Name: CRISPR/Cas9 基因编辑制作人类疟疾寄生虫的条件突变体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学习使用CRISPR/Cas9基因编辑技术在恶性疟原虫中构建glmS条件性敲低突变体的方法。该技术可高效调控蛋白功能，为疟疾生物学研究及抗疟治疗策略开发提供重要工具。

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感谢佐治亚大学（UGA）生物医学显微成像中心的 Muthugapatti Kandasamy 提供的技术支持，以及 Jose-Juan Lopez-Rubio 分享 pUF1-Cas9 和 pL6 质粒。本研究得到了 ARCS 基金会授予 D.W.C. 和 H.M.K. 的奖项、UGA 启动资金、美国出生缺陷基金会（Basil O'Connor 新兴学者研究奖）授予 V.M. 的资助，以及美国国立卫生研究院（NIH）授予 V.M. 的基金（R00AI099156 和 R01AI130139）和授予 H.M.K. 的基金（T32AI060546）的支持。

持续培养P. falciparum需要使用人红细胞，我们使用的是从商业渠道购买的、已去除所有标识信息并匿名化的血液单位。乔治亚大学机构审查委员会及生物安全办公室已审核并批准了我们实验室所使用的所有实验方案。
1. 选择gRNA序列
<ol>
	<li>前往 CHOPCHOP（http://chopchop.cbu.uib.no/），选择 “Fasta Target”。在 “Target” 下方，粘贴基因开放阅读框（ORF）3’端的 200 个碱基对以及该基因 3’非翻译区（3’-UTR）起始处的 200 个碱基对。在 “In” 下拉菜单中选择 “P. falciparum”（3D7 v3.0），并在 “Using” 下选择 “CRISPR/Cas9”，然后点击 “Find Target Sites”。</li>
	<li>从提供的选项中选择一条 gRNA 序列，优先选择最靠近修饰位点、脱靶位点最少且效率最高的 gRNA。 
	注意：潜在的 gRNA 序列之所以被识别，是因为它们位于原间隔序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motif, PAM）的紧上游，而 PAM 是 Cas9 结合 DNA 所必需的。克隆到 pMK-U6 载体（驱动 gRNA 表达的载体）中的序列是 PAM 紧上游的 20 个碱基。化脓性链球菌（S. pyogenes）Cas9 所对应的 PAM 序列为 NGG，该序列不应包含在克隆至 pMK-U6 的序列中。 
	注意：CHOPCHOP 会对 gRNA 序列进行可视化排序，最佳选项以绿色显示，次优选项以琥珀色显示，最差选项以红色显示。CHOPCHOP 使用文献中最新参数计算每条 gRNA 序列的效率评分，并预测可能被该 gRNA 识别的脱靶位点。针对特定基因，可能需要尝试两到三条 gRNA 序列，以确定最适合的 gRNA。</li>
	<li>将选定的 gRNA 序列及其反向互补序列作为聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis）纯化的寡核苷酸进行合成。用于靶向 PfHSP70x 的 gRNA 序列见 图 1B。 
	注意：该寡核苷酸应包含 15 个碱基对，与 gRNA 表达质粒同源，这是通过序列和连接无关克隆法（SLIC）将片段克隆至 pMK-U6 载体所必需的16。</li>
</ol>
2. 将gRNA序列克隆至pMK-U6载体
<ol>
	<li>用 BtgZI 酶切 pMK-U6 质粒。
	<ol>
		<li>在 60 °C 条件下，使用 5 μL BtgZI 酶（5,000 单位/mL）对 10 μg pMK-U6 进行 3 小时的酶切反应。反应条件请遵循酶生产商提供的操作说明。</li>
		<li>3 小时孵育结束后，向反应体系中再加入 3 μL BtgZI 酶，以确保质粒完全酶切。继续按照生产商的说明，在相同反应条件下额外孵育 3 小时。</li>
		<li>使用基于离心柱的 PCR 产物纯化试剂盒，按照生产商说明书从反应体系中纯化已酶切的 pMK-U6。</li>
		<li>采用 0.7% 琼脂糖凝胶分离酶切后的 DNA，并切胶回收大小为 4,200 个碱基对的条带。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>退火含有 gRNA 序列的寡核苷酸。
	<ol>
		<li>使用无核酸酶水将经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的寡核苷酸重新溶解至浓度为 100 μM。</li>
		<li>取每种寡核苷酸各 10 μL，加入 2.2 μL 10x 缓冲液 2（参见材料表），确保总体积为 22.2 μL。</li>
		<li>在热循环仪中运行 gRNA 退火程序：步骤 1：95 °C，10 分钟；步骤 2：95 °C，1 秒，每个循环降温 0.6 °C；步骤 3：返回步骤 2，重复 16 次；步骤 4：85 °C，1 分钟；步骤 5：85 °C，1 秒，每个循环降温 0.6 °C；步骤 6：返回步骤 5，重复 16 次；步骤 7：75 °C，1 分钟；步骤 8：75 °C，1 秒，每个循环降温 0.6 °C；步骤 9：返回步骤 8，重复 16 次；步骤 10 至 21：重复步骤 4–9 的程序，直至温度降至 25 °C；步骤 22：25 °C，1 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将退火后的 gRNA 寡核苷酸插入经 BtgZI 酶切并经凝胶纯化的 pMK-U6 质粒中。
	<ol>
		<li>将 100 ng 酶切后的 pMK-U6 与 1 μL 10x 缓冲液 2.1 以及 3 μL 退火后的 gRNA 寡核苷酸混合。用无核酸酶水将总体积补至 9.5 μL。</li>
		<li>加入 0.5 μL T4 DNA 聚合酶，在室温下孵育反应体系 2.5 分钟。</li>
		<li>将反应体系转移至冰上，继续孵育 10 分钟。</li>
		<li>立即取 5 μL 反应产物，按照细菌供应商提供的说明转化至感受态 E. coli 中。将菌液涂布于含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上。</li>
		<li>将转化后的细菌在 37 °C 培养过夜，随后挑取单克隆菌落，并使用市售质粒小提试剂盒提取质粒 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 设计修复模板的同源区域
<ol>
	<li>在同源修复模板中设计屏蔽突变，以防止整合到基因组中的DNA被再次切割。 
