度。 在1.5至2岁龄时，对C61-PMP22转基因（tg）小鼠及其非转基因（non-tg）同窝小鼠进行检测。转基因小鼠的后肢和前肢波幅（A）均降低。CMT小鼠所有肢体的潜伏期（B）均延长，且该检测方法可发现前肢的细微变化。C61-PMP22小鼠对刺激强度的需求（C）增加，此现象与CMT1A患者中观察到的表型相似。结果以均值±标准差表示，non-tg组N = 4，tg组N = 3。双因素方差分析（Two-way ANOVA）结合Sidak多重比较检验，**：p &lt; 0.01，****：p &lt; 0.0001。<a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="横断效应：图A显示波幅变化（mV），图B显示潜伏期变化（ms）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5. 前肢动作电位由神经刺激引起。 为排除所观察到的复合肌肉动作电位（CMAP）反应是由肌肉直接刺激所致的可能性，对臂丛神经进行了（部分）横断（axotomy）。在成年非转基因小鼠中，分别于臂丛神经横断前（pre）和横断后4天（post）记录CMAP波幅（A）和潜伏期（B）。神经横断后CMAP波幅显著降低，表明该反应源于神经刺激。黑色：后肢；灰色：对侧前肢；灰虚线：同侧前肢。结果以均值±标准差表示，N = 2。<a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看该图的放大版本。</a>

神经传导测量是评估神经退行性疾病小鼠模型的有用工具，但通常仅用于刺激后肢坐骨神经。本文介绍了一种测量复合肌肉动作电位（CMAP）的技术 体内 在由臂丛神经支配的小鼠前肢肌肉中。

评估神经轴突的功能可为神经肌肉疾病的进展提供详细信息。电生理记录……

利用该方法，我们可以评估神经退行性疾病小鼠模型外周神经中轴突的变性以及脱髓鞘情况。该技术的主要优势在于，这种微创方法可进行重复测量，且无需在同一只动物中对多条神经进行后续跟踪。该方法的高灵敏度能够在出现明显功能缺陷之前，早期检测到神经调节过程中的轴突丢失，从而实现对这些缺陷的早期发现。开始此操作时，通过吸入异氟烷氧气对小鼠进行麻醉。通过轻压后肢足垫以确认疼痛退缩反射消失，从而判断麻醉是否充分。然后将鼻罩置于动物面部以维持麻醉状态。确保鼻锥不阻塞气道，且动物呼吸平稳。接下来，使用恒温加热板将动物体温维持在37摄氏度。为测量后肢的复合肌肉动作电位（CMAP），将小鼠置于俯卧位。伸展后肢，使用胶带将足部固定在工作台面上。然后将27号刺激电极的前端5毫米分别皮下植入坐骨神经结两侧，电极间距为2厘米，注意避免刺穿深层肌肉组织。同样，将记录电极皮下植入腓肠肌上方，并与之平行放置。随后，将参考电极以30度角皮下植入跟腱附近，使针头有2至5毫米保留在皮肤下。以与刺激电极类似的方式，将接地电极皮下植入小鼠体侧。为测量前肢的复合肌肉动作电位（CMAP），将小鼠仰卧置于头部垫上，并使用胶带将两侧前肢向外伸展固定于身体两侧。接着，将刺激电极的前端5毫米置于前肢两侧皮下，注意不要刺破深层肌肉，使其与臂丛神经对齐。然后，将记录电极置于肱二头肌上方皮下。随后，将参考电极以30度角插入足垫皮下3毫米处，并将接地电极插入小鼠侧身皮下。在此设置中，电极彼此靠近。防止电极相互接触，因为这会扭曲记录结果。使用每秒一个脉冲、持续时间为0.1毫秒的刺激来刺激所有轴突。为获取数据，首先按下控制器单元上的重复刺激按钮以开始刺激，然后转动强度控制旋钮以增加刺激强度。为达到超最大刺激，需逐步增加刺激强度，持续转动强度控制旋钮，直至复合肌肉动作电位（CMAP）反应的幅度不再增加。在此基础上，再将刺激强度提高20%，以确保CMAP幅度已达到最大反应水平。再次按下重复刺激按钮以结束刺激。使用标记工具在记录中标识以下时间点：反应起始点、最大正向峰值和最大负向峰值。刺激的启动由软件自动确定。将潜伏期定义为从刺激开始到反应开始之间的延迟时间。利用潜伏期评估轴突的脱髓鞘情况。从最大负峰到最大正峰测量波幅，并利用波幅的大小来关联功能性轴突的数量。由于电极的精确放置位置可能影响记录结果的数值，因此需更换电极，使用超强刺激对同一条神经重复测量三次，以确保获得最大反应。取三次记录的平均值。测量完成后，移除所有电极，将小鼠留在加热板上或红外灯下恢复约两到五分钟，直至其意识充分恢复。在小鼠完全从麻醉中恢复之前，不得将其单独留下或与其他小鼠放在一起。C61 PMP22 小鼠过表达三到四份人类 PMP22 基因，其杂合子小鼠表现出非常轻微的 CMT1A 疾病表型，具有轻度脱髓鞘和降低的复合肌肉动作电位（CMAPs），但无明显可见的表型。在1.5至2岁的C61 PMP22转基因小鼠中，后肢和前肢的CMAP波幅均降低，潜伏期均延长。转基因小鼠的后肢和前肢波幅均下降，CMT转基因小鼠所有肢体的潜伏期均延长，甚至通过该检测方法可发现前肢的细微变化。C61 PMP22小鼠对刺激强度的要求增加，这一表现与CMT1A患者中观察到的表型相似。掌握后，若操作得当，可在15分钟内完成小鼠后肢和前肢的CMAP记录。本技术为表征神经退行性疾病小鼠模型（如肌萎缩侧索硬化症和夏科-马里-图斯病）提供了新的可能性。评估神经轴突的功能可提供关于神经肌肉疾病进展的详细信息。类似的记录在临床环境中被使用，强调了该方法的转化潜力。

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