利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人类疟原虫P. falciparum的条件性突变体

该方法可通过条件性敲低技术揭示蛋白质功能，从而帮助解答人类疟原虫（P. Falciparum）生物学中的关键问题。该技术的主要优势在于，与以往方法相比，能够相对容易地构建条件性突变体。实验开始时，进入 Chop Chop 网站，选择“Fasta Target”选项。在“Target”下，粘贴目的基因开放阅读框（ORF）3'端的200个碱基对，以及该基因3'非翻译区（UTR）起始段的200个碱基对。

在“选择 P. falciparum”下进行选择，并在“使用”下选择“CRISPR/Cas9”。接下来，点击“查找靶位点”。从提供的选项中选择一条gRNA序列，优先选择最靠近修饰位点且脱靶位点最少的高效gRNA。将选定的gRNA序列及其反向互补序列作为聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的寡核苷酸进行订购。用于靶向PfH-sp70x的gRNA序列可在文本方案中找到。

向一个无菌的1.5毫升离心管中加入40微克的pMK-U6、pUF1-Cas9和pHA-glmS DNA。向管中加入相当于DNA体积十分之一的3摩尔/升乙酸钠水溶液，并用涡旋振荡器充分混匀。然后，向管中加入2.5倍体积的100%乙醇，并用涡旋振荡器充分混匀至少30秒。

将离心管置于冰上或负20摄氏度环境中30分钟。随后，在4摄氏度条件下，以18,300 ×g离心30分钟。离心结束后，小心移除上清液，注意不要扰动沉淀。

向离心管中加入三倍体积的70%乙醇，使用涡旋振荡器短暂混匀。在4°C条件下，以18,300 ×g离心30分钟。再次小心地移除上清液，注意不要扰动沉淀。

将离心管保持敞开状态，使沉淀在空气中干燥15分钟。将沉淀的DNA储存于-20摄氏度，直至转染时使用。为转染红细胞，需按照文本方案中所述配制1X细胞素混合缓冲液（cytomix buffer）以及不完全和完全RPMI培养基。

使用0.22微米滤器对缓冲液进行过滤除菌。向DNA中加入380微升1X细胞素混合液（1X cytomix），涡旋振荡以溶解。将DNA在1X细胞素混合液中溶解10分钟，每隔3分钟涡旋振荡10秒。

在无菌的15毫升锥形管中，将300微升用不完全RPMI悬浮的分离人红细胞与4毫升1倍细胞素混合液（1X cytomix）混合。以870 × g离心红细胞3分钟，然后弃去红细胞沉淀上的上清液。

将红细胞沉淀用DNA-cytomix混合液重悬，并转移至0.2厘米电穿孔比色皿中。根据文本方案中列出的条件对红细胞进行电穿孔。电穿孔后，将比色皿中的内容物转移至含有5毫升完全RPMI培养基的15毫升锥形管中。

在20摄氏度下，以870 × g离心试管3分钟。然后，倒出上清液。接着，将沉淀重悬于4毫升完全RPMI培养基中，并转移至六孔组织培养板中的一个孔内。

向已转移的红细胞中加入 400 µL 高裂殖子培养物。将所有培养物置于 37 °C、3% 氧气、3% CO2 和 94% 氮气的环境中培养。次日，用 4 mL 完全 RPMI 培养基洗涤培养物。

以870 × g离心培养物3分钟。吸除上清液。用4毫升完全RPMI培养基重悬培养物。

48小时后，用4毫升完全RPMI培养基洗涤培养物。然后，将培养物重悬于含有1微摩尔DSM1的完全RPMI培养基中，以筛选Cas9质粒。此后，每隔48小时用新鲜的完全RPMI培养基加1微摩尔DSM1更换培养基。

每天继续用完全RPMI培养基洗涤培养物，直至血涂片中不再可见寄生虫。制备血涂片时，将150 µL培养物移入0.6 mL离心管中。在1,700 ×g条件下离心30秒使细胞沉淀后，吸除上清液。

使用移液器将沉淀的细胞转移至载玻片上。用另一张载玻片以45度角紧贴第一张载玻片，将血滴推成涂片。根据生产商说明书，使用市售染色试剂盒对涂片进行染色。

使用100倍油镜观察寄生虫。转染后第五天开始，取出含有重新悬浮红细胞的2毫升培养物，然后补充2毫升新鲜培养基和血细胞，使血细胞比容达到2%。

以该方式每周添加一次新鲜血液，直至通过薄血涂片检测确定寄生虫重新出现。对寄生虫培养物进行连续稀释，以获得每 200 µL 含 0.5 个寄生虫的终浓度。将 200 µL 稀释后的培养物加入 96 孔组织培养板的孔中。

持续培养克隆板，直至在孔中可检测到寄生虫。每48小时，用新鲜培养基更换96孔板中的培养基。从开始培养克隆板的第五天起，每周一次，从每个孔中移除100微升培养基，并补充100微升新鲜培养基和血液。

为了确定哪些孔中含有寄生虫，将96孔板倾斜约45度角放置约20分钟，使血液在板内以倾斜角度沉降。随后将96孔板置于光源板上观察。可见含有寄生虫的孔中培养基呈黄色，而无寄生虫的孔中培养基为粉红色，这是由于寄生虫代谢导致培养基酸化所致。

使用血清学移液管将含有寄生虫的孔中内容物转移至24孔组织培养板，以扩增寄生虫血症。通过PCR分析，检测这些克隆寄生虫株是否发生正确的整合。此处展示了免疫荧光分析的结果，证明PfH-sp70x成功进行了HA标签标记。

对PfH-sp70x glmS寄生虫进行固定，并使用DAPI染色以标记细胞核，同时使用HA抗体以及针对膜相关组氨酸富集蛋白1（HRPI）的抗体，后者是蛋白质向宿主红细胞输出的标志物。此处显示的是经葡萄糖胺处理后PfH-sp70x蛋白水平的Western印迹分析结果。正如预期，随着处理时间的延长，该蛋白水平逐渐下降。

该技术为寄生虫学领域的研究人员探索疟原虫生物学中的基本问题铺平了道路。需要注意的是，P. Falciparum 是一种血液传播病原体，在进行此操作时应穿戴适当的个人防护装备。