	注意：屏蔽突变通常通过引入同义突变来改变PAM序列，从而使Cas9不会在修复模板上诱导断裂。本实验方案中使用的Cas9所需的PAM序列为“NGG”，其中“N”代表任意核苷酸。如果可能，将其中一个G核苷酸替换为A、C或T。
	<ol>
		<li>如果无法通过同义突变改变PAM序列，则至少在紧邻PAM的6个碱基对中引入2个同义突变7,8。 
		注意：这些突变将阻止gRNA识别修复模板，并防止Cas9/gRNA复合物对已修复位点进行再次切割。可通过使用含有突变序列的引物扩增DNA，将屏蔽突变引入同源区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增修复模板的ORF同源区域。
	<ol>
		<li>通过PCR扩增目标基因ORF的3’端800个碱基对。设计引物时应确保该扩增子不包含终止密码子。</li>
		<li>设计引物以便将此扩增子插入已用SacII和AfeI酶切的pHA-glmS载体中，可通过DNA连接反应或SLIC16方法实现。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增修复模板的3’-UTR同源区域。
	<ol>
		<li>通过PCR扩增目标基因终止密码子后紧随的800个碱基对。设计引物以便将此扩增子插入已用HindIII和NheI酶切的pHA-glmS载体中，可通过DNA连接反应或SLIC16方法实现。 
		注意：P. falciparum基因组的高AT含量可能导致UTR等区域的扩增困难。除PCR外，另一种可选方法是直接合成同源区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将同源区域克隆至修复质粒
<ol>
	<li>将ORF同源区域插入pHA-glmS中。
	<ol>
		<li>根据酶制造商的说明，用SacII和AfeI酶切pHA-glmS。使用SLIC16将ORF同源区域的PCR产物插入酶切后的质粒中。</li>
		<li>按照步骤2.3.4和2.3.5的方法转化至感受态E. coli中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将3’-UTR同源区域插入已含有ORF同源区域的pHA-glmS质粒中（见步骤4.1）。
	<ol>
		<li>根据酶制造商的说明，用HindIII和NheI酶切质粒。使用SLIC16将3’-UTR同源区域的扩增产物插入酶切后的质粒中。</li>
		<li>转化至感受态E. coli中，并提取质粒DNA（步骤2.3.4和2.3.5）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 转染用 DNA 的沉淀
<ol>
	<li>加入 pMK-U6、pUF1-Cas9 和 pHA- 各 40 μgglmS 将DNA（总共120 μg DNA）加入无菌的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>向管中加入与DNA体积1/10等量的溶于水的3 M醋酸钠（pH 5.2），并使用涡旋振荡器充分混匀例如， 如果步骤5.1中的体积为100 μL，则加入10 μL乙酸钠。</li>
	<li>向离心管中加入2.5倍体积的100%乙醇，使用涡旋振荡器充分混匀，时间不少于30秒（例如， 如果5.1步骤中的体积为100 μL，则加入250 μL的100%乙醇。</li>
	<li>将试管置于冰上或 -20 °C 下 30 分钟。</li>
	<li>将离心管在18,300 x g 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>小心地从管中移除上清液，切勿扰动沉淀。</li>
	<li>向管中加入3倍体积的70%乙醇，使用涡旋振荡器短暂混匀例如，如果5.1中的体积为100 μL，则加入300 μL的70%乙醇。</li>
	<li>以 18,300 x g 离心试管 g 4 °C 下孵育 30 分钟。 
	注意：此步骤应在生物安全柜内的无菌条件下进行。</li>
	<li>小心地从离心管中移除上清液，切勿扰动沉淀。将离心管保持开口状态，使沉淀在空气中干燥15分钟。</li>
	<li>将沉淀的DNA储存于-20 °C，直至转染时使用。</li>
</ol>
6. 转染前从全血中分离人红细胞
<ol>
	<li>将新鲜血液分装至无菌的50 mL锥形管中（每管约25 mL）。</li>
	<li>以1,088 × g 离心12分钟，离心机刹车设置为4。</li>
	<li>吸除上清液和白膜层。用等体积的不完全RPMI重悬红细胞沉淀。 
	注意：不完全RPMI的配制方法为在RPMI 1640培养基中添加10.32 μM胸腺嘧啶、110.2 μM次黄嘌呤、1 mM丙酮酸钠、30 mM碳酸氢钠、5 mM HEPES、11.1 mM葡萄糖以及0.02%（v/v）庆大霉素。</li>
	<li>重复步骤6.2–6.3两次。最后一次洗涤后，用等体积的不完全RPMI重悬红细胞，并将管子置于4 °C保存。</li>
</ol>
7. 使用CRISPR/Cas9质粒转染红细胞（需无菌操作）
注意：P. falciparum 培养物的维持方法如其他文献所述17。除非另有说明，所有培养物均应在 37 °C、3% O2、3% CO2 和 94% N2 条件下培养。本方案中所提及的血液均指步骤 6 中制备的纯红细胞。所用血液储存时间不应超过 6 周，因为较陈旧的血液通常会导致寄生虫增殖能力下降。以下步骤描述了将 DNA 预加载至红细胞，以及将寄生虫培养物加入转染细胞的过程。其他已建立的转染方案也可用于转染这些构建体18,19。
<ol>
	<li>用水配制1x细胞素混合缓冲液（120 mM KCl，0.15 mM CaCl2，2 mM EGTA，5 mM MgCl2，10 mM K2HPO4，25 mM HEPES，pH 7.6）。使用0.22 μm滤器过滤除菌。</li>
	<li>向第5步中沉淀的DNA中加入380 μL的1x细胞素混合缓冲液，涡旋溶解。让DNA在1x细胞素混合缓冲液中溶解10分钟，每3分钟涡旋10秒。</li>
	<li>在无菌的15 mL锥形管中，将300 μL红细胞（50% hematocrit，来自第6步）与4 mL的1x细胞素混合缓冲液在不完全RPMI培养基中混合。</li>
	<li>将第7.3步中的红细胞以870 × g离心3分钟，然后弃去上清液。</li>
	<li>用第6.2步中的DNA/细胞素混合液重悬红细胞沉淀，并转移至0.2 cm电穿孔比色皿中。</li>
	<li>采用以下条件对红细胞进行电穿孔：0.32 kV，925 μF，电容设置为“High Cap”，电阻设置为“Infinite”。</li>
	<li>电穿孔后，将比色皿中的内容物转移至含有5 mL完全RPMI（cRPMI）的15 mL锥形管中。在20 °C下以870 × g离心3分钟，然后倾去上清液。 
	注：cRPMI的制备方法与不完全RPMI相同，但额外添加0.25%（w/v）富含脂质的牛血清白蛋白。</li>
	<li>将沉淀重悬于4 mL cRPMI中，并转移至6孔组织培养板中的一个孔。向转染后的红细胞中加入400 μL高裂殖体培养物（理想裂殖体寄生率在7–10%）。 
	注：寄生率定义为被寄生虫感染的红细胞所占的百分比。</li>
	<li>次日，用4 mL cRPMI洗涤培养物。以870 × g离心3分钟，吸除上清液，再用4 mL cRPMI重悬培养物。</li>
	<li>完成第7.6步后48小时，用4 mL cRPMI洗涤培养物。然后将培养物重悬于含有1 μM DSM1的cRPMI中，以筛选Cas9质粒。</li>
	<li>每天继续用cRPMI洗涤培养物，直至血涂片中不再可见寄生虫。此后，每48小时更换一次新鲜cRPMI并添加1 μM DSM1。
	<ol>
		<li>制作血涂片时，将150 μL培养物移入0.6 mL离心管中。以1,700 × g离心30秒，沉淀细胞。</li>
		<li>吸除上清液。用移液器将沉淀的细胞转移至载玻片上。用另一张载玻片以45°角紧贴第一张载玻片，将血滴推成涂片。根据制造商说明书，使用市售染色试剂盒对涂片进行染色。</li>
		<li>使用100倍油镜观察寄生虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后第5天起（第7.6步），取出2 mL含有重悬红细胞的培养物。补加2 mL新鲜培养基（cRPMI加1 μM DSM1）和2% hematocrit的血液。此后每周以该方式补充新鲜血液，直至通过薄血涂片（第7.11步）检测到寄生虫重新出现。 
	注：若整合成功，寄生虫通常在转染后一个月内重新出现在培养物中。</li>
	<li>一旦寄生虫重新出现，即可停止DSM1药物压力。或者，在寄生虫被克隆分离后，也可停止药物压力。</li>
</ol>
8. 检测寄生虫中修复模板的整合情况
<ol>
	<li>当薄血涂片再次可见寄生虫时，使用适当的试剂盒从培养物中分离DNA。</li>
	<li>使用PCR扩增基因组的修饰区域，以确定靶向位点是否已成功改变，并检测是否存在未修饰的野生型位点（提示存在野生型寄生虫）。
	<ol>
		<li>为检测已整合修复模板的寄生虫，使用位于ORF起始处、克隆同源区域之外的正向引物，以及位于3’-UTR内的反向引物。 
		注：由于该扩增包含HA标签和glmS核酶的序列，因此来自整合型寄生虫的扩增子将比野生型寄生虫中同一区域扩增出的片段更长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 通过有限稀释法克隆寄生虫
<ol>
	<li>将步骤 7.13 中的寄生虫培养物进行系列稀释，以达到每 200 μL 含 0.5 个寄生虫的终浓度。将 200 μL 稀释后的培养物加入 96 孔组织培养板的孔中。 
	注意：由于寄生虫血症率定义为被感染红细胞的百分比，且红细胞压积也为已知数值（2%），因此可轻易推算出单位体积内的寄生虫数量。
	<ol>
		<li>在 cRPMI 培养基中制备 1 mL 寄生虫培养物，寄生虫血症率为 5%，红细胞压积为 2%（在此寄生虫血症率和红细胞压积水平下，培养物中含有 1 × 107 个寄生虫/mL）。</li>
		<li>用 cRPMI 将该培养物稀释 1:100。再用 cRPMI 进一步稀释 1:100。</li>
		<li>进行 1:400 稀释。通过将 62.5 μL 培养物加入 25 mL cRPMI 和 1 mL 血液中完成此稀释。该稀释可得到所需的 0.5 个寄生虫/200 μL 浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>维持克隆板培养，直至在孔中可检测到寄生虫。
	<ol>
		<li>每 48 小时，用新鲜培养基更换 96 孔板中的培养液。</li>
		<li>从开始克隆板培养后第 5 天起（步骤 9.1），每周一次，从每个孔中移除 100 μL 培养液，并补充 100 μL 新鲜培养基 + 血液（2% 红细胞压积）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鉴定含有寄生虫的孔。
	<ol>
		<li>将 96 孔板倾斜约 45° 放置约 20 分钟，使血液在板内倾斜沉降。</li>
		<li>将 96 孔板置于光源板上观察。由于寄生虫酸化培养基，含寄生虫的孔中培养基呈黄色，而无寄生虫的孔中培养基为粉红色。</li>
		<li>使用移液管，将含寄生虫孔中的内容物转移至 24 孔组织培养板，以促进寄生虫血症率的扩增。</li>
		<li>按照步骤 8 所述进行 PCR 分析，检测这些克隆寄生虫株是否正确整合。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 通过葡萄糖胺处理寄生虫实现蛋白敲低并经蛋白质印迹分析验证
<ol>
	<li>配制 0.5 M 的 GlcN（葡萄糖胺）储存液，可于 -20° C 保存。</li>
	<li>将 GlcN 加入 glmS 寄生虫培养物中，并使其在 GlcN 存在条件下继续培养。 
	注意：GlcN 处理的终浓度和处理时间取决于具体实验和寄生虫品系。GlcN 可能影响寄生虫生长，因此应将亲本寄生虫株暴露于一系列不同浓度的 GlcN 中，以确定其对该化合物的敏感性。通常使用的 GlcN 浓度为 2.0–7.5 mM13,14,20。</li>
	<li>从经 GlcN 处理的寄生虫中提取蛋白样品13。</li>
	<li>使用蛋白样品进行 Western 印迹分析，以检测目标蛋白水平的降低13。
	<ol>
		<li>根据生产商说明书使用抗 HA 抗体检测 HA-glmS 标记的蛋白。将 HA 条带信号与上样对照（如 PfEF1α）进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与以往的基因操作方法相比，CRISPR/Cas9 在 P. falciparum 中的应用显著提高了基因组编辑的效率，并缩短了所需时间。本综合实验方案详细阐述了利用 CRISPR/Cas9 在 P. falciparum 中构建条件性突变体的关键步骤。尽管本方法主要针对 HA-glmS 突变体的构建，但该策略可灵活适用于多种需求，包括基因标记、基因敲除以及点突变的引入。
本方案中的一个关键早期步骤是选择gRNA序列。在选择gRNA时，需考虑多个因素，例如gRNA的位置、其编辑效率以及是否存在脱靶效应的潜在风险。gRNA序列应尽可能靠近修饰位点，理想情况下应在200个碱基对以内。这可以降低寄生虫利用修复模板修复基因组而不整合标签的可能性。本研究中用于定位gRNA的工具是一种名为CHOPCHOP的免费在线服务22。另一种可用的在线工具是真核病原体CRISPR向导RNA/DNA设计工具（EuPaGDT；http://grna.ctegd.uga.edu/）<sup class="xref...

疟疾是一种由疟原虫属原虫寄生虫引起的严重疾病 疟原虫. P. falciparum，这种对人类最致命的疟原虫每年导致约44.5万人死亡，其中大多数为五岁以下儿童1. 疟原虫 寄生虫具有复杂的生活周期，涉及蚊子媒介和脊椎动物宿主。人类最初是因受感染的蚊子吸食血液而被感染。随后，寄生虫侵入肝脏，在其中生长、发育并分裂约一周时间。此过程结束后，寄生虫被释放入血液，在红细胞（RBCs）中进行无性繁殖。寄生虫在红细胞内的增殖直接导致与疟疾相关的临床症状2.
直到最近，转基因恶性疟原虫（P. falciparum）的制备仍是一个费力的过程，需要经过多轮药物筛选，耗时数月且失败率较高。这一耗时的流程依赖于在目标区域产生随机的DNA断裂，并利用寄生虫通过同源修复机制修复其基因组的内源能力3,4,5,6。最近，成簇规律间隔短回文重复序列/Cas9（CRISPR/Cas9）基因组编辑技术已成功应用于P. falciparum7,8。这一新技术在疟疾研究中的引入，对于深入理解这些致命的疟原虫（Plasmodium）的生物学特性至关重要。CRISPR/Cas9可通过与目标基因同源的向导RNA（gRNA）实现对基因的特异性靶向。gRNA/Cas9复合物通过gRNA识别目标基因，随后Cas9引入双链断裂，从而迫使生物体启动修复机制9,10。由于P. falciparum缺乏通过非同源末端连接修复DNA断裂的分子机制，因此它依赖同源重组机制，并整合转染进入的同源DNA模板来修复由Cas9/gRNA诱导的双链断裂11,12。
在此，我们介绍一种用于生成条件性基因敲低突变体的实验方案 P. falciparum 使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术。该方案展示了该技术的应用方法 glmS 核酶用于条件性敲低 PfHsp70x（PF3D7_0831700）的蛋白水平，该蛋白是一种由疟原虫输出的分子伴侣 P. falciparum 进入宿主红细胞13,14。该 glmS 核酶通过氨基葡萄糖处理被激活（氨基葡萄糖在细胞内转化为氨基葡萄糖-6-磷酸），从而切割其关联的mRNA，导致相应蛋白质水平下降14该方案可轻松调整以使用其他条件性敲低工具，例如不稳定结构域或RNA适体。4,5,15. 本方案详细描述了包含血凝素（HA）标签的修复质粒的构建方法 glmS 核酶编码序列，其两侧为与PfHsp70x开放阅读框（ORF）及3'-非翻译区（3'-UTR）同源的序列。我们还描述了用于驱动gRNA表达的第二个质粒的构建方法。将这两种质粒与第三个表达Cas9的质粒共同转染入红细胞，用于修饰基因组 P. falciparum 寄生虫。最后，我们描述了一种基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，用于验证标签的整合。 glmS 核酶。该方案具有高度可适性，可用于任何基因的修饰或完全敲除 P. falciparum 基因，增强我们对疟原虫生物学产生新见解的能力。

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Xcell 电穿孔仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell 电穿孔仪</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>我们购买的是独立包装的产品</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>由 Akhil Vaidya 实验室赠送</td><td>Ganesan &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>TPP 细胞培养 6 孔板</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>TPP 100 mm 细胞培养皿（12 mL 板）</td><td>MIDSCI</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>TPP 细胞培养 96 孔板</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>TPP 细胞培养 24 孔板</td><td>MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0157L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3131L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Steritop 瓶顶过滤器装置</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td>可根据需要选择任意尺寸</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>pMK-U6</td><td>由 Muralidharan 实验室构建</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pHA-glmS</td><td>由 Muralidharan 实验室构建</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pUF1-Cas9</td><td>由 Jose-Juan Lopez-Rubio 实验室赠送</td><td>Ghorbal &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>次黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25g</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素试剂</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>胸苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr><td>PL6-eGFP BSD</td><td>由 Muralidharan 实验室构建</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td><td>由 Muralidharan 实验室构建</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 凝胶与 PCR 产物纯化试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td></tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N/A</td><td>建议尝试多个批次，以确定寄生虫生长最佳的批次</td></tr><tr><td>人红细胞</td><td>Interstate Blood Bank, Inc</td><td>请通过电子邮件或电话直接联系订购</td><td>通常使用 O+ 型血</td></tr><tr><td>3D7 寄生虫株系</td><td>可应要求提供</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（Lysogeny Broth）</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>可自行配制，无需严格使用此产品</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>我们配制 1000 倍浓缩液（100 mg/mL 水溶液），储存于 -20°C</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>抗 EF1alpha 抗体</td><td>Daniel Goldberg 博士实验室</td><td>华盛顿大学圣路易斯分校</td><td>可用于 Western blot 的内参抗体可根据偏好选择，此为本实验室常用抗体</td></tr><tr><td>大鼠抗 HA 单克隆抗体（克隆 3F10）</td><td>Roche 生产，Sigma 销售</td><td>11867423001</td><td>可使用您偏好的抗 HA 抗体</td></tr><tr><td>0.6 mL 离心管</td><td>Fisher</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* 手动染色系统（固定剂 + 溶液 I 和 II）</td><td>Fisher</td><td>22-122-911</td><td>也可使用吉姆萨染色</td></tr><tr><td>Fisherfines Premium 带磨砂区显微镜载玻片 - 规格：3 × 1 英寸</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

利用crispr/cas9基因编辑技术构建人类疟原虫p. falciparum的条件性突变体

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

疟疾是全球发病和死亡的重要原因。这种疾病主要影响生活在热带和亚热带地区的人群，由疟原虫（Plasmodium）寄生虫感染引起。通过加深对这种复杂寄生虫生物学特性的理解，可以加速开发更有效的抗疟药物。对这些寄生虫进行遗传操作是理解其生物学特性的关键；然而，历史上对恶性疟原虫（P. falciparum）基因组的遗传操作一直较为困难。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术已被应用于疟原虫，使得蛋白标记、条件性蛋白敲降以及基因删除等操作更加便捷。CRISPR/Cas9基因编辑已被证明是推动疟疾研究领域发展的一项强大工具。本文中，我们描述了一种在恶性疟原虫（P. falciparum）中利用CRISPR/Cas9技术构建基于glmS的条件性敲降突变体的方法。该方法具有高度可扩展性，可适用于其他类型的遗传操作，包括蛋白标记和基因敲除。

本方法所用质粒的示意图以及一个盾构突变（shield mutation）的示例见图1。为举例说明转染后如何鉴定突变寄生虫，图2展示了用于检测HA-glmS构建体整合情况的PCR结果。图3展示了一个克隆板的代表性图像，用以说明在寄生虫存在下培养基的颜色变化。图4展示了免疫荧光实验和蛋白质印迹实验的结果，用以验证HA标签的功能以及基于glmS的寄生虫蛋白水平降低效果。图5展示了PCR产物上较短的同源臂无法有效修饰寄生虫基因组并获得可存活突变体的情况。
<img alt="显示用于PfHsp70x gRNA靶向和突变的CRISP...

我们描述了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在Plasmodium falciparum中构建基于glmS的条件性基因敲低突变体的方法。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人类疟原虫P. falciparum的条件性突变体

疟疾是全球发病和死亡的重要原因。该疾病主要影响生活在热带和亚热带地区的人群……

该方法可通过条件性敲低技术揭示蛋白质功能，从而帮助解答人类疟原虫（P. Falciparum）生物学中的关键问题。该技术的主要优势在于，与以往方法相比，能够相对容易地构建条件性突变体。实验开始时，进入 Chop Chop 网站，选择“Fasta Target”选项。在“Target”下，粘贴目的基因开放阅读框（ORF）3'端的200个碱基对，以及该基因3'非翻译区（UTR）起始段的200个碱基对。在“选择 P. falciparum”下进行选择，并在“使用”下选择“CRISPR/Cas9”。接下来，点击“查找靶位点”。从提供的选项中选择一条gRNA序列，优先选择最靠近修饰位点且脱靶位点最少的高效gRNA。将选定的gRNA序列及其反向互补序列作为聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的寡核苷酸进行订购。用于靶向PfH-sp70x的gRNA序列可在文本方案中找到。向一个无菌的1.5毫升离心管中加入40微克的pMK-U6、pUF1-Cas9和pHA-glmS DNA。向管中加入相当于DNA体积十分之一的3摩尔/升乙酸钠水溶液，并用涡旋振荡器充分混匀。然后，向管中加入2.5倍体积的100%乙醇，并用涡旋振荡器充分混匀至少30秒。将离心管置于冰上或负20摄氏度环境中30分钟。随后，在4摄氏度条件下，以18,300 ×g离心30分钟。离心结束后，小心移除上清液，注意不要扰动沉淀。向离心管中加入三倍体积的70%乙醇，使用涡旋振荡器短暂混匀。在4°C条件下，以18,300 ×g离心30分钟。再次小心地移除上清液，注意不要扰动沉淀。将离心管保持敞开状态，使沉淀在空气中干燥15分钟。将沉淀的DNA储存于-20摄氏度，直至转染时使用。为转染红细胞，需按照文本方案中所述配制1X细胞素混合缓冲液（cytomix buffer）以及不完全和完全RPMI培养基。使用0.22微米滤器对缓冲液进行过滤除菌。向DNA中加入380微升1X细胞素混合液（1X cytomix），涡旋振荡以溶解。将DNA在1X细胞素混合液中溶解10分钟，每隔3分钟涡旋振荡10秒。在无菌的15毫升锥形管中，将300微升用不完全RPMI悬浮的分离人红细胞与4毫升1倍细胞素混合液（1X cytomix）混合。以870 × g离心红细胞3分钟，然后弃去红细胞沉淀上的上清液。将红细胞沉淀用DNA-cytomix混合液重悬，并转移至0.2厘米电穿孔比色皿中。根据文本方案中列出的条件对红细胞进行电穿孔。电穿孔后，将比色皿中的内容物转移至含有5毫升完全RPMI培养基的15毫升锥形管中。在20摄氏度下，以870 × g离心试管3分钟。然后，倒出上清液。接着，将沉淀重悬于4毫升完全RPMI培养基中，并转移至六孔组织培养板中的一个孔内。向已转移的红细胞中加入 400 µL 高裂殖子培养物。将所有培养物置于 37 °C、3% 氧气、3% CO2 和 94% 氮气的环境中培养。次日，用 4 mL 完全 RPMI 培养基洗涤培养物。以870 × g离心培养物3分钟。吸除上清液。用4毫升完全RPMI培养基重悬培养物。48小时后，用4毫升完全RPMI培养基洗涤培养物。然后，将培养物重悬于含有1微摩尔DSM1的完全RPMI培养基中，以筛选Cas9质粒。此后，每隔48小时用新鲜的完全RPMI培养基加1微摩尔DSM1更换培养基。每天继续用完全RPMI培养基洗涤培养物，直至血涂片中不再可见寄生虫。制备血涂片时，将150 µL培养物移入0.6 mL离心管中。在1,700 ×g条件下离心30秒使细胞沉淀后，吸除上清液。使用移液器将沉淀的细胞转移至载玻片上。用另一张载玻片以45度角紧贴第一张载玻片，将血滴推成涂片。根据生产商说明书，使用市售染色试剂盒对涂片进行染色。使用100倍油镜观察寄生虫。转染后第五天开始，取出含有重新悬浮红细胞的2毫升培养物，然后补充2毫升新鲜培养基和血细胞，使血细胞比容达到2%。以该方式每周添加一次新鲜血液，直至通过薄血涂片检测确定寄生虫重新出现。对寄生虫培养物进行连续稀释，以获得每 200 µL 含 0.5 个寄生虫的终浓度。将 200 µL 稀释后的培养物加入 96 孔组织培养板的孔中。持续培养克隆板，直至在孔中可检测到寄生虫。每48小时，用新鲜培养基更换96孔板中的培养基。从开始培养克隆板的第五天起，每周一次，从每个孔中移除100微升培养基，并补充100微升新鲜培养基和血液。为了确定哪些孔中含有寄生虫，将96孔板倾斜约45度角放置约20分钟，使血液在板内以倾斜角度沉降。随后将96孔板置于光源板上观察。可见含有寄生虫的孔中培养基呈黄色，而无寄生虫的孔中培养基为粉红色，这是由于寄生虫代谢导致培养基酸化所致。使用血清学移液管将含有寄生虫的孔中内容物转移至24孔组织培养板，以扩增寄生虫血症。通过PCR分析，检测这些克隆寄生虫株是否发生正确的整合。此处展示了免疫荧光分析的结果，证明PfH-sp70x成功进行了HA标签标记。对PfH-sp70x glmS寄生虫进行固定，并使用DAPI染色以标记细胞核，同时使用HA抗体以及针对膜相关组氨酸富集蛋白1（HRPI）的抗体，后者是蛋白质向宿主红细胞输出的标志物。此处显示的是经葡萄糖胺处理后PfH-sp70x蛋白水平的Western印迹分析结果。正如预期，随着处理时间的延长，该蛋白水平逐渐下降。该技术为寄生虫学领域的研究人员探索疟原虫生物学中的基本问题铺平了道路。需要注意的是，P. Falciparum 是一种血液传播病原体，在进行此操作时应穿戴适当的个人防护装备。

crisprcas9-gene-editing-to-make-conditional-mutants-human-malaria

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科研

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遗传学

CRISPR/Cas9 基因编辑制作人类疟疾寄生虫的条件突变体

本文详细介绍了如何利用基于全基因组测序的遗传图谱进行QTL定位，以鉴定Toxoplasma...

QTL定位与CRISPR/Cas9编辑技术用于鉴定Toxoplasma gondii中的药物抗性基因

利用CRISPR/Cas9进行靶向基因编辑极大地促进了对基因生物学功能的理解。在此，我们采用CRISPR/Cas9技术在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统在克氏锥虫（Trypanosoma...

使用 CRISPR/Cas9 系统将基因敲除直接引入克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的无鞭毛体阶段

CRISPR/Cas9 越来越多地被用于在非模式生物中鉴定基因功能。本实验方案描述了如何从制备显微注射混合物、获取并注射蚊子胚胎，到饲养、杂交和筛选注射后的蚊子及其后代以获得目标突变，从而建立致倦库蚊（Culex...

使用 CRISPR/Cas9 技术制备并注射 Culex 蚊胚胎以产生无效突变

本方案详细介绍了在白蛉中进行CRISPR/Cas9靶向诱变的步骤：胚胎收集、显微注射、昆虫饲养，以及目标突变的鉴定与筛选。...

用于CRISPR/Cas9诱变的沙蝇（Phlebotomus papatasi）胚胎显微注射

本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

该方案描述了如何在基因组中实现定点修饰 按蚊属 疟疾蚊子使用 φC31 系统。所描述的修饰包括基因组中转基因盒的整合与置换...

定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

本文详细介绍了一种利用高分辨率熔解分析对埃及伊蚊（Aedes...

利用高分辨率熔解分析在蚊子Aedes aegypti中检测CRISPR/Cas9诱变后的插入缺失

本方案描述了如何在无PAM限制的情况下进行高效的腺嘌呤碱基编辑，以利用zSpRY-ABE8e构建精确的斑马鱼疾病模型。...

利用zSpRY-ABE8e实现高效无PAM限制的碱基编辑以构建斑马鱼人类遗传病模型

化学遗传学涉及在靶位点处将看门残基替换为含有不同侧链的氨基酸。在此，我们构建了一种含有cdpk1功能低下等位基因的突变寄生虫，并鉴定了该突变背景下寄生虫所采用的补偿性通路。...

理解携带植物样激酶功能低下等位基因的突变疟原虫中补偿通路的发育

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9技术通过胚胎显微注射对蚊子A.

利用 CRISPR-Cas9 对埃及伊蚊 Aedes aegypti 进行基因组编辑

学习使用CRISPR/Cas9基因编辑技术在恶性疟原虫中构建glmS条件性敲低突变体的方法。该技术可高效调控蛋白功能，为疟疾生物学研究及抗疟治疗策略开发提供重要工具。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人类疟原虫P. falciparum的条件性突变体

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